CN112485341A - 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法 - Google Patents

一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112485341A
CN112485341A CN202011143516.3A CN202011143516A CN112485341A CN 112485341 A CN112485341 A CN 112485341A CN 202011143516 A CN202011143516 A CN 202011143516A CN 112485341 A CN112485341 A CN 112485341A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hormone
ion
sample
quantitative
internal standard
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202011143516.3A
Other languages
English (en)
Inventor
傅海军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Sumaote Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Sumaote Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Sumaote Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Sumaote Biotechnology Co ltd
Priority to CN202011143516.3A priority Critical patent/CN112485341A/zh
Publication of CN112485341A publication Critical patent/CN112485341A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：步骤一：样品前处理；步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；步骤三：定性判断和定量分析：根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中，采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。本发明与现有技术相比的优点在于：有效去除大部分的干扰物质，可以同时检测和快速提取多种激素。

Description

一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法
技术领域
本发明涉及检测血浆中激素的方法技术领域，具体是指一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法。
背景技术
目前测定激素的方法主要有生物法和化学法。生物法包括酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学发光分析(ICMA)等，化学法包括气相色谱-质谱法(GC-MS、GC-MS/MS)[和液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)。
生物法在过去被认为是测定生物样品中激素的理想方法，但是现在的研究发现生物法存在一定的缺陷。首先，激素类代谢物在结构上具有高度的相似性，因此，使用免疫测定法很难控制或排除生物基质中可能存在的结构相似物的干扰。其次，免疫检测方法是建立在抗体对抗原分子识别的基础上，而人体内激素结构相似，免疫检测技术的特异性抗体的交叉反应的专一性差，易出现假阳性结果。第三，并不是所有的目标激素代谢物都存在相应的抗血清以得到准确的免疫测定，这一点对于激素结合物的免疫测定尤为明显。最后，免疫检测一次只能分析一种被测物，因此测定一种激素的多种代谢物就需要多次测定。
近年来，质谱技术已发展成为分析内源性代谢物和药物的高通量定量方法，通过与气相色谱(GC)或高效液相色谱(HPLC)联用，可以快速准确地分离多种化合物，并且能在一定程度上完成自动化分析。色谱-质谱联用检测技术是当前的发展趋势，也是目前最为可靠的激素检测方法，同时可验证其他测定方法的准确性，并鉴定未知物质的结构等。气相色谱-质谱技术检测，要求被测组分具有挥发性、低沸点等，因此在检测前需要对样品进行衍生化，以提高激素的挥发性和热稳定性，该方法的缺点是样品处理过程繁琐，色谱分析时间较长。LC-MS/MS用于内源性激素检测通常不需要繁琐的衍生化步骤，避免了衍生化步骤中副反应或反应不完全造成的损失，同时大大减少了样品和试剂的损耗、缩短了前处理的时间。与HPLC相比，超高效液相色谱(UPLC)，运用亚二微米的小粒径填料可以增加分离度、灵敏度，同时可以得到更短的分离时间。因此，超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)在多种激素同时检测中具有较强的优势。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，有效去除大部分的干扰物质，可以同时检测和快速提取多种激素。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
优选的，步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
本发明与现有技术相比的优点在于：选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出多种激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明公开一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0002738935570000031
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；其中，目标定量母子离子对包括：雌酮286.2/253.1、雌二醇271.2/145.1、雌三醇287.2/145.1；
内标定量母子离子对包括：雌酮内标286.2/253.1、雌二醇内标275.1/147.1、雌三醇内标290.2/147.1；
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出3种激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“RAMP”范围，选择不同MRM离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
实施例2：
本发明公开一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0002738935570000041
Figure BDA0002738935570000051
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；其中，目标定量母子离子对包括：雄烯二酮287.2/96.9、睾酮279.2/97.1、双氢睾酮291.3/255.3；
内标定量母子离子对包括：雄烯二酮内标290.2/100.1、睾酮内标292.2/97.1、双氢睾酮内标294.3/258.2；
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出3种激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“RAMP”范围，选择不同MRM离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
实施例3：
本发明公开一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0002738935570000061
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；其中，目标定量母子离子对包括：地塞米松393.3/373.2；
内标定量母子离子对包括：地塞米松内标398.3.2/378.2；
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“RAMP”范围，选择不同MRM离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
实施例4：
本发明公开一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0002738935570000071
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；其中，目标定量母子离子对包括：褪黑素233.2/174.2；
内标定量母子离子对包括：褪黑素内标237.2/178.2；
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“RAMP”范围，选择不同MRM离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
实施例5：
本发明公开一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0002738935570000091
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；其中，目标定量母子离子对包括：醛固酮359.3/189.2、11-脱氧皮质酮347.1/96.821-、脱氧皮质酮347.1/120.8；
内标定量母子离子对包括：醛固酮内标367.3/194.2、11-脱氧皮质酮内标352.1/99.9、21-、脱氧皮质酮内标355.3/319.3；
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出3种激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“RAMP”范围，选择不同MRM离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
实施例6：
本发明公开一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0002738935570000101
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；其中，目标定量母子离子对包括：孕烯醇酮299.3/159.1、孕酮315.1/108.817、羟基孕酮331.1/108.9；
内标定量母子离子对包括：孕烯醇酮内标303.2/159.1、孕酮内标324.2/100.117、羟基孕酮内标339.3/100.1；
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出3种激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“RAMP”范围，选择不同MRM离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (2)

1.一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；
其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；
步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mm x 2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mM NH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(Collision Energy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，其特征在于：步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。
CN202011143516.3A 2020-10-23 2020-10-23 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法 Withdrawn CN112485341A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011143516.3A CN112485341A (zh) 2020-10-23 2020-10-23 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011143516.3A CN112485341A (zh) 2020-10-23 2020-10-23 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112485341A true CN112485341A (zh) 2021-03-12

Family

ID=74926166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011143516.3A Withdrawn CN112485341A (zh) 2020-10-23 2020-10-23 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112485341A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113125597A (zh) * 2021-04-08 2021-07-16 广州金域医学检验中心有限公司 一种17-羟基孕酮和雄烯二酮的检测方法
WO2022193697A1 (zh) * 2021-03-18 2022-09-22 裕菁科技(上海)有限公司 一种用于定量样品中目标分析物的天然同位素校准曲线法
CN115236211A (zh) * 2021-04-22 2022-10-25 中国医科大学附属第一医院 一种液相色谱串联质谱法检测血液中褪黑素水平的方法及应用
CN115902039A (zh) * 2022-12-28 2023-04-04 大连博源医学科技有限公司 一种检测血浆中褪黑素浓度的方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022193697A1 (zh) * 2021-03-18 2022-09-22 裕菁科技(上海)有限公司 一种用于定量样品中目标分析物的天然同位素校准曲线法
CN113125597A (zh) * 2021-04-08 2021-07-16 广州金域医学检验中心有限公司 一种17-羟基孕酮和雄烯二酮的检测方法
CN113125597B (zh) * 2021-04-08 2023-04-07 广州金域医学检验中心有限公司 一种17-羟基孕酮和雄烯二酮的检测方法
CN115236211A (zh) * 2021-04-22 2022-10-25 中国医科大学附属第一医院 一种液相色谱串联质谱法检测血液中褪黑素水平的方法及应用
CN115902039A (zh) * 2022-12-28 2023-04-04 大连博源医学科技有限公司 一种检测血浆中褪黑素浓度的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112485341A (zh) 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法
US8470602B2 (en) Methods and systems for determining the presence or amount of delta 5 steroid compounds in a sample
CN112485342A (zh) 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中水溶性和脂溶性维生素的方法
JP2018077233A (ja) 質量分析によるインスリンの定量
CA3045022C (en) Mass spectrometry assay method for detection and quantitation of kidney function metabolites
CN111721854A (zh) 一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法
CN104215716B (zh) 一种检测人血清中总睾酮的方法
CN105675788A (zh) 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法及试剂盒
CN112136043B (zh) 用于检测和定量肝功能代谢产物的质谱测定方法
US11536733B2 (en) Methods and systems for the detection of 11-oxo androgens by LC-MS/MS
US20230333069A1 (en) Evaporation-based sample preparation workflow for mass spectrometry
CN114674961A (zh) 一种非衍生化同步检测血清中17种类固醇激素的试剂盒及其应用
CN112986433A (zh) 检测人血清样本中类固醇含量的方法
CN115963199A (zh) 一种人/动物体液中类固醇激素的定量检测方法和应用
CN112014509A (zh) 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法
WO2014152502A1 (en) Method for determining derivatized analytes in a separated biological fluid
AU2020282288A1 (en) Mass spectrometry assay methods for detection of metabolites
US6808933B1 (en) Methods of enhancing confidence in assays for analytes
CN115808493A (zh) 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法
CN113009036A (zh) 一种检测性激素的试剂盒、性激素样品前处理方法及同时检测多种性激素的方法
CN111595978B (zh) 一种血浆中度他雄胺浓度的检测方法
CN103293268A (zh) 一种人尿氢化可的松的检测方法
CN105699575A (zh) 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒
CN109324139A (zh) 一种烟叶中玉米素核苷液液萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法
Alves et al. Analytical performance of LC-MS/MS method for simultaneous determination of five steroids in serum

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210312