JP2020112562A - 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 - Google Patents
質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020112562A JP2020112562A JP2020037829A JP2020037829A JP2020112562A JP 2020112562 A JP2020112562 A JP 2020112562A JP 2020037829 A JP2020037829 A JP 2020037829A JP 2020037829 A JP2020037829 A JP 2020037829A JP 2020112562 A JP2020112562 A JP 2020112562A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- estradiol
- ions
- mass
- ion
- test sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
- G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
- H01J49/0031—Step by step routines describing the use of the apparatus
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/004—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/02—Details
- H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
- H01J49/0431—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components for liquid samples
Abstract
Description
オールを質量分析によって検出するための方法に関する。
、本発明の先行技術を記載または構成すると認めるものではない。
トリエン−3,17−ジオール,(17−β)]またはE2は、272.38ダルトンの
分子量を有するC18ステロイドホルモンである。これは「女性(雌性)」ホルモン(ま
たは男性(雄性)に存在する)として表される性ホルモンであって、エストロン(E1)
およびエストリオール(E3)を含む内因性ステロイドの群のうち最も強力なエストロゲ
ンである。女性では、主に卵巣がエストラジオールを産生し、これには副腎による二次産
物および脂肪組織でのステロイド前駆体のエストロゲンへの変換を伴う。エストラジオー
ルは、乳房および生殖上皮の増殖、ならびに二次的な性的特徴の発達を担う。正常なレベ
ルのエストラジオールは、適切な排卵、受胎および妊娠をもたらし、加えて、女性での健
常な骨構造の促進、およびコレステロールレベルの調節をもたらす。男性では、精巣およ
び副腎が、エストラジオールの主な供給源である。エストラジオールはホルモンバランス
および他の腺の機能に必要である。
る。例えば、非特許文献1;非特許文献2;および非特許文献3は、液体クロマトグラフ
ィーおよび質量分析を用いて種々のエストラジオールイオンを検出するための方法を開示
する。これらの方法は、質量分析による検出の前にエストラジオールを誘導体化する。液
体クロマトグラフィー/質量分析によって、誘導体化されていないエストラジオールを検
出するための方法は、非特許文献4;非特許文献5;および非特許文献6に開示される。
ガスクロマトグラフィー/質量分析によってエストラジオールを検出するための方法は、
非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;および
非特許文献12に開示されている。
量を検出するための方法を提供する。
る。この方法は以下を含むことができる:(a)試験サンプル中のエストラジオールを液
体クロマトグラフィーによって精製する工程と;(b)この試験サンプル中のエストラジ
オールをイオン化する工程と;(c)このエストラジオールイオン(単数または複数)の
量を質量分析によって検出する工程、およびこの検出されたエストラジオールイオン(単
数または複数)の量をこの試験サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付ける工
程。この局面の特定の好ましい実施形態では、この方法の定量の限界は、80pg/mL
以下であり;かつ好ましくは、エストラジオールは、質量分析前には誘導体化されない。
いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、エストラジオールの1つ以上の前駆イオ
ンを生成する工程を含み、ここではこの前駆イオンの少なくとも1つが271.14±0
.5または255.07±0.5の質量/電荷比を有する。関連の好ましい実施形態では
、この方法は、エストラジオール前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程を含
み、ここではこの断片イオンの少なくとも1つが183.10±0.5、159.20±
0.5、145.10±0.5、または133.20±0.5の質量/電荷比を有し;好
ましくは1つ以上の断片イオンは、183.10±0.5および133.20±0.5の
質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される。この局面の特定の好ましい実施
形態では、この試験サンプルは体液である。いくつかの好ましい実施形態では、この方法
は、試験サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離のエストラジオールに対して十分
な量の試薬をこの試験サンプルに添加する工程を含み得る。関連の好ましい実施形態では
、この方法は、試験サンプルを酸性化する工程;好ましくはイオン化の前に酸性化する工
程;さらに好ましくは、精製の前に酸性化する工程;好ましくはギ酸を用いて酸性化する
工程を含み得る。異なる好ましい実施形態では、この方法は、試験サンプル中に存在し得
るタンパク質由来の遊離のエストラジオールに対して十分な量の塩をこの試験サンプルに
添加する工程と;好ましくはイオン化の前に添加する工程;さらに好ましくは精製の前に
添加する工程;好ましくは硫酸アンモニウムを添加する工程を含み得る。特に好ましい実
施形態では、100mMの硫酸アンモニウムを試験サンプルに対して、この試験サンプル
中での硫酸アンモニウムの最終濃度が約57mMに添加する。
:a、an)」および「この、その(定冠詞:the)」は複数の言及を包含する。従っ
て、例えば、「タンパク質」という言及は、複数のタンパク質分子を包含する。
分析物(単数または複数)以外のサンプル由来の全ての物質を除去することを言うのでは
ない。そうではなく、精製とは、目的の分析物の検出を妨害し得るサンプル中の他の成分
に対して目的の1つ以上の分析物の量を富化する手順を指す。サンプルは本明細書では、
1つ以上の妨害物質、例えば、選択されたエストラジオールの親イオンまたは娘イオンを
質量分析によって検出することを妨げるであろう1つ以上の物質の除去を可能にする種々
の手段によって精製される。
み得る任意のサンプルを指す。本明細書において用いる場合、「体液」という用語は、個
体の体液から単離され得る任意の液体を意味する。例えば、「体液」は、血液、血漿、血
清、胆汁、唾液、尿、涙、汗などを包含し得る。
規な分子を形成することを意味する。誘導体化剤としては、イソチオシアナート基、ジニ
トロ−フルオロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基、および/またはフタルアル
デヒド基などを挙げることができる。
によって担持される化学的な混合物が、静止的な液相または固相の周囲または上を流れる
につれて、その化学物質の示差的な分布の結果として成分に分けられるプロセスを指す。
は、微細に分けられた物質のカラムを通じて、またはキャピラリーの通路を通じて液体が
均一に浸透するような液体溶液の1つ以上の成分の選択的な遅延のプロセスを意味する。
この遅延の結果、固定相(単数または複数)に対してこの液体が動くにつれて、1つ以上
の固定相とバルクの液体(すなわち、移動相)との間で混合物の成分の分布が生じる。「
液体クロマトグラフィー」の例としては、逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)、高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)および高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC
)が挙げられる。
いう用語は、液体クロマトグラフィーであって、分離の程度が固定相、典型的には濃密に
充填されたカラムを通じて圧力下で移動相を強制することによって増大される液体クロマ
トグラフィーを指す。
という用語は、分離を行うための基礎としてカラム充填を通じてアッセイされている物質
の乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を指す。HTLCは質量分析による分析の前
に2つの不特定の薬物を含むサンプルの調製に適用されている。例えば、Zimmer
et al.,J.Chromatogr.A 854:23〜35(1999)を参照
のこと;また、さらにHTLCを説明している、米国特許第5,968,367号、同第
5,919,368号、同第5,795,469号、および同第5,772,874号も
参照のこと。当業者は、「乱流」を理解する。液体がゆっくりかつスムーズに流れる場合
、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、HPLCカラムを通じて移動する低い流速の
流れは層流である。層流では、液体の粒子の動きは、粒子が一般には直線で動くにつれて
古くなっている。速い流速では、水の慣性は、液体の摩擦力および乱流の結果を上回る。
不規則な境界と接触していない液体は、摩擦によって遅くなるかまたは不均一な表面によ
って偏向される境界を「追い越す(outruns)」。液体が乱れて流される場合、そ
の液体は渦巻き(eddics)および渦(whirls)(または渦形(vortic
es))で流れ、ここではその流れが層流である場合よりも「のろのろ進む(drag)
」。液体の流れが層流または乱流であるときを決定するのに役立つ多くの参考文献が利用
可能である(例えば、Turbulent Flow Analysis:Measur
ement and Prediction,P.S. Bernard & J.M.
Wallace,John Wiley & Sons,Inc.,(2000);A
n Introduction to Turbulent Flow,Jean Ma
thieu & Julian Scott,Cambridge Universit
y Press(2001))。
は、クロマトグラフィーであって、サンプル混合物が気化されて、液体または粒子状固体
からなる固定相を含むカラムを通じて移動する搬送ガス(窒素またはヘリウムとして)の
流れに注入され、その固定相の化合物の親和性に従ってその成分の化合物に分けられるク
ロマトグラフィーを指す。
lumn)」または「抽出カラム(extraction column)」という用語
は、約35μmより大きい平均粒子直径を含むクロマトグラフィーカラムを指す。この文
脈において用いる場合、「約」という用語は±10%を意味する。好ましい実施形態では
、このカラムは、約60μmの直径の粒子を含む。
」という用語は、分析物の存在または量の決定を可能にするのに十分な、そのカラムから
溶出するサンプル中の物質の分離を果たすために十分なクロマトグラフィープレートを有
しているクロマトグラフィーカラムを指す。このようなカラムは「抽出カラム」と区別さ
れる場合が多く、これは、さらなる分析のために精製されたサンプルを得るために、保持
されていない物質から保持された物質を分離または抽出するという一般的な目的を有する
。この文脈で用いる場合、「約」という用語は±10%を意味する。好ましい実施形態で
は、この分析的カラムは、約4μmの直径の粒子を含む。
えば、「オンラインの自動的方式(on−line automated fashio
n)」または「オンライン抽出(on−line extraction)」で用いる場
合、操作者の介入が必要なしで行われる手順を指す。対照的に、「オフライン」という用
語は、本明細書において用いる場合、操作者の手動による介入を要する手順を指す。従っ
て、サンプルを沈殿させ、次に上清を手動でオートサンプラーにロードする場合、その沈
殿およびローディングの工程は、その後の工程からオフラインである。この方法の種々の
実施形態では、1つ以上の工程をオンラインの自動的な方式で行ってもよい。
よって化合物を特定するための分析技術を指す。MSとは、イオンの質量対電荷比、すな
わち「m/z」に基づいてイオンをフィルタリング、検出および測定する方法を指す。M
S技術は一般には(1)化合物をイオン化して荷電された化合物を形成する工程;および
(2)荷電された化合物の分子量を検出して質量対電荷比(m/z)を算出する工程を含
む。この化合物は、任意の適切な手段によってイオン化および検出され得る。「質量分析
計」は一般には、イオン化装置およびイオン検出器を備える。一般には、目的の1つ以上
の分子をイオン化し、そのイオンを引き続き、質量分析法の装置に導入し、ここで、磁場
および電場の組み合わせに起因して、イオンは質量(「m」)および荷電(「z」)に依
存する空間中の経路をたどる。例えば、「Mass Spectrometry Fro
m Surfaces」と題された米国特許第6,204,500号、「Methods
and Apparatus for Tandem Mass Spectrome
try」と題された同第6,107,623号、「DNA Diagnostics B
ased On Mass Spectrometry」と題された同第6,268,1
44号、「Surface−Enhanced Photolabile Attach
ment And Release For Desorption And Dete
ction Of Analytes」と題された同第6,124,137号、Wrig
ht et al.,Prostate Cancer and Prostatic
Diseases 2:264〜76(1999);ならびにMerchantおよびW
einberger,Electrophoresis 21:1164〜67(200
0)を参照のこと。
オンが生成され検出される質量分析法を指す。本明細書において用いる場合、「正のイオ
ンモードで作動する」という用語は、正のイオンが生成され検出される質量分析法を指す
。
onizing)」という用語は1つ以上の電子単位に等しい正味の電荷を有している分
析物イオンを生成するプロセスを指す。負のイオンとは、1つ以上の電子単位の正味の負
の電荷を有しているイオンであるが、正のイオンとは、1つ以上の電子単位の正味の正の
電荷を有しているイオンである。
たは蒸気相中の目的の分析物が電子の流れと相互作用する方法を指す。分析物との電子の
衝突は分析物イオンを生じ、これが次に質量分析技術に供され得る。
ガス(例えば、アンモニア)が電子衝突に供され、分析物イオンが試薬ガスイオンおよび
分析物分子の相互作用によって形成される方法を指す。
ネルギー原子のビーム(しばしばXeまたはAr)が不揮発性サンプルに衝突し、サンプ
ル中に含まれる分子を脱着およびイオン化する方法を指す。試験サンプルを、グリセロー
ル、チオグリセロール、m−ニトロベンジルアルコール、18−クラウン−6クラウンエ
ーテル、2−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン、およ
びトリエタノールアミンなどの粘性の液体マトリックスに溶解する。化合物またはサンプ
ルについて適切なマトリックスの選択は経験的なプロセスである。
ALDI」という用語は、不揮発性のサンプルがレーザー照射に曝され、レーザー照射が
サンプル中の分析物を、光イオン化、プロトン化、脱プロトンおよびクラスター崩壊を含
む種々のイオン化経路によって脱着およびイオン化する方法を指す。MALDIについて
は、サンプルをエネルギー吸着マトリックスと混合して、これによって分析物分子の脱着
を容易にする。
」という用語は、不揮発性サンプルがレーザー照射に曝され、レーザー照射がサンプル中
の分析物を、光イオン化、プロトン化、脱プロトンおよびクラスター崩壊を含む種々のイ
オン化経路によって脱着およびイオン化するという別の方法を指す。SELDIについて
は、サンプルは典型的には目的の1つ以上の分析物を優先的に保持する表面に結合される
。MALDIにおいては、このプロセスはエネルギー吸着物質を使用してイオン化を容易
にしてもよい。
う用語は、溶液が短い長さの毛細管にそって通され、その終わりに高い正または負の電圧
が印加される方法を指す。この管の終わりに達する溶液は、溶媒蒸気中の溶液の極めて小
さい液滴のジェットまたはスプレー中に気化(噴霧)される。この液滴のミストは蒸発室
(エバポレーション・チャンバ)を通って流れ、この蒸発室は、縮合を妨げかつ溶媒を蒸
発させるためにわずかに加熱される。この液滴は小さくなるので、電気的表面電荷密度は
、同様の電荷の間の自然な反発がイオンおよび放出されるべき中性の分子を生じる時点ま
で増大する。
は、ESIと同様の質量分析方法を指す;しかし、APCIは、大気圧でプラズマ内に生
じるイオン−分子反応によって、イオンを生じる。このプラズマはスプレーの毛細管と対
極との間の電荷によって維持される。次いで、イオンは典型的には、1セットの示差的に
ポンピングされたスキマー・ステージの使用によって質量分析器の中に抽出される。乾燥
および予備加熱されたN2ガスの逆流を用いて、溶媒の除去を改善してもよい。APCI
中の気相イオン化は、極性の低い種を分析するためにはESIよりも有効であり得る。
、質量分析の形態であって、分子Mの光イオン化の機構が、光吸収および電子入射であっ
て分子イオンM+を形成する形態を指す。光エネルギーは典型的にはイオン化電位のすぐ
上なので、分子イオンは解離を受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィーの必要なし
にサンプルを分析することが可能であり、従って時間および費用がかなり節約される。水
蒸気またはプロトン性溶媒の存在下では、分子イオンは、Hを抽出してMH+を形成し得
る。これは、Mが高いプロトン親和力を有する場合に生じる傾向である。これは、定量の
精度には影響しない。なぜならM+およびMH+の合計は、一定であるからである。プロ
トン性溶媒における薬物化合物は、通常MH+として観察されるが、非極性化合物、例え
ば、ナフタレンまたはテストステロンは通常は、M+を形成する。Robb,D.B.,
Covey,T.R.およびBruins,A.P.(2000):例えば、Robb
et al.,Atmospheric pressure photoionizat
ion:An ionization method for liquid chro
matography−mass spectrometry.Anal.Chem.7
2(15):3653〜3659を参照のこと。
upled plasma)」または「ICP」という用語は、サンプルが、ほとんどの
元素が微粒化およびイオン化されるような十分に高い温度で部分的にイオン化されたガス
と相互作用する方法を指す。
イオン化表面に置き、強電界を用いて分析物イオンを生成する方法を指す。
び/または気相への分析物の進入を指す。
という用語は、測定が定量的に意味をなすポイントを指す。このLOQでの分析物の反応
は、識別可能、別個、かつ再現性であって、20%の正確性および80%〜120%の精
度を有する。
た値の方がその値に伴う不確実性よりも大きいポイントである。LODは、ゼロ濃度から
2標準偏差(SD)として適宜規定される。
は、体液の容積中で検出可能なエストラジオールの量を反映している絶対値を指す。しか
し、ある量はまた、別のエストラジオール量に比較した相対量を意図する。例えば、体液
中のエストラジオールの量は、正常に存在するエストラジオールのコントロールまたは正
常なレベルよりも大きい量であってもよい。
決定するための方法が提供され、この方法は以下を含む:(a)体液サンプル中のエスト
ラジオールを液体クロマトグラフィーによって精製する工程と;(b)255.07±0
.5の質量/電荷比を有しているエストラジオールの前駆イオンを生成する工程と;(c
)前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程であって、その断片イオンの少なく
とも1つが133.20±0.5の質量/電荷比を有する工程と;(d)工程(b)もし
くは(c)またはその両方で生成された1つ以上のイオンの量を検出し、この検出された
イオンを体液サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付ける工程。このような好
ましい実施形態では、この方法の定量限界は、80pg/mL以下である。他の好ましい
実施形態では、エストラジオールは、質量分析の前に誘導体化されない。特定の好ましい
実施形態では、この方法は、エストラジオール前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成
する工程をさらに含んでいてもよく、ここでこの断片イオンの少なくとも1つが159.
20±0.5の質量/電荷比を有する。いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、
体液サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離エストラジオールに対して十分な量で
体液サンプルに対して試薬を添加する工程を含み得る。関連の好ましい実施形態では、こ
の方法は、体液サンプルを酸性化する工程;好ましくはイオン化の前に酸性化する工程;
さらに好ましくは精製の前に酸性化する工程;好ましくはギ酸を用いて酸性化する工程を
含み得る。
て決定するための方法が提供され、この方法は以下を含む:(a)体液サンプル中のエス
トラジオールを液体クロマトグラフィーによって精製する工程と;(b)271.14±
0.5の質量/電荷比を有しているエストラジオールの前駆イオンを生成する工程と;(
c)前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程であって、その断片イオンの少な
くとも1つが183.10±0.5の質量/電荷比を有する工程と;(d)工程(b)も
しくは(c)またはその両方で生成された1つ以上のイオンの量を検出し、この検出され
たイオンを体液サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付ける工程。このような
好ましい実施形態では、この方法の定量限界は、80pg/mL以下である。他の好まし
い実施形態では、エストラジオールは、質量分析の前に誘導体化されない。特定の好まし
い実施形態では、この方法は、エストラジオール前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生
成する工程をさらに含んでいてもよく、ここでこの断片イオンの少なくとも1つが145
.10±0.5の質量/電荷比を有する。いくつかの好ましい実施形態では、この方法は
、体液サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離エストラジオールに対して十分な量
でこの体液サンプルに対して試薬を添加する工程を含み得る。関連の好ましい実施形態で
は、この方法は、体液サンプルに対して塩試薬を添加する工程;好ましくはイオン化の前
に添加する工程;さらに好ましくは精製の前に添加する工程;好ましくは硫酸アンモニウ
ムを添加する工程を含み得る。特に好ましい実施形態では、100mMの硫酸アンモニウ
ムを体液サンプルに対して、その体液サンプル中で約57mMの硫酸アンモニウムという
最終濃度に添加する。
され、この方法は以下を含む:(a)試験サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離
のエストラジオールに対して十分な量で試薬を用いて試験サンプルを酸性化する工程と;
(b)この試験サンプル中のエストラジオールを液体クロマトグラフィーによって精製す
る工程と;(c)この試験サンプル中のエストラジオールをイオン化して、タンデム型質
量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成する工程と;(d)このエストラジオ
ールイオン(単数または複数)の量をタンデム型質量分析によって正のイオンモードで検
出して、この検出されたエストラジオールイオン(単数または複数)の量を試験サンプル
中のエストラジオールの量に対して関連付ける工程。特定の好ましい実施形態では、この
試験サンプルは体液である。いくつかの好ましい実施形態では、この方法の定量限界は8
0pg/mL以下である。他の好ましい実施形態では、エストラジオールは、質量分析前
に誘導体化されない。いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、エストラジオール
の1つ以上の前駆イオンを生成する工程を含み、ここで前駆イオンの少なくとも1つは、
255.07±0.5の質量/電荷比を有する。関連の好ましい実施形態では、この方法
は、エストラジオール前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程を含みてもよく
、ここではこの断片イオンの少なくとも1つが159.20±0.5または133.20
±0.5の質量/電荷比を有する。いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、イオ
ン化の前に試験サンプルを酸性化する工程;より好ましくは精製の前に酸性化する工程;
好ましくはギ酸を用いて酸性化する工程を含んでいてもよい。
され、この方法は以下を含む:(a)試験サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離
エストラジオールに対して十分な量でこの試験サンプルに試薬を添加する工程と;(b)
この試験サンプル中のエストラジオールを液体クロマトグラフィーによって精製する工程
と;(c)この試験サンプル中の精製されたエストラジオールをイオン化して、タンデム
型質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成する工程と;(d)このエストラ
ジオールイオン(単数または複数)の量をタンデム型質量分析によって負のイオンモード
で検出して、この検出されたエストラジオールイオン(単数または複数)の量をこの試験
サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付ける工程。特定の好ましい実施形態で
は、この試験サンプルは体液である。いくつかの好ましい実施形態では、この方法の定量
限界は80pg/mL以下である。他の好ましい実施形態では、エストラジオールは、質
量分析前に誘導体化されない。いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、エストラ
ジオールの1つ以上の前駆イオンを生成する工程を含み、ここで前駆イオンの少なくとも
1つは、271.14±0.5の質量/電荷比を有する。関連の好ましい実施形態では、
この方法は、エストラジオール前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程を含み
てもよく、ここではこの断片イオンの少なくとも1つが183.10±0.5または14
5.10±0.5の質量/電荷比を有する。他の好ましい実施形態では、この方法は、試
験サンプルに対して塩試薬を添加する工程;好ましくはイオン化の前に添加する工程;さ
らに好ましくは精製の前に添加する工程;好ましくは硫酸アンモニウムを添加する工程を
含んでいてもよい。特に好ましい実施形態では、100mMの硫酸アンモニウムを試験サ
ンプルに対して、この試験サンプル中で約57mMの硫酸アンモニウムという最終濃度に
添加する。
てもよいが、特定の好ましい実施形態では;サンプルの調製は、誘導体化の使用を排除す
る。
びHPLCを用いて行われ、好ましくはHTLCはHPLCと組み合わせて用いられるが
、他の方法が用いられてもよく、これには、例えば、タンパク質沈殿およびHPLCと組
み合わせた精製が挙げられる。
つ以上の精製方法、例えば、HTLCまたはタンパク質沈殿と組み合わせて利用して、サ
ンプル中のエストラジオールを精製する。
ドで行われる。あるいは、質量分析は正のイオンモードで行われる。特定の好ましい実施
形態では、エストラジオールは、正および負の両方のイオンモードを用いて測定される。
特定の好ましい実施形態では、エストラジオールはAPCIまたはESIを正または負の
いずれかのモードで用いて測定される。
ラジオールおよび非グルクロン酸化エストラジオールの両方が検出および測定される。
0.5、255.07±0.5、183.10±0.5、159.20±0.5、145
.10±0.5、および133.20±0.5の質量/電荷比(m/z)を有するイオン
からなる群より選択され;この後者4つは、前駆イオンの断片イオンである。特定の好ま
しい実施形態では、この前駆イオンは、271.14±0.5または255.07±0.
5の質量/電荷比を有し、この断片イオンは183.10±0.5または133.20±
0.5の質量/電荷比を有する。
供され、この量もサンプル中で決定される。これらの実施形態では、サンプルに存在する
内因性のエストラジオールおよび内部標準の全てまたは両方の一部をイオン化して、質量
分析で検出可能な複数のイオンを生成し、各々から生成される1つ以上のイオンが質量分
析によって検出される。
ールである。好ましい実施形態では、質量分析計で検出可能な内部エストラジオール標準
イオンは、276.15±0.5、260.10±0.5、187.10±0.5、16
1.10±0.5、147.10±0.5、および135.10±0.5の質量/電荷比
を有するイオンからなる群より選択される。特に好ましい実施形態では、内部エストラジ
オール標準の前駆イオンは、276.15±0.5および260.10±0.5の質量/
電荷比を有しているイオンからなる群より選択され;かつ1つ以上の断片イオンは、18
7.10±0.5、161.10±0.5、147.10±0.5、および135.10
±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群より選択される。
,16,17−d5エストラジオールなどの参照に対して比較することによって試験サン
プル中のエストラジオールの存在または量に関連付ける。
する。好ましい実施形態では、この液体クロマトグラフィーはHPLCである。好ましい
実施形態は、HPLCを単独で、または例えば、HTLCもしくはタンパク質精製などの
1つ以上の精製方法と組み合わせて利用して、サンプル中のエストラジオールを精製する
。別の好ましい実施形態では、この質量分析はタンデム型質量分析(MS/MS)である
。
限界(LOQ)は、80pg/mL以下;好ましくは75pg/mL以下;好ましくは5
0pg/mL以下;好ましくは25pg/mL以下;好ましくは10pg/mL以下;好
ましくは5pg/mL以下;好ましくは4.5pg/mL以下;好ましくは4pg/mL
以下;好ましくは3.5pg/mL以下;好ましくは3pg/mL以下;好ましくは2.
5pg/mL以下;好ましくは2pg/mLである。
い定量的な測定に関して本明細書で用いられる場合、示される値プラスマイナス10%を
指す。質量分析装置は、所定の分析物の量を決定するのにわずかに変化し得る。「約」と
いう用語は、イオンの量またはイオンの質量/電荷比の文脈では+/−0.5の原子量単
位を指す。
明の以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかである。
は、液体クロマトグラフィー(LC)、最も好ましくはHTLCを、HPLCと組み合わ
せて利用して、選択された分析物の最初の精製を行い、そしてこの精製と質量分析(MS
)の固有の方法とを組み合わせて、これによって試験サンプル中のエストラジオールを検
出および定量するための高速アッセイシステムを提供する。好ましい実施形態は特に、大
規模の臨床実験室への適用によく適している。特異性が向上しており、かつ他のエストラ
ジオールアッセイで必要とされるよりも少ない時間と少ないサンプル調製とで達成される
、エストラジオールの方法が提供される。
80pg/mL以下;好ましくは75pg/mL以下;好ましくは50pg/mL以下;
好ましくは25pg/mL以下;好ましくは10pg/mL以下;好ましくは5pg/m
L以下;好ましくは4.5pg/mL以下;好ましくは4pg/mL以下;好ましくは3
.5pg/mL以下;好ましくは3pg/mL以下;好ましくは2.5pg/mL以下;
好ましくは2pg/mLである。
る。例えば、合成エストラジオールの製造の間に得られるサンプルを分析して、製造プロ
セスの組成物および収率を決定してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、サンプル
は生物学的サンプル;すなわち、任意の生物学的供給源、例えば、動物、細胞培養物、器
官培養物などから得られるサンプルである。特定の好ましい実施形態では、サンプルは哺
乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどから得られる。特に好ましい哺乳動物は霊長類、
最も好ましくは男性または女性のヒトである。特に好ましいサンプルとしては血液、血漿
、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、または他の組織サンプルが挙げられる
。このようなサンプルは、例えば、患者;すなわち、疾患または病態の診断、予防または
処置のための臨床状況に自らある生きている人、男性または女性から得てもよい。この試
験サンプルは好ましくは、患者から得られる、例えば血清である。
女性では、約1.3%のエストラジオールが遊離型で循環され、ここでその残りは性ホ
ルモン結合グロブリン(SHBG)およびアルブミンに結合されている。エストラジオー
ルは、SHBGに対して、高い親和性(約40%)で、またはアルブミンに対して低い親
和性で結合する。
めに用いられ得る方法としては、例えば、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー(T
LC)、電気泳動、例えば、キャピラリー電気泳動、アフィニティ分離、例えば、イムノ
アフィニティー分離、抽出方法、例えば、酢酸エチル抽出およびメタノール抽出、ならび
にカオトロピック剤の使用または上記の任意の組み合わせなどが挙げられる。
ジオールおよびタンパク質に結合したエストラジオール)に対して分析が関連し得るよう
に、クロマトグラフィーおよびまたはMSのサンプル分析の前にエストラジオールとタン
パク質との間の相互作用を破壊してもよい。タンパク質沈殿は、試験サンプル、特に生物
学的試験サンプル、例えば、血清または血漿を調製する1つの好ましい方法である。この
ようなタンパク質精製の方法は、当該分野で周知であり、例えば、Polson et
al.,Journal of Chromatography B 785:263〜
275(2003)は、この方法での使用に適切なタンパク質沈殿技術を記載している。
タンパク質沈殿を用いて、上清にエストラジオールを残したままサンプルからほとんどの
タンパク質を除去することができる。サンプルを遠心分離して、沈殿したタンパク質から
液体上清を分離してもよい。次いで、得られた上清を液体クロマトグラフィーおよび引き
続く質量分析的な分析にあてはめてもよい。特定の実施形態では、このタンパク質沈殿、
例えば、アセトニトリルタンパク質沈殿などの使用によって、HPLCおよび質量分析の
前の高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)または他のオンライン抽出の必要性が省
略される。このような実施形態によれば、この方法は、(1)目的のサンプルのタンパク
質沈殿を行う工程;および(2)オンライン抽出または高乱流液体クロマトグラフィー(
HTLC)を用いることなくHPLC−質量分析計に上清を直接ロードする工程を含む。
タンパク質から遊離され得る。例えば、ギ酸または40%エタノールが含有される水をサ
ンプルに添加して、タンパク質とエストラジオールとの間の相互作用を破壊してもよい。
あるいは、硫酸アンモニウムをサンプルに添加して、担体タンパク質を沈殿させることな
く担体タンパク質とエストラジオールとの間のイオン性相互作用を破壊してもよい。
組み合わせて用いて、質量分析の前にエストラジオールを精製してもよい。このような実
施形態では、サンプルは、分析物を捕獲するHTLC抽出カートリッジを用いて抽出して
もよく、次いでイオン化の前に第二のHTLCカラム上で、または分析的HPLCカラム
上に溶出およびクロマトグラフィーされてもよい。これらのクロマトグラフィー手順を含
む工程は、自動的な形式で連結することが可能であるので、分析物の精製の間の操作者の
関与についての要件を最小限にすることができる。この特徴によって、時間および費用の
節約をもたらし、かつ操作者の過ちの機会を排除することができる。
せ、分離特徴を改善することができると考えられる。HTLCカラムは、剛体粒子を含む
充填カラムを通じた高いクロマトグラフィー流速の手段によって成分を分ける。高い流速
(例えば、3〜5mL/分)を使用することによって、乱流がカラムで起こり、これが目
的の固定相と分析物(単数または複数)との間のほぼ完全な相互作用を生じる。HTLC
カラムを用いる利点は、生体液マトリックスと関連して構築された高分子が、高い分子量
種は乱流条件下では保持されないために避けられるということである。1つの手順で複数
の分離を組み合わせるHTLC方法によって、長時間のサンプル調製の必要性が少なくな
り、有意に早い速度で操作される。このような方法はまた、層流(HPLC)クロマトグ
ラフィーよりも優れた分離能力を達成する。HTLCによって、生物学的サンプル(血漿
、尿など)の直接注入が可能になる。変性したタンパク質および他の生体の砕片が分離カ
ラムを急速に詰まらせるため、直接注入は、クロマトグラフィーの伝統的な形態では達成
が困難である。HTLCはまた、1mL未満、好ましくは0.5mL未満、好ましくは0
.2mL未満、好ましくは0.1mLというごく少量のサンプルでも可能である。
いる。例えば、Zimmer et al.,J.Chromatogr.A 854:
23〜35(1999)を参照のこと;また米国特許第5,968,367号;同第5,
919,368号;同第5,795,469号;および同第5,772,874号も参照
のこと。この方法の特定の実施形態では、サンプルをHTLCカラムにロードする前に上
記のようなタンパク質沈殿に供する;別の好ましい実施形態では、このサンプルを、タン
パク質沈殿にかけることなく、HTLCに直接ロードしてもよい。好ましくは、HTLC
は、HPLCと組み合わせて用いて、サンプルをタンパク質沈殿にかけることなく、エス
トラジオールを抽出および精製する。関連の好ましい実施形態では、この精製工程は、(
i)このサンプルをHTLC抽出カラムに加える工程、(ii)エストラジオールがカラ
ムに保持される条件下でHTLC抽出カラムを洗浄する工程、(iii)HTLC抽出カ
ラムから保持されたエストラジオールを溶出する工程、(iv)この保持された物質を分
析カラムに加える工程、および(v)分析カラムから精製されたエストラジオールを溶出
する工程を含む。HTLC抽出カラムは好ましくは、大粒子のカラムである。種々の実施
形態では、この方法の1つ以上の工程は、オンラインで、自動的な方式で行ってもよい。
例えば、一実施形態では、工程(i)〜(v)をオンラインで自動方式で行う。別法では
、イオン化および検出の工程はオンラインで工程(i)−(v)に従って行う。
較的遅い、層流の技術に依拠する。伝統的なHPLC分析は、カラム充填に依拠し、ここ
ではカラムを通じたサンプルの層流がサンプルからの目的の分析物の分離の基礎である。
当業者は、このようなカラムでの分離が拡散性プロセスであることを理解するであろう。
HPLCは生物学的サンプル中の化合物の分離に首尾よく適用されているが、質量分析(
MS)での分離および引き続く分析の前には大量のサンプル調製が必要であり、そのせい
でこの技術は労働集約的になっている。さらに、ほとんどのHPLCシステムは質量分析
計をその最大能力までは利用せず、それによって1つのHPLCシステムだけを単一のM
S装置に接続することになり、その結果多数のアッセイを行うためには長時間が必要とな
る。
ている。例えば、Taylor et al.,Therapeutic Drug M
onitoring 22:608〜12(2000);およびSalm et al.
,Clin.Therapeutics 22 Supl.B:B71−B85(200
0)を参照のこと。
きる。クロマトグラフィーカラムは典型的には、化学部分の分離(すなわち、断片化)を
容易にする媒体(すなわち、充填材料)を含む。この媒体は、微細な粒子を含む場合があ
る。この粒子は、種々の化学的部分と相互作用してその化学的部分の分離を促進する結合
された表面を備える。適切な結合された表面の1つは、アルキル結合した表面などの疎水
性結合した表面である。アルキル結合した表面は、C−4、C−8、C−12またはC−
18結合したアルキル基、好ましくはC−18結合した基を含み得る。クロマトグラフィ
ーカラムは、サンプルを受容するための入口ポート、および分画されたサンプルを含む溶
出液を廃棄するための出口ポートを備える。一実施形態では、サンプル(または精製前の
サンプル)を入口ポートでカラムに加え、溶媒または溶媒混合物で溶出し、出口ポートで
排出する。異なる溶媒モードを目的の分析物を溶出するために選択してもよい。例えば、
液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、または多型(すなわ
ち、混合)モードを用いて行ってもよい。クロマトグラフィーの間、物質の分離は、溶出
液(「移動相」としても公知)の選択、溶出モード、勾配条件、温度などのような変数に
よって達成される。
されるが、1つ以上の他の物質が保持されない条件下でカラムにサンプルを加えることに
よって精製され得る。これらの実施形態では、目的の分析物がカラムによって保持される
第一の移動相条件を使用してもよく、そして第二の移動相条件を引き続き使用して、一旦
、保持されていない物質が洗い流されれば、カラムから保持された物質を除去してもよい
。あるいは、分析物は、目的の分析物が1つ以上の他の物質に比べて種々の速度で溶出す
る移動相条件下でカラムにサンプルを加えることによって精製され得る。このような手順
によって、サンプルの1つ以上の他の成分に対して目的の1つ以上の分析物の量が富化さ
れ得る。
テムでのHPLCを続けてもよい。特定の好ましい実施形態では、Cohesive T
echnologiesのTurboFlow Cyclone P(登録商標)という
ポリマーベースのカラム(60μmの粒子サイズ、50×1.0mmのカラム寸法、10
0Åの細孔サイズ)を用いる。関連の好ましい実施形態では、親水性のエンドキャップを
備える、Phenomenex IncのSynergi Polar−RP(登録商標
)エーテル連結フェニル、分析カラム(4μmの粒子サイズ、150×2.0mmのカラ
ム寸法、80Åの細孔サイズ)を用いる。特定の好ましい実施形態では、HTLCおよび
HPLCは、移動相としてHPLC等級の超純水および100%mpメタノールを用いて
行う。
することなく物質をあるところから次に通過させるように、2つ以上のクロマトグラフィ
ーカラムを必要に応じて連結することができる。好ましい実施形態では、バルブおよび配
管の選択を事前プログラムされたコンピューターによって制御して必要な工程を行う。最
も好ましくは、クロマトグラフィーシステムもこのようなオンラインの方式で検出システ
ム、例えばMSシステムに接続する。従って、操作者は、オートサンプラーにサンプルの
トレイを置いてもよく、残りの操作はコンピューター制御下で行い、選択された全てのサ
ンプルの精製および分析を行う。
の前に精製してもよい。特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーはガスクロマト
グラフィーではない。好ましくは、この方法は、質量分析の前にガスクロマトグラフィー
にエストラジオールをかけることなく行う。
種々の実施形態では、試験サンプル中に存在するエストラジオールを、当業者に公知の
任意の方法によってイオン化することができる。質量分析は、質量分析計を用いて行い、
質量分析計には、さらなる分析のために断片化されたサンプルをイオン化し、荷電された
分子を生成するためのイオン源を備える。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化
、化学的イオン化、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、光子イオン化、大気圧化学
イオン化(APCI)、光イオン化、大気圧光イオン化(APPI)、高速原子衝撃(F
AB)、液体二次イオン化(LSI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MAL
DI)、フィールド・イオン化、フィールド・デソープション、熱スプレー/プラズマス
プレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化(SELDI)、誘導結合プラズマ(I
CP)および粒子ビームイオン化によって行ってもよい。当業者は、イオン化方法の選択
は、測定されるべき分析物、サンプルの種類、検出器の種類、正対負のモードの選択など
に基づいて決定できることを理解するであろう。
よって正または負のモードでイオン化される。関連の好ましい実施形態では、エストラジ
オールイオンは、ガス状態であり、不活性な衝突ガスはアルゴンまたは窒素である。別の
好ましい実施形態では、エストラジオールを大気圧化学イオン化(APCI)によって正
または負のモードでイオン化する。
荷電されたイオンを分析して質量対電荷比を決定することができる。質量対電荷比を決定
するための適切な分析装置としては、四重極アナライザー(analyzer)、イオン
トラップアナライザー、および飛行時間アナライザーが挙げられる。このイオンはいくつ
かの検出モードを用いて検出され得る。例えば、選択されたイオンを検出してもよく(す
なわち、選択性イオンモニタリングモード(selective ion monito
ring mode)(SIM)を用いる)、あるいはイオンは、走査モード、例えば、
多重反応モニタリング(multiple reaction monitoring)
(MRM)または選択反応モニタリング(selected reaction mon
itoring)(SRM)を用いて検出してもよい。好ましくは、質量対電荷比は、四
重極アナライザーを用いて決定される。例えば、「四重極(quadrupole)」ま
たは「四重極イオントラップ(quadrupole ion trap)」装置では、
振動高周波電界中のイオンは電極間で印加されるDC電位、RFシグナルの振幅および質
量/電荷比に対して比例する力を受ける。この電圧および振幅は、特定の質量/電荷比を
有しているイオンのみが四重極の長さを移動するが、他の全てのイオンが偏向されるよう
に選択され得る。従って、四重極装置は、「質量フィルター」として、および「質量検出
器」として両方で、この装置に注入されたイオンのために作用し得る。
技術の分解能を増強し得る。この技術では、目的の分子から生成された前駆イオン(親イ
オンとも呼ばれる)がMS装置中で濾過されてもよく、この前駆イオンが引き続き、断片
化されて1つ以上の断片イオン(娘イオンまたは生成物イオンとも呼ばれる)を生じ、次
にこれが第二のMS手順で分析される。前駆イオンの注意深い選択によって、特定の分析
物によって生成されるイオンのみが断片化チャンバに渡され、ここで不活性ガスの原子と
衝突して娘イオンを生じる。前駆イオンおよび断片イオンの両方が所定のセットのイオン
化/断片化条件下で再現性の方式で産生されるので、MS/MS技術は、極めて強力な分
析ツールをもたらすことができる。例えば、濾過/断片化の組み合わせを用いることによ
って妨害物質を排除することが可能で、特に、生体サンプルなどの複雑なサンプルでは有
用であり得る。
特定の質量/電荷を有する各々のイオンの相対量(例えば、100〜1000amu))
をもたらす。分析アッセイの結果、すなわち、質量スペクトルは、当該分野で公知の多数
の方法によって元のサンプル中の分析物の量に対して関連付けられ得る。例えば、サンプ
リングおよび分析パラメーターが注意深く制御されていることを考慮すれば、所定のイオ
ンの相対量を、元の分子の相対量から絶対量に変換する表と比較することができる。ある
いは、分子標準はサンプルとともに流されてもよく、標準的な曲線をそれらの標準から生
成したイオンに基づいて作製してもよい。このような標準曲線を用いて、所定のイオンの
相対量を、もとの分子の絶対量に変換してもよい。特定の好ましい実施形態では、内部標
準を用いて、エストラジオールの量を計算するための標準曲線を作製する。このような標
準曲線を作製および用いる方法は、当該分野で周知であり、かつ当業者は適切な内部標準
を選択できる。例えば、エストラジオールの同位体を内部標準として用いてもよく、特定
の好ましい実施形態では、この標準はd5−エストラジオールである。イオンの量をもと
の分子の量に対して関連付けるための多数の他の方法が当業者に周知である。
は、1つ以上の精製工程をオンラインで行い、さらに好ましくは全ての精製および質量分
析工程を、オンライン方式で行ってもよい。
離され、衝突活性化解離をさらなる検出のための断片イオンを生成するために用いる場合
が多い。CADでは、前駆イオンは、不活性ガスとの衝突、および引く続く「単分子分解
」と呼ばれるプロセスによる断片を通じてエネルギーを得る。十分なエネルギーが前駆イ
オン中に沈着されなければならず、その結果イオン内の特定の結合が振動エネルギーの増
大によって破壊され得る。
および/または定量される。そのサンプルを液体クロマトグラフィー、好ましくはHTL
Cに続いてHPLCに供し、このクロマトグラフィーのカラムからの液体溶媒の流れは、
MS/MSアナライザーの加熱されたネブライザーの界面に入り、その溶媒/分析物の混
合物がその界面の加熱配管中で蒸気に変換される。噴霧溶媒に含まれたその分析物(例え
ば、エストラジオール)をその界面のコロナ放電針でイオン化し、これによって噴霧され
た溶媒/分析物混合物に大きい電圧を印加する。このイオン、例えば、前駆イオンは、装
置の開口部を通過して、第一の四重極に入る。四重極1および3(Q1およびQ3)は質
量フィルターであって、それによって、その質量対電荷比(m/z)に基づいてイオン(
すなわち、「前駆」イオンおよび「断片」イオン)を選択することが可能になる。四重極
2(Q2)は衝突セルであり、ここでイオンが断片化される。質量分析計の第一の四重極
(Q1)は、エストラジオールの質量対電荷比を有する分子を選択する。エストラジオー
ルの正確な質量/電荷比を有する前駆イオンは衝突チャンバ(Q2)に通ることが可能で
あるが、いかなる他の質量/電荷比を有する望ましくないイオンも四重極の横で衝突して
排除される。Q2に入る前駆イオンは中性のアルゴンガス分子および断片と衝突する。こ
の過程は衝突活性化解離(CAD)と呼ばれる。生成された断片イオンは、四重極3(Q
3)に通過し、ここでエストラジオールの断片イオンが選択されるが、他のイオンは排除
される。
場合がある。当該分野で周知の標準的な方法を用いて、当業者は、四重極3(Q3)での
選択のために用いられ得るエストラジオールの特定の前駆イオンの1つ以上の断片イオン
を特定することができる。
脱水または脱アミノをそれぞれ呈する断片イオンが共通して形成される。アルコール基を
含む前駆イオンの場合、脱水によって形成されるこのような断片イオンは、前駆イオンか
らの1つ以上の水分子の損失によって生じる(すなわち、前駆イオンと断片イオンとの間
の質量対電荷比における相違は1つの水分子の損失について約18、または2つの水分子
の損失について約36などである)。アミン基を含む前駆イオンの場合、脱アミノによっ
て形成されるこのような断片イオンは、1つ以上のアンモニア分子の損失によって生じる
(すなわち、前駆イオンと断片イオンとの間の質量対電荷比における相違は、1つのアン
モニア分子の損失について約17、または2つのアンモニア分子の損失について約34な
どである場合)。同様に、1つ以上のアルコールおよびアミン基を含む前駆イオンは共通
して、1つ以上の水分子および/または1つ以上のアンモニア分子の損失を呈する断片イ
オンを形成する(すなわち、前駆イオンと断片イオンとの間の質量対電荷比の相違が1つ
の水分子の損失および1つのアンモニア分子の損失について約35である場合)。一般に
は、前駆イオンの脱水または脱アミノを呈する断片イオンは、特定の分析物について特定
の断片イオンではない。従って、本発明の好ましい実施形態では、MS/MSは、前駆イ
オンからの1つ以上の水分子の損失および/または1つ以上のアンモニア分子の損失のみ
を呈するのでない、エストラジオールの少なくとも1つの断片イオンが検出されるように
行われる。
スを生じる。得られたデータを、コンピューターに中継して、これがイオン収集対時間の
カウントをプロットする。得られた質量クロマトグラムは、伝統的なHPLC方法で作製
したクロマトグラムと同様である。特定のイオンに相当するピーク下面積、またはこのよ
うなピークの振幅を測定して、面積または振幅を目的の分析物(エストラジオール)の量
と相関させる。特定の実施形態では、断片イオン(単数または複数)および/または前駆
イオンの曲線下面積、またはピークの振幅を測定してエストラジオールの量を決定する。
上記のとおり、所定のイオンの相対量を、内部分子標準、例えば、d5−エストラジオー
ルの1つ以上のイオンのピークに基づいた較正標準曲線を用いて、元の分析物、例えば、
エストラジオールの絶対量に変換してもよい。
定するものではない。
血液は、添加物なしでVacutainer中に収集して、室温、18〜25℃で30
分間凝固させた。全体的な溶血および/または脂肪血症を呈したサンプルは除外した。
ル中でさらに希釈して、1,000,000pg/mLのエストラジオール中間ストック
標準を調製し、これを用いて10,000pg/mLの2つのエストラジオール作業標準
を調製し、A標準についてはメタノールで、B標準については剥離血清で希釈した。
913−1000または等価物)を用いて、1mg/mLのd5−エストラジオールスト
ック標準(2,4,16,16,17−d5エストラジオール)を調製し、これを用いて
1,000,000pg/mLの中間体ストック標準を重水素化メタノールで調製した。
このd5−エストラジオール中間体ストック標準を用いて、DI水中で5000pg/m
Lの作業用d5−エストラジオール内部標準を調製した。1mLのd5−エストラジオール
中間ストック標準を、200mLのメスフラスコでDI水を用いてその容積に希釈した。
drichのカタログ番号06440または等価物)を添加することによって調製し、こ
れを超純粋HPLC等級の水で容積希釈した。DI水の100mMの硫酸アンモニウム溶
液は、1000mLのメスフラスコに硫酸アンモニウム粉末(CAS# 7783−20
−2 Fisherのカタログ番号A702−500)を13.2グラム添加することに
よって調製し、これをDI水で容積希釈した。
00pg/mLのエストラジオール標準の凍結アリコートの連続希釈から新鮮に毎週調製
した。その標準は、最高濃度から最低まで調製し、ここでは各々の標準について10mL
の最終の総容積であった。
液体クロマトグラフィー(LC)サンプルは、200μLの標準、コントロール、また
は患者サンプルを96−ウェルのプレートにピペッティングすることによって準備した。
正のイオンモードでの試行の場合、300μLの20%ギ酸を、各々のウェルに約11%
(V/V)の最終濃度で送達した。負のイオンモードで試行する場合、300μLの10
0mMの硫酸アンモニウム溶液を各々のウェルに対して、約57mMの硫酸アンモニウム
の最終濃度で添加した。さらに、25μLの5000pg/mLのd5−エストラジオー
ル標準を各々のウェルに添加した。このサンプルをLCの前に30〜45分間室温でイン
キュベートした。
ウェアを用いてCohesive Technologies Aria TX−4 H
TLCシステムで行った。オートサンプラー洗浄溶液は、30%アセトニトリル、30%
メタノール、30%イソプロパノール、および10%アセトン(v/v)を用いて調製し
た。
ive Technologiesの50×1.0mm、60μmのCyclone P
カラム)中に75μLの上記で調製したサンプルを自動的に注入した。サンプルを高速で
ロードして(5mL/分、ローディング試薬100%DI)、抽出カラムの内側に乱流を
形成した。この乱流によって、カラム中の大きい粒子に対するエストラジオールの最適化
結合、および残りのタンパク質および砕片の廃棄物への通過を確実にした。
を用いて、サンプルを分析カラム(Phenomenex analytical co
lumn,Synergi Polar−RP(登録商標)150×2.0mm、4μm
カラム)に溶出させた。二成分のHPLC勾配を分析カラムに加えて、サンプルに含まれ
る他の分析物からエストラジオールを分離した。移動相Aは超純水(HPLC等級)であ
って、移動相Bは100%メタノールであった。HPLC勾配は、40%の有機勾配で開
始し、これは約5.33分で100%まで傾斜した。分析物は、77%メタノール勾配で
HPLCカラムを溶出した。次に、分離されたサンプルをエストラジオールの定量のため
にMS/MSに供した。
よび17−αエストラジオール、ならびに以下のステロイド:エストロン、エストリオー
ル、テストステロン、17−αヒドロキシプロゲステロン、プロゲステロン、アンドロス
テンジオン、17−βエストラジオールグルクロニド、17−β硫酸エストラジオール、
およびジヒドロキシテストステロンなどの同じ重量の1000pg/mLの各々のステロ
イドでスパイクした。そのサンプルをLCに供した。17−αエストラジオール以外にエ
ストラジオールと同時溶出されたステロイドはなく、17−αエストラジオールは部分的
に17−βエストラジオールを妨害したが、操作者がその存在を容易に決定できるほど十
分に異なる保持時間であった。
MS/MSは、Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS
システム(Thermo Electron Corporation)を用いて行った
。全てがThermo Electronからの以下のソフトウェアプログラムを、本明
細書に記載の実施例に用いた:Tune Master V1.2または、それより新し
いもの、Xcalibur V2.0 SR1、またはそれより新しいもの、TSQ Q
uantum 1.4またはそれより新しいもの、LCQuan V2.0またはそれよ
り新しいもの、およびXReport 1.0またはそれより新しいもの。分析HPLC
カラムを出ていく液体の溶媒/分析物は、Thermo Finnigan MS/MS
アナライザーの加熱されたネブライザー界面に流れた。その溶媒/分析物混合物を、界面
の加熱配管中で蒸気に変換した。噴霧された溶媒中の分析物を、界面のコロナ放電針によ
ってイオン化し、これによって噴霧された溶媒/分析物混合物に電圧を印加する。
たは255.07±0.5m/zのいずれかの質量対電荷比を有するイオンを選択した。
四重極2(Q2)に入るイオンは、アルゴンガスと衝突して、イオン断片を生じ、これが
さらなる選択のために四重極3(Q3)へ通過した。同時に、同位体希釈質量分析を用い
る同じプロセスを、内部標準である5−重水素化エストラジオール分子で行った。以下の
質量移行を、正の極性でのバリデーションの間の検出および定量のために用いた。
。
3つの品質管理(QC)プールをチャコール剥離血清から調製して、10、200およ
び800pg/mLの濃度までエストラジオールでスパイクした。
ッセイ内のサンプルの再現性(CV)を決定した。以下の値を決定した:
ッセイの間の再現性(RSD%)を決定した。以下の値を決定した:
エストラジオールのゼロ標準を、10個の複製で行って、測定された値の方がそれにと
もなう不確実度よりも大きいポイントである、アッセイの検出限界を決めた。LODは、
ゼロ濃度からの2標準偏差(SD)として適宜決定した。ゼロ標準についての得られたピ
ーク面積比を統計学的に分析し、ここでは0.021の平均値および0.006のSDで
あった。エストラジオールのアッセイのLODは2.0pg/mLであった。
想のLOQに近い濃度の5つの異なるサンプルをアッセイして、各々について再現性を決
定した。エストラジオールアッセイのLOQは2.0pg/mLで規定した。
アッセイ中のエストラジオール検出の直線性を確立するため、ゼロ標準に割り当てた1
つのブランク、および11個のスパイクした血清標準を調製して、5つの別の日に分析し
た。5つの連続試行からの二次回帰で0.995以上という相関係数が得られ、ここでは
±20%の精度で2〜2000pg/mLという定量可能な線形範囲が明らかになった。
マトリックス特異性は、水、剥離血清およびプールした血清を用いて評価して、患者サ
ンプルが線形の方式で希釈できるか否かを決定した。このサンプルは、較正実施後に二連
で行った。正確性は以下のとおりであった:
スパイクされたサンプルからエストラジオールを回収する能力を決定するために、濃度
が既知の2例の患者サンプルを、3レベル(低、中、高)のエストラジオールでスパイク
した。回収はスパイクされた量を予想濃度で割ることによって算出した。平均回収はそれ
ぞれ低、中および高レベルで92%、108%および98%であった。
他の文書および電気的に利用可能な情報の内容は、あたかも各々の個々の刊行物が参照に
よって援用されると詳細にかつ個々に示されるのと同じ程度までその全体が出典明記によ
って本明細書に援用される。出願人は、任意のこのような論文、特許、特許出願または他
の物理的および電子的な文書由来の任意のかつ全ての物質および情報を本出願に物理的に
組み込む権利を留保する。
単数または複数)、制限(単数または複数)もなしに適切に実施され得る。従って、例え
ば、「含む(comprising)」、「含んでいる、包含している、挙げられる(i
ncluding)」、「含有する、含んでいる(containing)」などの用語
は、広範にかつ限定なしに読みとられるべきである。さらに、本明細書に使用される用語
および表現は説明の用語として用いられており、限定ではなく、このような用語および表
現の使用において、示されかつ記載される特徴の任意の等価物またはその一部を排除する
という意図はない。種々の改変が特許請求される本発明の範囲内で可能であるということ
が認識される。従って、本発明は、本明細書に具体化される本発明の好ましい実施形態お
よび任意の特徴、修飾および変動によって詳細に記載されているが、本明細書の開示は当
業者によって頼られる場合があり、このような改変および変動は、本発明の範囲内である
とみなされることが理解されるべきである。
ている下位の種および亜属の分類の各々も、本発明の一部を形成する。これは、本発明の
方法の一般的記述を包含しており、ただし、条件付きであるかまたは消極的な限定があり
、除外される物質が本明細書に特に引用されるか否かにかかわらず、その属からなんらか
の対象を取り除く。
マーカッシュグループに関して記載されており、当業者は本発明がマーカッシュグループ
の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して本明細書に記載されてい
ることを認識する。
Claims (37)
- 試験サンプル中のエストラジオールの量を決定するための方法であって:
(a)前記試験サンプルを前記試験サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離のエス
トラジオールに対して十分な量の試薬を用いて酸性にする工程と;
(b)前記試験サンプルからエストラジオールを液体クロマトグラフィーによって精製す
る工程と;
(c)前記試験サンプルから精製された前記エストラジオールをイオン化して、タンデム
型質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成する工程と:
(d)前記エストラジオールイオン(単数または複数)の量をタンデム型質量分析によっ
て正のイオンモードで検出し、ここで前記エストラジオールイオン(単数または複数)の
量が前記試験サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付けられる工程と、
を含む上記方法。 - 前記前記液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である、
請求項1に記載の方法。 - 前記精製工程がさらに、高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)、続いて高速液体
クロマトグラフィー(HPLC)を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記エストラジオールイオンが、271.14±0.5、255.07±0.5、18
3.10±0.5、159.20±0.5、145.10±0.5および133.20±
0.5の質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される1つ以上のイオンを含む
、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン化が、271.14±0.5および255.07±0.5の質量/電荷比を
有するイオンからなる群より選択される前駆イオンを生成する工程と、183.10±0
.5、159.20±0.5、145.10±0.5、および133.20±0.5の質
量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される1つ以上の断片イオンを生成する工
程とを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン化が、271.14±0.5の質量/電荷比を有する前駆イオンを生成する
工程と、183.10±0.5および145.10±0.5の質量/電荷比を有するイオ
ンからなる群より選択される1つ以上の断片イオンを生成する工程とを含む、請求項1〜
3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン化が、271.14±0.5の質量/電荷比を有する前駆イオンを生成する
工程と、183.10±0.5および145.10±0.5の質量/電荷比を有する断片
イオンを生成する工程とを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン化が、255.07±0.5の質量/電荷比を有する前駆イオンを生成する
工程と、159.20±0.5および133.20±0.5の質量/電荷比を有するイオ
ンからなる群より選択される1つ以上の断片イオンを生成する工程とを含む、請求項1〜
3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン化が、255.07±0.5の質量/電荷比を有する前駆イオンを生成する
工程と、159.20±0.5および133.20±0.5の質量/電荷比を有する断片
イオンを生成する工程とを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試薬がギ酸である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験サンプル中に存在するグルクロン酸化エストラジオールおよび非グルクロン酸
化エストラジオールの両方が前記方法によって検出および測定される、請求項1〜10の
いずれか1項に記載の方法。 - 前記試験サンプルが体液である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、80pg/mL以下の定量限界を有する、請求項1〜12のいずれか1項
に記載の方法。 - 前記エストラジオールが質量分析の前に誘導体化されない、請求項1〜13のいずれか
1項に記載の方法。 - 体液サンプル中のエストラジオールの前記量をタンデム型質量分析によって決定するた
めの方法であって:
(a)前記体液サンプルから液体クロマトグラフィーによってエストラジオールを精製す
る工程と;
(b)271.14±0.5の質量/電荷比を有している前記エストラジオールの前駆イ
オンを生成する工程と;
(c)前記前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程であって、前記1つ以上の
断片イオンの少なくとも1つが、183.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンフ
ラグメントを含む工程と;
(d)工程(b)もしくは(c)またはその両方で生成される1つ以上の前記イオンの量
を検出する工程、および前記検出されたイオンを前記体液サンプル中の前記エストラジオ
ールの量に対して関連付ける工程、を含む上記方法。 - 前記方法が80pg/mL以下の定量限界を有する、請求項15に記載の方法。
- 前記エストラジオールが質量分析前に誘導体化されない、請求項15〜16のいずれか
1項に記載の方法。 - 前記液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求
項15〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 前記精製工程がさらに、高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)続いて、高速液体
クロマトグラフィー(HPLC)を含む、請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法
。 - 前記前駆イオンが271.14±0.5の質量/電荷比を有し、前記1つ以上の断片イ
オンが、145.10±0.5の質量/電荷比を有する断片イオンを含む、請求項15〜
19のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン化工程の前に前記体液サンプルに存在し得るタンパク質由来の遊離のエスト
ラジオールに対して十分な量である試薬が前記体液サンプルに添加される、請求項15〜
20のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試薬が塩である、請求項21に記載の方法。
- 前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項22に記載の方法。
- 前記試薬が、前記体液サンプルを酸性にするのに十分な量で添加される、請求項21に
記載の方法。 - 前記試薬がギ酸である、請求項24に記載の方法。
- 前記体液サンプル中に存在するグルクロン酸化エストラジオールおよび非グルクロン酸
化エストラジオールの両方が前記方法によって検出および測定される、請求項15〜25
のいずれか1項に記載の方法。 - 試験サンプル中のエストラジオールの量を決定するための方法であって:
(a)前記試験サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離のエストラジオールに対
して十分な量で前記試験サンプルに対して試薬を添加する工程と;
(b)前記試験サンプルから液体クロマトグラフィーによってエストラジオールを精製
する工程と;
(c)前記試験サンプルから精製されたエストラジオールをイオン化して、タンデム型
質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成する工程と;
(d)前記エストラジオールイオン(単数または複数)の量をタンデム型質量分析によ
って負のイオンモードで検出し、ここで前記エストラジオールイオン(単数または複数)
の量が前記試験サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付けられる工程と、
を含む上記方法。 - 前記方法が80pg/mL以下の定量限界を有する、請求項27に記載の方法。
- 前記エストラジオールが質量分析前に誘導体化されない、請求項27〜28のいずれか
1項に記載の方法。 - 前記液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求
項27〜29のいずれか1項に記載の方法。 - 前記精製工程がさらに、高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)続いて、高速液体
クロマトグラフィー(HPLC)を含む、請求項27〜30のいずれか1項に記載の方法
。 - 前記試薬が塩である、請求項27〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項32に記載の方法。
- 前記エストラジオールイオンが、271.14±0.5、183.10±0.5、およ
び145.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される1つ以
上のイオンを含む、請求項27〜33のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イオン化工程が、271.14±0.5の質量/電荷比を有する前駆イオンを生成
する工程、ならびに183.10±0.5、および145.10±0.5の質量/電荷比
を有するイオンからなる群より選択される1つ以上の断片イオンを生成する工程を含む、
請求項27〜34のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試験サンプル中に存在するグルクロン酸化エストラジオールおよび非グルクロン酸
化エストラジオールの両方が前記方法によって検出および測定される、請求項27〜35
のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試験サンプルが体液である、請求項27〜36のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11/946,017 | 2007-11-27 | ||
US11/946,017 US20090134325A1 (en) | 2007-11-27 | 2007-11-27 | Methods for detecting estradiol by mass spectrometry |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017132534A Division JP6673875B2 (ja) | 2007-11-27 | 2017-07-06 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020112562A true JP2020112562A (ja) | 2020-07-27 |
JP7199392B2 JP7199392B2 (ja) | 2023-01-05 |
Family
ID=40668902
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010536104A Active JP5602636B2 (ja) | 2007-11-27 | 2008-11-24 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
JP2014167359A Active JP6176735B2 (ja) | 2007-11-27 | 2014-08-20 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
JP2017132534A Active JP6673875B2 (ja) | 2007-11-27 | 2017-07-06 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
JP2020037829A Active JP7199392B2 (ja) | 2007-11-27 | 2020-03-05 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010536104A Active JP5602636B2 (ja) | 2007-11-27 | 2008-11-24 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
JP2014167359A Active JP6176735B2 (ja) | 2007-11-27 | 2014-08-20 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
JP2017132534A Active JP6673875B2 (ja) | 2007-11-27 | 2017-07-06 | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20090134325A1 (ja) |
EP (4) | EP4250336A3 (ja) |
JP (4) | JP5602636B2 (ja) |
CN (2) | CN103323561B (ja) |
BR (1) | BRPI0819611A2 (ja) |
CA (1) | CA2706847C (ja) |
WO (1) | WO2009070539A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090134325A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-05-28 | Goldman Mildred M | Methods for detecting estradiol by mass spectrometry |
US8399829B2 (en) * | 2008-12-18 | 2013-03-19 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Vitamin B2 detection by mass spectrometry |
US20100155594A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-06-24 | Goldman Mildred M | Mass spectrometry assay for estrogenic compounds |
CN102175792B (zh) * | 2010-12-24 | 2012-04-25 | 北京师范大学 | 一种水环境中雌激素及壬基酚、辛基酚和双酚a的共检测方法 |
JP5664667B2 (ja) * | 2011-01-11 | 2015-02-04 | 株式会社島津製作所 | 質量分析データ解析方法、質量分析データ解析装置、及び質量分析データ解析用プログラム |
EP2673631B1 (en) * | 2011-02-07 | 2020-04-29 | Laboratory Corporation of America Holdings | Method for determining the presence or amount of testosterone in a sample |
CN102183606B (zh) * | 2011-03-02 | 2012-04-25 | 北京师范大学 | 一种水体沉积物中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚a的共检测方法 |
US8669519B2 (en) * | 2011-12-05 | 2014-03-11 | Quest Diagnostics Investments, Inc. | Methods for detecting reverse triiodothyronine by mass spectrometry |
US9404900B2 (en) * | 2012-12-21 | 2016-08-02 | Thermo Finnigan Llc | System for analysis of phase-I and phase-II metabolites and parent compounds without hydrolysis |
DE112015001964T5 (de) * | 2014-04-23 | 2017-02-02 | Micromass Uk Limited | Selbstkalibrierung von Spektren unter Verwendung bekannter Differenzen von Vorläufer-Masse-/Ladungsverhältnissen und Fragment-Masse-/ Ladungsverhältnissen |
WO2015175561A1 (en) * | 2014-05-12 | 2015-11-19 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Quantitation of tamoxifen and metabolites thereof by mass spectrometry |
CN105572238B (zh) * | 2014-10-16 | 2017-11-10 | 无锡市寰创环境科技发展有限公司 | 一种检测养殖废物中雌激素的方法 |
CN104678022A (zh) * | 2015-03-09 | 2015-06-03 | 黑龙江省乳品工业技术开发中心 | 一种产后奶牛泌乳中β-雌二醇含量消退的预测方法及应用 |
CN108459104A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-08-28 | 华南师范大学 | 一种检测鱼类胆汁中个人护理品的方法 |
CN110243917A (zh) * | 2018-03-09 | 2019-09-17 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种快速检测小分子化合物的方法 |
CN113711030A (zh) * | 2019-04-16 | 2021-11-26 | 美国控股实验室公司 | 用于通过lc-ms/ms检测11-氧代雄激素的方法和系统 |
CN111103380A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-05-05 | 南京希麦迪医药科技有限公司 | 一种液质联用测定人血浆中内源性雌二醇浓度的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040235193A1 (en) * | 2003-04-14 | 2004-11-25 | Soldin Steven J. | Steroid hormone analysis by mass spectrometry |
JP2005283380A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法 |
JP2006138786A (ja) * | 2004-11-15 | 2006-06-01 | Aska Pharmaceutical Co Ltd | 生体内微量エストラジオールの新規測定法 |
JP2007132741A (ja) * | 2005-11-09 | 2007-05-31 | Aska Pharmaceutical Co Ltd | ステロイドの測定方法 |
JP6176735B2 (ja) * | 2007-11-27 | 2017-08-09 | クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5605798A (en) * | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
DE69432791T2 (de) * | 1993-05-28 | 2004-06-03 | Baylor College Of Medicine, Houston | Verfahren und massenspektrometer zur desorption und ionisierung von analyten |
US5772874A (en) * | 1995-11-02 | 1998-06-30 | Cohesive Technologies, Inc. | High performance liquid chromatography method and apparatus |
ES2140209T3 (es) * | 1996-01-19 | 2000-02-16 | Cohesive Tech Inc | Procedimiento y dispositivo de cromatografia de liquidos de alto rendimiento. |
GB9717926D0 (en) * | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Micromass Ltd | Methods and apparatus for tandem mass spectrometry |
JP2002502086A (ja) * | 1998-01-23 | 2002-01-22 | アナリティカ オブ ブランフォード インコーポレーテッド | 表面からの質量分光測定 |
JP2000088834A (ja) * | 1998-09-16 | 2000-03-31 | Sumika Chemical Analysis Service Ltd | 分析方法 |
JP2001116736A (ja) * | 1999-10-21 | 2001-04-27 | Sumika Chemical Analysis Service Ltd | エストロゲンの分析方法 |
DE10028974A1 (de) * | 2000-06-16 | 2002-01-03 | Henkel Kgaa | Thixotrope Mund- und Zahnpflegemittel |
US6680203B2 (en) * | 2000-07-10 | 2004-01-20 | Esperion Therapeutics, Inc. | Fourier transform mass spectrometry of complex biological samples |
JP2002056040A (ja) * | 2000-08-14 | 2002-02-20 | Nec Corp | 3次元cadによるケーブルクランプとケーブルの形状設計方法およびコンピュータ読み取り可能な記録媒体 |
US6635173B2 (en) * | 2000-12-28 | 2003-10-21 | Cohesive Technologies, Inc. | Multi column chromatography system |
BR0206273A (pt) * | 2001-01-02 | 2006-11-21 | Cleveland Clinic Foundation | testes diagnósticos para caracterizar o risco de um paciente humano de desenvolver ou apresentar doença cardiovascular e para avaliar um agente terapêutico para doença cardiovascular em um sujeito suspeito de apresentar ou apresentando doença cardiovascular, e, kit |
JP2003090839A (ja) * | 2001-09-18 | 2003-03-28 | Toru Ueda | 内分泌攪乱物質群およびそれらの活性を指標とした生物系廃棄物処理物の評価方法 |
JP2003098169A (ja) * | 2001-09-25 | 2003-04-03 | Toru Ueda | 内分泌攪乱作用を指標とした穀類・青果物等の評価方法とその応用方法 |
JP2003342291A (ja) * | 2002-05-27 | 2003-12-03 | Sumika Chemical Analysis Service Ltd | エストラジオール抱合体 |
JP3844741B2 (ja) * | 2003-03-03 | 2006-11-15 | 株式会社荏原製作所 | 女性ホルモン分解細菌及びその用途 |
US6977143B1 (en) * | 2003-09-08 | 2005-12-20 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Determination of testosterone by mass spectrometry |
US8480742B2 (en) * | 2005-08-02 | 2013-07-09 | Perumala Corporation | Total artificial disc |
US8227259B2 (en) * | 2005-03-31 | 2012-07-24 | Georgetown University | Free thyroxine and free triiodothyronine analysis by mass spectrometry |
WO2007029668A1 (ja) * | 2005-09-08 | 2007-03-15 | National University Corporation Kanazawa University | ソフトイオン化法のための誘導体化試薬 |
CN1834641A (zh) * | 2006-04-14 | 2006-09-20 | 清华大学 | 水环境中极性内分泌干扰物采样监测方法及装置 |
WO2007139956A2 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Methods and systems for the quantitative analysis of biomarkers |
US8202736B2 (en) * | 2009-02-26 | 2012-06-19 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Method of hormone extraction using digital microfluidics |
-
2007
- 2007-11-27 US US11/946,017 patent/US20090134325A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-11-24 CN CN201310193851.8A patent/CN103323561B/zh active Active
- 2008-11-24 EP EP23186684.9A patent/EP4250336A3/en active Pending
- 2008-11-24 JP JP2010536104A patent/JP5602636B2/ja active Active
- 2008-11-24 EP EP08855326.8A patent/EP2231297B2/en active Active
- 2008-11-24 EP EP14169040.4A patent/EP2777792B1/en active Active
- 2008-11-24 BR BRPI0819611 patent/BRPI0819611A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-11-24 CA CA2706847A patent/CA2706847C/en active Active
- 2008-11-24 CN CN2008801251512A patent/CN101918098B/zh active Active
- 2008-11-24 EP EP18176001.8A patent/EP3388127B1/en active Active
- 2008-11-24 WO PCT/US2008/084561 patent/WO2009070539A1/en active Application Filing
-
2014
- 2014-08-20 JP JP2014167359A patent/JP6176735B2/ja active Active
-
2015
- 2015-03-02 US US14/635,586 patent/US20150309055A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-07-06 JP JP2017132534A patent/JP6673875B2/ja active Active
-
2020
- 2020-03-05 JP JP2020037829A patent/JP7199392B2/ja active Active
-
2022
- 2022-05-03 US US17/735,879 patent/US20220326260A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040235193A1 (en) * | 2003-04-14 | 2004-11-25 | Soldin Steven J. | Steroid hormone analysis by mass spectrometry |
JP2005283380A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法 |
JP2006138786A (ja) * | 2004-11-15 | 2006-06-01 | Aska Pharmaceutical Co Ltd | 生体内微量エストラジオールの新規測定法 |
JP2007132741A (ja) * | 2005-11-09 | 2007-05-31 | Aska Pharmaceutical Co Ltd | ステロイドの測定方法 |
JP6176735B2 (ja) * | 2007-11-27 | 2017-08-09 | クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MARIA J. LOPEZ DE ALDA(外3名): "Liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry of selected emerging pollutants (steroid sex hormon", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. vol. 1000, Issues 1-2, JPN6012068934, 6 June 2003 (2003-06-06), pages 503 - 526, ISSN: 0004519926 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2231297B1 (en) | 2014-05-21 |
JP2014238419A (ja) | 2014-12-18 |
JP6673875B2 (ja) | 2020-03-25 |
JP6176735B2 (ja) | 2017-08-09 |
CN101918098A (zh) | 2010-12-15 |
JP2011505013A (ja) | 2011-02-17 |
EP2777792B1 (en) | 2018-07-25 |
JP7199392B2 (ja) | 2023-01-05 |
WO2009070539A1 (en) | 2009-06-04 |
US20150309055A1 (en) | 2015-10-29 |
CN101918098B (zh) | 2013-06-19 |
US20220326260A1 (en) | 2022-10-13 |
JP2017198703A (ja) | 2017-11-02 |
EP3388127A1 (en) | 2018-10-17 |
BRPI0819611A2 (pt) | 2015-05-05 |
JP5602636B2 (ja) | 2014-10-08 |
EP2231297A1 (en) | 2010-09-29 |
EP2777792A3 (en) | 2015-01-14 |
CA2706847C (en) | 2020-10-13 |
CA2706847A1 (en) | 2009-06-04 |
EP2777792A2 (en) | 2014-09-17 |
EP4250336A2 (en) | 2023-09-27 |
EP3388127B1 (en) | 2023-08-23 |
EP4250336A3 (en) | 2023-11-01 |
CN103323561A (zh) | 2013-09-25 |
CN103323561B (zh) | 2019-05-07 |
EP2231297A4 (en) | 2011-04-20 |
US20090134325A1 (en) | 2009-05-28 |
EP2231297B2 (en) | 2017-03-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7199392B2 (ja) | 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 | |
JP6676088B2 (ja) | 質量分析によってエストロンを検出するための方法 | |
JP6151291B2 (ja) | 質量分析によるジヒドロテストステロンの検出法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200402 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200402 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200409 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210601 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210827 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211026 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211201 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220510 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220912 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220912 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20220928 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20221004 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221122 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221220 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7199392 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |