CN104215716B

CN104215716B - 一种检测人血清中总睾酮的方法

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Publication number: CN104215716B
Application number: CN201410484568.5A
Authority: CN
Inventors: 何翠红; 赵蓓蓓; 程雅婷; 李卓阳; 佘旭辉; 董衡; 李维; 刘伟霞; 梁晓翠
Original assignee: SHENYANG JINYU MEDICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: SHENYANG JINYU MEDICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2014-09-19
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-09-19
Also published as: CN104215716A

Abstract

本发明公开了一种检测人血清中总睾酮的方法，该方法包括如下步骤：向含有人血清样品的试管中加入含睾酮内标物的内标液，混匀后加入甲基叔丁基醚进行蛋白沉淀并萃取待测物；离心后置于-65～-80℃条件下放置1-2h，接着转移上清液至另一试管中进行干燥，然后加入复溶剂，得到待测样品；对待测样品用高通量的液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；以睾酮的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比为定性依据，采用内标标准曲线法定量。本发明采用高通量的液相色谱串联质谱仪对人血清中的睾酮进行检测，检测时间短，通量高，灵敏度好，精密度高。

Description

一种检测人血清中总睾酮的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种高通量液相色谱串联质谱法检测人血清中总睾酮的方法。

背景技术

睾酮是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量；但绝经后妇女，卵巢分泌睾酮显著减少。在男性中，它对外生殖器和第二性征的发育起着重要作用，其生物化学过程尚未完全阐明。女性中，其主要作用是作为一种雌激素的前体。同时，睾酮可能影响许多身体系统和功能，包括：血生成，体内钙平衡，骨矿化作用，脂代谢，糖代谢和前列腺增长。

大多数睾酮与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，在男性中也被称为睾丸激素结合球蛋白；少数与白蛋白结合，一小部分以游离形式存在。游离睾酮被认为是生物活性成分。然而，睾酮与白蛋白结合较弱，所以所有非SHBG结合的睾酮被认为是生物可利用的。

在儿童期，过多睾酮会诱发男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，过量的睾酮会造成不同程度的男性化，包括多毛，痤疮，月经稀发，或不育。睾酮轻度至中度升高对男性通常无明显症状，但对女性造成严重的影响。对于睾酮轻度至中度升高的确切原因往往不清楚。明显升高的常见原因包括遗传疾病(如先天性肾上腺皮质增生症)，肾上腺，睾丸和卵巢的肿瘤和运动员滥用睾丸激素或促性腺激素通。女性的睾酮降低会引起微妙的症状，这主要包括性欲下降和非特异性的情绪变化。在男性，它会导致性腺功能减退，这个特点将改变男性的第二性征和生育功能。

传统的睾酮检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析法(RIA)、化学发光免疫检测(CLISA)、自动化免疫分析系统、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法等，现有的睾酮检测方法，主要存在如下问题：第一、由于睾酮在人体内主要与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存在严重的基质干扰。而传统的免疫法，不能有效祛除基质干扰；第二，免疫学检测方法是建立在抗体对抗原分子识别的基础上，由于人体内存在大量的与睾酮结构相似的化合物，所以该检测技术的特异性差，易导致假阳性的出现，尤其是在睾酮浓度水平较低的情况下，传统的免疫方法无法准确测定；第三，高效液相色谱法和气相色谱-质谱法，前处理复杂，分析时间长，灵敏度低；第四，现有的高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱-质谱法整个检测过程时间长、检测通量低。

因此，需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够提供一种适用于人血清中总睾酮的检测方法，前处理简单，能有效祛除基质干扰，可以准确定量极低浓度(<100ng/dL)的睾酮，并且整个检测过程时间短、通量高。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题是提供一种适用于人血清总睾酮的高通量的检测方法，该方法灵敏度低，能够准确定量极低浓度(<100ng/dL)的睾酮，能够有效去除基质干扰，快速检测，通量高。

为了解决上述问题，本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱法检测人血清中总睾酮的方法，具体的技术方案如下：

一种高通量液相色谱串联质谱法检测人血清中总睾酮的方法，包括如下步骤：

(1)前处理

向人血清样品的试管中加入含睾酮内标物的内标液，混匀后加入甲基叔丁基醚进行蛋白沉淀并萃取睾酮，然后离心后置于-65～-75℃条件下放置1-2h，接着转移上清液并进行干燥，然后加入复溶剂，得到待测样品；

其中，所述睾酮内标物为睾酮的碳代标记物或氘代标记物；所述内标液与人血清样品的体积比为1:10～1:4；所述人血清样品、甲基叔丁基醚及复溶剂的体积比为2:8:1～2:15:1；

(2)检测

对所述待测样品采用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；

其中色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；柱温为48-52℃；流动相为甲醇和水，流速为0.5-1ml/min，采用梯度洗脱：起始流动相甲醇:水的体积比为35:65，待测物出峰时流动相甲醇:水的体积比为60:40，而后再回到起始流动相甲醇:水的体积比为35:65，并保持1～2min，整个梯度的时间为3～8min；

质谱条件为：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM；

目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的条件为：睾酮母离子的质/荷比为289.2～290.2，对应的子离子的质/荷比为97.1～98.1。

在其中一个实施例中，内标的定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的条件为：内标母离子的质/荷比为290.2～296.2，对应的子离子的质/荷比为110.1～116.1。

在其中一个实施例中，所述质谱条件还包括：睾酮定量离子对的去簇电压为110v，入口电压为10v，碰撞电压为32v，出口电压为20v；睾酮内标的定量离子对的去簇电压为100v，入口电压为10v，碰撞电压为34v，出口电压为12v。

在其中一个实施例中，所述质谱条件的离子源参数包括：电离源为电喷雾电离ESI源；气帘气压力为15psi；加热气压力为50psi；辅助加热气压力为50psi；加热气温度为400℃；碰撞气为高纯氮气，压力为8psi；电喷雾针电压为4000V。

在其中一个实施例中，所述高通量液相色谱串联质谱仪包括两套高通量液相色谱系统，所述两套高通量液相色谱系统的液相色谱条件一样；第一套液相采集窗口为2.0min-3.0min；第二套液相采集窗口为2.0min-3.0min。较佳地在此系统上，5min可以检测两个样品。

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述离心的条件包括：以8000-10000r/min的速度离心4.5-5.5min。

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述干燥的条件为通50℃的氮气直至干燥。

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述复溶剂为体积比为50:50-10:90的甲醇和水的混合物。

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述内标液为含睾酮内标物的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为50:50-10:90。

在其中一个实施例中，该检测方法还包括如下步骤：定性判断和定量计算，

依据睾酮、睾酮内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断睾酮的存在；

依据睾酮与对应睾酮内标物在内标标准曲线上的峰面积比值，计算人血清样品中的睾酮的含量。

与背景技术相比，本发明具有以下优点：

本发明采用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，与现有技术相比，本发明实施例可以实现5min检测2个样品，单个样品的检测时间平均为2.5min，与现有的液相色谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱法等相比，检测时间短、检测通量高；

本发明检测方法的定量限为0.94ng/dL，精密度RSD小于10％，可以准确的定性或定量检测出人血清中极低浓度(<100ng/dL)的睾酮含量，与传统的免疫法检测相比，检测灵敏度高、精密度高。

本发明通过液液萃取，吹干、复溶后便可以用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，与其他方法相比，前处理简单，检测通量高，并且可以有效去除基质干扰，方法特异性、抗干扰能力强。

由以上可知采用本发明的检测方法进行检测，检测时间短，通量高，灵敏度高，精密度高。

附图说明

图1为本发明检测流程图；

图2为实际样本中睾酮及其内标物的TIC图；

图3为内标标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

参见图1，示出了本发明实施例的一种睾酮的高通量检测方法实施例的步骤流程图，具体可以包括如下步骤：

步骤101，前处理；

向人血清样品加入含有睾酮内标物的乙腈-水溶液，混匀后加入甲基叔丁基醚进行蛋白沉淀并萃取待测物；离心后置于-70℃条件下放置1h，接着转移上清液并进行干燥，然后加入复溶剂，得到待测样品；

其中，所述人血清样品、甲基叔丁基醚及复溶剂的体积比为2:8:1～2:15:1(优选为2：10：1)；所述乙腈-水溶液与人血清样品的体积比为1:10～1:4(优选为1:4)；所述睾酮内标物为¹³C_3-睾酮。

可以理解，步骤101是对人血清样品的前处理，以富集人血清样品中的睾酮。血清中的睾酮存在形式有：游离的，与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，少数与白蛋白结合。本发明实施例的前处理步骤中，样品经过蛋白质沉淀释放出睾酮同时萃取睾酮，通过加入甲基叔丁基醚可以从人血清样品中去除蛋白质，并萃取出睾酮，留在上清液中为睾酮和其它可溶物。

乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比可为50:50-10:90，优选为30:70。

对加入甲基叔丁基醚后的溶液的离心的条件可以包括：在室温下，以10000r/min的速度离心4.5-5.5min。

上清液的干燥条件可以包括：通50℃的氮气直至干燥。

复溶剂可以为甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和水的体积比可以为50:50-10:90，优选为35:65。

步骤102，检测；

对所述待测样品用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；

所述检测采用正离子模式，扫描方式采用多反应检测离子扫描MRM；

MRM：MultiReactionMonitor，指多反应监测离子扫描。

其中，目标定量离子对包括睾酮定量离子对，目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的条件可以包括：睾酮母离子的质/荷比为289.2～290.2，对应的子离子的质/荷比为97.1～98.1。

内标定量离子对包括¹³C_3-睾酮定量离子对，内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的条件为：¹³C_3-睾酮母离子的质/荷比为292.2～293.2，对应的子离子的质/荷比为112.1～113.1；

其中，所述液相色谱采用梯度模式洗脱，液相色谱条件包括：

色谱柱：3.5um2.1mm×50C18

色谱柱柱温：50℃；

进样量：50ul；

流速：0.5ml/min；

流动相：甲醇以及水；

梯度洗脱的条件如下：

时间(min)	A相(甲醇)比例(％)	B相(水)比例(％)
			0.0	35	65
0.5	35	65
			1.0	60	40
3.5	60	40
			3.6	100	0
4.0	100	0
			4.1	35	65
5.0	35	65

采用上述流动相，在梯度洗脱中，睾酮的保留时间为2.64min。

在本发明实施例的一个优选示例中，内标定量离子为¹³C_3-睾酮定量离子对，内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的条件包括：

¹³C_3-睾酮母离子的质/荷比为292.20，对应的子离子的质/荷比为112.10。

在本发明实施例的一个优选示例中，多反应监测离子扫描MRM的条件还包括：

在本发明实施例的一个优选示例中，高通量液相色谱串联质谱仪可以包括两套高通量液相色谱系统，所述两套高通量液相色谱系统的液相色谱条件一样；第一套液相采集窗口为2.0min-3.0min；第二套液相采集窗口为2.0min-3.0min。

在本发明实施例的一个优选示例中，质谱离子源参数包括：

电离源：电喷雾电离ESI源；

气帘气CUR：15psi；

加热气Gs1:50psi；

辅助加热气Gs2：50psi；

加热气温度：400℃；

碰撞气：高纯氮气，8psi；

电喷雾针电压：4000V。

步骤103，定性判断和定量计算。

依据睾酮、内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断睾酮的存在；

用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定，在相同试验条件下，样品中被测目标物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致；样品色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过预设规定范围，则可以判断样品中存在对应的目标物质。

采用内标标准曲线法定量，以睾酮与内标物的峰面积比值计算样品中的睾酮的含量。

以下提供一个例子来说明本发明用于睾酮的检测方法的具体实现过程。

将200ul人血清倒入到洁净的离心管中，加入50ul含有30μg/L内标物(¹³C_3-睾酮)的乙腈-水溶液(乙腈与水的体积比为30:70)，漩涡混匀30s后，加入1000ul甲基叔丁基醚进行蛋白沉淀和液液萃取，漩涡混匀60s后，于离心机10000r/min离心分离5min，-70℃中放置1h，上清液全部转移至洁净的离心管内，在50℃条件下氮气吹干，最后用100ul复溶剂(35v/v％甲醇-水溶液)复溶，漩涡混匀后，转移至样品瓶中，加载至液相色谱自动进样器中。

液相色谱自动进样器自动将样品加载到液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS)。LC-MS/MS采用具有电喷雾电离源(ESI)的AppliedBiochemistryAPI4000plus串联质谱分析仪作为检测器进行分析。其中，气帘气CUR为15psi，加热气Gs1为50psi，辅助加热气Gs2为50psi，加热气温度为400℃，碰撞气为8psi的高纯氮气，电喷雾针电压为4000V。采用反应检测离子扫描MRM扫描，其条件参见表1。

表1.反应检测离子扫描MRM条件

自动进样器自动将50ul预先净化好的样品加载到S1和S2高通量液相色谱系统中，液相色谱条件S1与S2为相同，液相色谱条件参见表格2。第一套液相采集窗口为2.0min-3.0min；第二套液相采集窗口为2.0min-3.0min。色谱柱采用XBridge3.5um2.1mm×50C18色谱柱，流动相A为色谱纯甲醇，流动相B为超纯水。其中，色谱柱柱温为50℃，流速为0.5ml/min。

表2.液相色谱条件

步骤	分析时间(min)	流速(μL/min)	流动相A％	流动相B％
					1	0.0	500	35.0	65.0
2	0.5	500	35.0	65.0
					3	1.0	500	60.0	40.0
4	3.5	500	60.0	40.0
					5	3.6	500	100.0	0.0
6	4.0	500	100.0	0.0
					7	4.1	500	35.0	65.0
8	5.0	500	35.0	65.0

样品随流动相排出色谱柱出口后，在压力的作用下进入质谱仪离子源或废液，由六通阀控制进入离子源的样品通道，和进入切换时间。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子，带电分子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3为质量过滤器，只允许根据睾酮和¹³C_3-睾酮的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞单元，母离子在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。

质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有睾酮和¹³C_3-睾酮的特定质荷比m/z的离子，具有这些m/z比的离子被允许进入Q2，Q2产生的碎片离子进入到Q3，其中睾酮和¹³C_3-睾酮的碎片离子被选择通过，而其它离子被除去。参见表3，示出了被用于鉴别和定量的睾酮。

表3.睾酮的质量转变表

被分析物	Q1母离子(m/z)	Q3子离子(m/z)
			睾酮	289.2	97.1
¹³C_3-睾酮	292.2	112.1

随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得质量层析谱图(如图2所示)。

血清标准物中分析物和内标的峰面积的比值被用于构建内标标准曲线，标准曲线见图3，曲线的方程Y＝0.00187X+0.000471，R＝1.0000，然后该曲线被用于计算样品或质量控制物中分析物浓度。

方法学验证的数据如下：

一、准确度

选取5个浓度水平的室间质评样本，按照实施例方式进行单次分析，检测结果如下表4，由结果可知按照本实施例方式所得检测结果均在室间质评样的结果可接受范围内，结果准确。

表4.睾酮准确度检测表

二、分析精密度：批内精密度和批间精密度

选取高、中、低三个不同水平的人血清样本，每个水平的样本单批次平行测定20次，按照实施例的方法进行检测后，计算检测结果的批内精密度。

选取高、中、低三个不同水平的人血清样本，每个水平的样本单批次平行测定2次，不连续测定7天，按照实施例的方法进行检测后，计算检测结果的批间精密度。检测结果如表5，由检测结果可知，检测精密度<5％。

表5.睾酮精密度检测表

三、检测灵敏度-定量限(LOQ)

空白血清分别加标后作为标准曲线点，每条曲线分别检测7次，计算每个曲线点的平均值、回收率和变异系数，恰好满足回收率85-115％，CV小于20％的点会LOQ点。由检测结果表6可知，按照实施例的方案得到的LOQ为0.94ng/dL。

表6.睾酮定量限检测表

由上述的检测结果显示该方法检测质控物质结果准确，定量限为0.94ng/dL，精密度RSD<5％，检测时间平均为2.5min，检测效率高。说明本方法准确可靠，精密度高、灵敏度高、检测通量高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)前处理

其中，所述睾酮内标物为睾酮的碳代标记物；所述内标液与人血清样品的体积比为1:10～1:4；所述人血清样品、甲基叔丁基醚及复溶剂的体积比为2:8:1～2:15:1；

(2)检测

质谱条件为：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM；睾酮定量离子对的去簇电压为110v，入口电压为10v，碰撞电压为32v，出口电压为20v；睾酮内标的定量离子对的去簇电压为100v，入口电压为10v，碰撞电压为34v，出口电压为12v；

离子源参数包括：电离源的电喷雾电离ESI源；气帘气压力为15psi；加热气压力为50psi；辅助加热气压力为50psi；加热气温度为400℃；碰撞气为高纯度氮气，压力为8psi；电喷雾针电压为4000v；

2.根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，内标的定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的条件为：内标母离子的质/荷比为290.2～296.2，对应的子离子的质/荷比为110.1～116.1。

3.根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，所述高通量液相色谱串联质谱仪包括两套高通量液相色谱系统，所述两套高通量液相色谱系统的液相色谱条件一样；第一套液相采集窗口为2.0min-3.0min；第二套液相采集窗口为2.0min-3.0min。

4.根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤(1)中所述离心的条件包括：以8000-10000r/min的速度离心4.5-5.5min。

5.根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤(1)中所述干燥的条件为通50℃的氮气直至干燥。

6.根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤(1)中所述复溶剂为体积比为50:50-10:90的甲醇和水的混合物。

7.根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤(1)中所述内标液为含睾酮内标物的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为50:50-10:90。

8.根据权利要求1-7任一项所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，该检测方法还包括如下步骤：定性判断和定量计算，依据睾酮、睾酮内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断睾酮的存在；依据睾酮与对应睾酮内标物在内标标准曲线上的峰面积比值，计算人血清样品中的睾酮的含量。