WO2007029668A1 - ソフトイオン化法のための誘導体化試薬 - Google Patents

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WO2007029668A1
WO2007029668A1 PCT/JP2006/317494 JP2006317494W WO2007029668A1 WO 2007029668 A1 WO2007029668 A1 WO 2007029668A1 JP 2006317494 W JP2006317494 W JP 2006317494W WO 2007029668 A1 WO2007029668 A1 WO 2007029668A1
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alkyl group
group
compound
formula
hydrogen
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PCT/JP2006/317494
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English (en)
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Inventor
Kazutake Shimada
Tatsuya Higashi
Tadashi Nishio
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National University Corporation Kanazawa University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/08—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms
    • C07D295/096—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms separated by carbocyclic rings or by carbon chains interrupted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/43—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C07C211/44—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton having amino groups bound to only one six-membered aromatic ring
    • C07C211/53—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton having amino groups bound to only one six-membered aromatic ring having the nitrogen atom of at least one of the amino groups further bound to a hydrocarbon radical substituted by amino groups

Definitions

  • the present invention relates to a derivative reagent for increasing detection sensitivity in mass spectrometric measurement of phenol compounds or amine compounds using a soft ion method.
  • Estrogens are biomolecules that are strong and have a physiological action as hormones and are essential for maintaining vital functions. Therefore, the in vivo level is useful information for clinical diagnosis, pathological analysis and pharmacotherapy.
  • estrogen derived from living wastewater in the environment there are concerns about the effects on the endocrine system of various animals.
  • human biochemical substances having a phenol structure typified by bisphenol A also have a strong endocrine disrupting action (environmental hormones), and are therefore interested in their environmental levels and dynamics. Thus, there is a need to measure various phenolic compounds present in living organisms or the environment.
  • Non-patent literature 1 Fermo I., Rubino F. M., Bolzacchini E., Arcelloni C, Paroni R., Bom ni P. A "J. Chromatogr. B, 433, 53-62, (1988).
  • An object of the present invention is to provide a means for enhancing detection sensitivity in mass spectrometry measurement using a phenolic compound and an amine compound using a soft ion method. Means for solving the problem
  • the present invention includes the following inventions.
  • X is a halogen
  • Y and Y are independently hydrogen or a -tro group (provided that Y and Y are hydrogen at the same time)
  • A is N or CH
  • Q is a C to C canoleylene group
  • R, R and R satisfy one of the following forces (a) to (c) (a) R and R are independently a C-C alkyl group, and R is hydrogen or C-C
  • 1 2 1 4 3 1 4 is an alkyl group
  • R and R are united to form a C to C alkylene group, and R is water.
  • R is the same as a C alkyl group, and R and R are combined to form a C to C alkyl group.
  • a derivatizing reagent for mass spectrometric measurement of phenol compounds or amine compounds using the soft ion method is provided.
  • the compound represented by the above formula (I) or a quaternized product thereof is a phenolic hydroxyl group or an amine compound of a phenol compound which is a detection target compound in the carbon to which the group X is bonded.
  • the group X and one of the hydroxyl group or amino group hydrogen are separated to form a covalent bond with the detection target compound, and the detection target compound is derivatized.
  • a derivatization reagent according to (1) which further comprises a quaternized product of the above compound having a counteranion in which a methyl group is added to the methyl-substituted N.
  • the phenol compound is an estrogen or a phenolic endocrine disrupting substance.
  • the derivatization reagent according to any one of (1) to (3).
  • X is a halogen
  • Y and Y are independently hydrogen or a -tro group (provided that Y and Y are hydrogen at the same time)
  • A is N or CH
  • Q is a C to C canoleylene group
  • R, R and R satisfy one of the following forces (a) to (c)
  • R and R are independently a C-C alkyl group, and R is hydrogen or C-C An alkyl group,
  • R and R are united to form a C to C alkylene group, and R is water.
  • R is the same as a C alkyl group, and R and R are combined to form a C to C alkyl group.
  • X is a halogen
  • Y and Y are independently hydrogen or a -tro group (provided that Y and Y are hydrogen at the same time)
  • A is N or CH
  • Q is a C to C canoleylene group
  • R, R and R satisfy one of the following forces (a) to (c)
  • R and R are independently a C-C alkyl group, and R is hydrogen or C-C An alkyl group,
  • R and R are united to form a C to C alkylene group, and R is water.
  • R is the same as a C alkyl group, and R and R are combined to form a C 1 to C alkyl group.
  • N 1- (5 Black mouth 2,4 dinitrophenol) N 2 , N 2 Dimethylolene 1,2 Propanadamine, N— (5—Black mouth 2,4 Dinitrophenol) 1-piperidineethanamine, N— (5—Black 1,2-diphenyl) ⁇ -Methyl 1—Pyrrolidine Ethanamine, 1— (5—Black 1,2,4 Di- Trophe) 1 4-methylpiperazine, ⁇ , ichi (5 black mouth 1, 2, 4 di-trophe) 1 ⁇ , ⁇ —jetyl 1, 2 ethenamine, ⁇ , ichi (5 black mouth 1, 2 4 di-trophyl) 1 1 ,, ⁇ ⁇ dimethyl 1, 2-ethanediamine, and ⁇ — (except 5—black mouth 1,4 nitrophenol) 1 1-pyrrolidine ethanol)) or R and R R is a C to C alkyl group in ⁇ substituted with
  • X ′ is fluorine, bromine or iodine
  • X ′ is fluorine, bromine or iodine
  • C 1 -C alkylene group means a carbon number of m or more and n or less.
  • the m n alkyl group refers to a linear or branched alkyl group having m or more and n or less carbon atoms.
  • the present invention provides a means for increasing detection sensitivity in mass spectrometry measurement using a phenolic compound and an amine compound using a soft ion method.
  • the derivatization reagent according to the present invention contains a compound represented by the formula (I):
  • A may be bonded to any of the 3, 5, and 6 positions relative to the group X on the benzene ring, but is most preferably bonded to the 5 position.
  • X is halogen, preferably chlorine or fluorine, particularly preferably fluorine.
  • Y and Y are independently hydrogen or a nitro group (provided that Y and Y are hydrogen at the same time)
  • Y and Y are both -tro groups.
  • A is N or CH, preferably N.
  • Q is preferably a C to C alkylene group, particularly a linear C to C alkylene group.
  • Methylene and ethylene are particularly preferred, with methylene, ethylene, n-propylene and n-butylene being preferred.
  • R and R forces are independently a C to C alkyl group, and R is hydrogen or C to C
  • R and R are united to form a C to C alkylene group, and R is water.
  • R is a C to C alkyl group, and R and R are combined to form a C to C alkyl group.
  • alkyl group and the “alkylene group” are preferably straight chains.
  • R and R are
  • R is preferably hydrogen.
  • R is preferably hydrogen.
  • R force is preferably methyl, ethyl, n-propyl or n-butyl, particularly preferably methyl or ethyl. R and R come together,
  • methylene or ethylene preferably forming n-, ethylene, n-propylene or n-butylene. Also, R and R are formed together
  • N is 11-henchylene
  • halogen X is particularly preferably fluorine, preferably fluorine or chlorine.
  • Mouth ferrule ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ —Jetiru 1, 2—ethanediamine), or
  • the method for producing the compound represented by the formula (I) is not particularly limited! A person skilled in the art can prepare all the compounds represented by the formula (I) by referring to specific synthesis procedures and technical common sense shown in the examples. For example, the compound represented by the formula (I) can be synthesized by carrying out the reaction represented by the following formula in a suitable solvent such as MeCN.
  • the compound represented by the above formula (I) can also be used as an acid addition salt.
  • the compound represented by the above formula (I) is a C to C alkyl group on N substituted with R and R.
  • quaternized product having a counter-on to which 4 is added. This is because quaternization increases detection sensitivity.
  • the quaternization may be performed before the derivative is formed by the reaction of the compound represented by the above formula (I) and the detection target compound (phenol compound or amine compound). And you can do it later
  • R is a linear C to C alkyl group, i.e. In particular, methyl, ethyl, n-propyl or n-butyl is preferred, and methyl or ethyl is particularly preferred. Furthermore, R is R is a linear C-C alkyl group
  • the quaternizing agent having the group R is not particularly limited, but typically an iodide of R (
  • a quaternizing agent can be used.
  • the quaternized product of the compound of the present invention usually has a counter-on derived from the quaternizing agent.
  • the quaternized compounds of the present invention are ⁇ , BF—
  • the counter-on derived from the quaternizing agent may be appropriately replaced with another key-on.
  • the detection target compound capable of increasing the detection sensitivity according to the present invention is not particularly limited as long as it is a compound belonging to a phenol compound or an amine compound.
  • “Phenol compound” means a compound having a phenolic hydroxyl group, specifically, in-vivo components such as estrogens (eg estrone and estradiol), catecholamines, and various herbal components such as polyphenols. Examples thereof include, but are not limited to, phenolic endocrine disruptors (also referred to as “environmental hormones”) such as bisphenols, halogenated phenols, and alkylphenols.
  • the “amine compound” means a compound having an amino group, and specifically includes, but is not limited to, proteins, peptides, amino acids, polyamines and the like.
  • Conditions for derivatization of the detection target compound with the derivatization reagent of the present invention are not particularly limited.
  • the phenolic hydroxyl group of the phenol compound or the amino group of the amine compound as the detection target compound is obtained on the carbon to which the group X is bonded.
  • a nuclear bond is formed and a covalent bond is formed between the detection target compound and the derivatization reagent by elimination of the group x and one of the hydroxyl group or amino group hydrogen. But you can.
  • the present invention is applicable to various fields such as medical care, environmental analysis, food inspection, industrial product inspection, etc., and phenols compounds or amines present in trace amounts in samples. It can be applied to measure compounds.
  • the method for measuring phenol compounds using the derivatizing reagent of the present invention can be used, for example, to measure estrone in pregnant woman's urine. Measurement of estrone in maternal urine is important for the diagnosis of fetal placental function.
  • immunoassay has been used for the measurement.
  • the method using immunoassay has a problem of cross-reactivity, and there is a problem that the reliability of the obtained quantitative value is low. For this reason, analysis by LCZMS has been attempted with higher selectivity.
  • estrone has low ion efficiency due to electrospray ionization (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization (APCI)! Therefore, urine samples of several hundred liters or more were required for estrone determination.
  • ESI electrospray ionization
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • the "soft ionization method” includes not only atmospheric ionization methods (API) such as electrospray ionization method (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization method (APCI), but also chemical ions.
  • API atmospheric ionization methods
  • ESI electrospray ionization method
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization method
  • examples include chemical method (CI), fast atom bombardment method (FAB), matrix-assisted laser ionization method (MALDI), and field desorption ionization method (FD).
  • the derivatization reagent according to the present invention is particularly suitable for the ESI method and the MALDI method.
  • the derivatized phenolic compound or amine compound is ionized by the soft ionization method and then separated by mass separation means.
  • mass separation means can be used.
  • magnetic field type single focusing type double focusing type using magnetic field
  • quadrupole type including ion trap
  • time of flight type time of flight type
  • ion cyclotron type etc.
  • the mass separation means may be any means as long as it can select and separate ions. Any number of these may be combined to increase the accuracy of ion separation! /.
  • N (5-Fluoro—2.4—Di-Trophenyl) —N.N—Jetyl—1.2—Ethanediamine Synthesis
  • LOD detection limit
  • DAS—C1 non-derivatized estrone and dansyl chloride
  • the composition of the mobile phase solvent was adjusted so that the retention times in the liquid chromatography of each measurement sample were almost the same.
  • N,-(5 Fluoro 2,4 di-trophenyl) N, N—Ethyl of 1-, 2-ethane diamine and 1 (5 Fluoro 2,4 dinitrophenol) -4-methyl-piperazine The quaternization of the derivative with methyl iodide was carried out by the following procedure. To a test tube with a stopper, acetone (40 ⁇ L) was added to an EtOH solution (10 L) of estrone (lOpg-lOOng). Next, an acetone solution (lmgZmL, 10 / zL) of the derivative reagent was added, and finally a 1M aqueous NaHCO solution (10 L) was added. Stir this with a vortex mixer to 60 ° C
  • the desired product was eluted with Et (lmL). After distilling off the solvent under a stream of nitrogen, methyl iodide (10 / z L) was added and reacted at 60 ° C for 30 minutes. Methyl iodide was distilled off under a stream of nitrogen, and it was dissolved in MeOH—10 mM ammonium formate aqueous solution (1: 1) (100 L), and this was analyzed as a sample solution by LCZESI-MSZMS.
  • Declustering potential 30 V (Table 4 experiment number 1) or 80V (Table 4 experiment numbers 2, 3, 4, 5, 6 and 7)
  • N,-(5 fluoro-2,4 dinitrophenol) quaternized compounds of N, N jetyl-1,2 ethanediamin (Table 4, Experiment No. 6) and 1— (5-fluoro-1,2,4 di-trophe) It was clear that quaternized 4-methyl monopiperazine (Experiment No. 7 in Table 4) was an excellent derivative reagent for improving the detection sensitivity of estrone.
  • LOD detection limit
  • Table 6 shows the detection limits (LOD) for estrone, estrone derivatives, estradiol, and estradiol derivatives.
  • LOD detection limits
  • Pregnant urine (10 was taken and internal deuterium labeled estrone (20 Opg) was added to the test tube with a stopper.
  • the urine from 16 weeks pregnant women and 37 weeks pregnant women was used.
  • methanol 100 ⁇ L
  • methanol 100 ⁇ L
  • the eluate was evaporated under a nitrogen stream, and the residue was subjected to the following derivatization reaction.
  • Acetone 40 L was added sequentially and heated at 60 ° C. After 1 hour, 50% methanol (400 L) was added to terminate the reaction, which was removed from the Strata—X cartridge for removal of NaHCO.
  • SRM Selective reaction monitoring
  • the urine samples from 16 and 37 week pregnant women were analyzed 5 times according to the above procedure, and the peak area ratio between estrone and internal standard was measured.
  • the area specific force was also calculated as the estrone concentration (ngZmL) using the calibration curve.
  • the average value, standard deviation, and coefficient of variation (standard deviation Z average value X 100) of the estrone concentration calculated in this way are summarized in Tables 7 and 8. As shown in Tables 7 and 8, the reproducibility of the method for measuring estrone concentration according to the present invention was very high.

Description

明 細 書
ソフトイオン化法のための誘導体化試薬
技術分野
[0001] 本発明はフエノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物のソフトイオンィ匕法を用いた質量 分析測定において検出感度を高めるための誘導体ィ匕試薬に関する。
背景技術
[0002] エストロゲン（エストロン，エストラジオールなど）は、ホルモンとして超微量で強 、生 理作用を有し、生命機能維持に不可欠な生体分子である。従ってその生体内レベル は、臨床診断、病態解析や薬物療法上有用な情報となる。また、環境中にも主に生 活廃水由来のエストロゲンが存在し、各種動物の内分泌系への影響が懸念されてい る。さらにビスフエノール Aに代表されるフエノール構造を有する人エイ匕学物質も強い 内分泌撹乱作用を有することから (環境ホルモン）、これらの環境中レベル及び動態 に関心が持たれている。このように、生体又は環境中に存在する各種フエノール類化 合物を測定することの必要性が存在する。
[0003] 一方、タンパク質、ペプチド、アミノ酸等のアミノ基を有する各種アミン類ィ匕合物も生 体内や環境中で重要な役割を果たすことが周知である。またアミン類ィ匕合物の一つ であるポリアミン類は腫瘍マーカーとなり得ることが知られている。従って、生体又は 環境中に存在するアミン類ィ匕合物の測定手法の確立もまた急がれて ヽる。
[0004] 現在、生体試料及び環境試料中のフエノール類化合物、アミン類化合物等の生理 活性物質の分析には、特異性に優れる高速液体クロマトグラフィー Z質量分析 (LC /MS)が汎用されている。中でもエレクトロスプレーイオン化（ESI)法等のソフトィォ ン化法と組合されたそれは、操作性や汎用性が高ぐ微量成分分析のファーストチヨ イスの地位を確立したと言っても過言ではない。し力し、フエノール類化合物、ァミン 類化合物等はソフトイオン化法におけるイオン化効率が低ぐ十分な応答を示さない という問題がある。
[0005] 上記問題を克服することを目指して、ソフトイオン化法の特性に着目した分析対象 化合物の誘導体化法等の新規手法の開発が盛んに行われている。 [0006] フエノール類ィ匕合物及びアミン類ィ匕合物のための既存の誘導体ィ匕試薬としては、 5 —ジメチルァミノナフタレン一 1—スルホ-ルクロリド（ダンシルクロリド（DNS— C1) )や 、N, N—ジェチル— 2, 4—ジニトロ— 5—フルォロア-リン（非特許文献 1)が知られ ている。し力しながら、それらの既存の試薬による検出感度の向上の程度は満足でき るものではない。
非特干文献 1 : Fermo I., Rubino F. M., Bolzacchini E., Arcelloni C, Paroni R., Bom ni P. A" J. Chromatogr. B, 433, 53-62, (1988).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、フエノール類ィ匕合物及びアミン類ィ匕合物のソフトイオンィ匕法を用いた質 量分析測定における検出感度を高めるための手段を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0008] 本発明は以下の発明を包含する。
[0009] (1)式 (I)
[化 1]
Figure imgf000004_0001
[0010] (式中、
Xはハロゲンであり、
Y及び Yは、独立に、水素又は-トロ基であり（但し Yと Yとが同時に水素である
1 2 1 2
ことはない）、
Aは N又は CHであり、
Qは C〜Cァノレキレン基であり、
1 4
R、 R及び Rは以下の（a)〜（c)の何れ力 1つを満たすものである (a) R及び Rは、独立に、 C〜Cアルキル基であり、且つ、 Rは水素又は C〜C
1 2 1 4 3 1 4 アルキル基である、
(b) Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキレン基を形成しており、且つ、 Rは水
1 2 2 5 3 素又は c〜cアルキル基である、
1 4
(c) Rはじ〜Cアルキル基であり、且つ、 Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキ
1 1 4 2 3 1 4 レン基を形成している）
で表される化合物、又は前記 R及び Rで置換された Nに C〜Cアルキル基である
1 2 1 4
Rが付加された、カウンターァ-オンを有する前記化合物の四級化物を含有する、
4
フエノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物のソフトイオンィ匕法を用いた質量分析測定 のための誘導体化試薬。
[0011] 上記式 (I)で表される化合物又はその四級化物は、基 Xが結合した炭素において、 検出対象化合物であるフエノール類ィ匕合物のフエノール性水酸基又はアミン類ィ匕合 物のアミノ基による求核反応を受け、基 Xと、水酸基又はアミノ基の水素の一つとが離 脱して、該検出対象化合物と共有結合を形成して、該検出対象化合物を誘導体ィ匕 する。
[0012] (2)式（Π)
[化 2]
Figure imgf000005_0001
[0013] (式中 Xはハロゲンである）
で表される化合物、又はジメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウ ンターァニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、 (1)記載の誘導体化試 薬。
[0014] (3)式（ΙΠ)
Figure imgf000006_0001
(式中 Xはハロゲンである）
で表される化合物、又はメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウン ターァニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、（1)記載の誘導体化試薬
[0016] (4)前記フエノール類ィ匕合物がエストロゲン又はフエノール性内分泌撹乱物質である
(1)〜（3)の何れかに記載の誘導体化試薬。
[0017] (5)前記ソフトイオン化法がエレクトロスプレーイオン化法である（1)〜（4)の何れか に記載の誘導体化試薬。
[0018] (6)式（I)
[化 4]
Figure imgf000006_0002
[0019] (式中、
Xはハロゲンであり、
Y及び Yは、独立に、水素又は-トロ基であり（但し Yと Yとが同時に水素である
1 2 1 2
ことはない）、
Aは N又は CHであり、
Qは C〜Cァノレキレン基であり、
1 4
R、 R及び Rは以下の（a)〜（c)の何れ力 1つを満たすものである
1 2 3
(a)R及び Rは、独立に、 C〜Cアルキル基であり、且つ、 Rは水素又は C〜C アルキル基である、
(b) Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキレン基を形成しており、且つ、 Rは水
1 2 2 5 3 素又は c〜cアルキル基である、
1 4
(c) Rはじ〜Cアルキル基であり、且つ、 Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキ
1 1 4 2 3 1 4 レン基を形成している）
で表される化合物、又は前記 R及び Rで置換された Nに C〜Cアルキル基である
1 2 1 4
Rが付加された、カウンターァ-オンを有する前記化合物の四級化物と、フエノール
4
類化合物又はアミン類化合物とを反応させて誘導体を形成させた後に、ソフトイオン 化法を用いた質量分析測定を行なう、フエノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物の測 定方法。
[0020] (7)前記式 (I)で表される化合物と、フ ノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物とを反 応させて誘導体を形成させた後に、 C〜Cアルキル基を有する四級化剤を用いて
1 4
前記 R及び Rで置換された Nを四級化する工程を更に含む、（6)記載の方法。
1 2
[0021] (8)式（I)
[化 5]
Figure imgf000007_0001
[0022] (式中、
Xはハロゲンであり、
Y及び Yは、独立に、水素又は-トロ基であり（但し Yと Yとが同時に水素である
1 2 1 2
ことはない）、
Aは N又は CHであり、
Qは C〜Cァノレキレン基であり、
1 4
R、 R及び Rは以下の（a)〜（c)の何れ力 1つを満たすものである
1 2 3
(a)R及び Rは、独立に、 C〜Cアルキル基であり、且つ、 Rは水素又は C〜C アルキル基である、
(b) Rと Rとが一体となって、 C 〜Cアルキレン基を形成しており、且つ、 Rは水
1 2 2 5 3 素又は c 〜cアルキル基である、
1 4
(c) Rはじ〜Cアルキル基であり、且つ、 Rと Rとが一体となって、 C 〜Cアルキ
1 1 4 2 3 1 4 レン基を形成している）
で表される化合物（但し、 N1- (5 クロ口 2, 4 ジニトロフエ-ル） N2, N2 ジメ チノレー 1, 2 プロパンジァミン、 N— (5—クロ口一 2, 4 ジニトロフエ-ノレ）一 1—ピ ペリジンエタンァミン、 N— (5—クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル） α—メチル一 1— ピロリジンエタンァミン、 1— (5—クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル）一 4—メチルーピべ ラジン、 Ν，一（5 クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル）一 Ν, Ν—ジェチルー 1, 2 エタ ンジァミン、 Ν，一（5 クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル）一 Ν, Ν ジメチル一 1, 2- エタンジァミン、及び Ν— (5—クロ口一 2, 4 ジニトロフエ-ル）一 1—ピロリジンエタ ンァミンを除く）、又は前記 R及び Rで置換された Νに C 〜Cアルキル基である R
1 2 1 4 4 が付加された、カウンターァ-オンを有する前記化合物の四級化物。
[0023] (9)式（IV)
[化 6]
Figure imgf000008_0001
[0024] (式中 X'はフッ素、臭素又はヨウ素である）
で表される化合物、又はジメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウ ンターァニオンを有する前記化合物の四級化物。
[0025] (10)式 (V)
Figure imgf000009_0001
[0026] (式中 X'はフッ素、臭素又はヨウ素である）
で表される化合物、又はメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウン ターァニオンを有する前記化合物の四級化物。
[0027] なお、本明細書にぉ 、て「C 〜Cアルキレン基」とは炭素数 m個以上 n個以下の
m n
直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を指す。また「C 〜C
m nアルキル基とは炭素数 m個以 上 n個以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を指す。
発明の効果
[0028] 本発明により、フエノール類ィ匕合物及びアミン類ィ匕合物のソフトイオンィ匕法を用いた 質量分析測定における検出感度を高めるための手段が提供される。
[0029] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-261023号の明細書 に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
[0030] 本発明に係る誘導体化試薬は式 (I)で表される化合物を含有することを特徴とする
[化 8]
Figure imgf000009_0002
[0031] 式 (I)中の各基について以下に説明する。
[0032] Aはベンゼン環上で基 Xに対して 3、 5、 6位の何れの位置に結合していてもよいが 、 5位に結合していることが最も好ましい。 [0033] Xはハロゲン、好ましくは塩素又はフッ素、特に好ましくはフッ素である。
[0034] Y及び Yは、独立に、水素又はニトロ基であり（但し Yと Yとが同時に水素である
1 2 1 2
ことはない）、好ましくは Y及び Yは共に-トロ基である。
1 2
[0035] Aは N又は CH、好ましくは Nである。
[0036] Qは C〜Cアルキレン基、特に直鎖の C〜Cアルキレン基が好ましい。具体的に
1 4 1 4
はメチレン、エチレン、 n—プロピレン、 n—ブチレンが好ましぐメチレン及びエチレン が特に好ましい。
[0037] R、 R及び Rにつ!/、ては下記（a)〜（c)：
1 2 3
(a) R及び R力 独立に、 C〜Cアルキル基であり、且つ、 Rが水素又は C〜C
1 2 1 4 3 1 4 アルキル基である場合；
(b) Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキレン基を形成しており、且つ、 Rが水
1 2 2 5 3 素又は c〜 アルキル基で
1 c ある場合；
4
(c) Rが C〜Cアルキル基であり、且つ、 Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキ
1 1 4 2 3 1 4 レン基を形成している場合；
の何れかの場合があり得る。何れの場合も、「アルキル基」及び「アルキレン基」は直 鎖であることが好ましい。
[0038] 上記（a)の場合。 R及び R力 独立に、メチル、ェチル、 n—プロピル又は n—ブチ
1 2
ルであることが好ましぐ特にメチル又はェチルであることが好ましい。 R及び Rは互
1 2 いに同一の基であることがより好ましい。 Rは水素であることが好ましい。
3
[0039] 上記（b)の場合。 Rと Rとが一体となって、エチレン、 n—プロピレン、 n—ブチレン
1 2
又は n—ペンチレンを形成していることが好ましい。 Rは水素であることが好ましい。
3
[0040] 上記（c)の場合。 R力メチル、ェチル、 n—プロピル又は n—ブチルであることが好 ましぐメチル又はェチルであることが特に好ましい。 Rと Rとが一体となって、メチレ
2 3
ン、エチレン、 n—プロピレン又は n—ブチレンを形成していることが好ましぐメチレン 又はエチレンを形成していることが特に好ましい。また、 Rと Rとが一体となって形成
2 3
するアルキレン基力 前記 Qと同一のアルキレン基であることがより一層好ましい。
[0041] 式 (I)における各基の特に好ま U、組合せを次表に示す。
[表 1] X A Q . R2
1 ハロケ'ン 二 ニトロ 5位， 直鎖 Cに 直鎖 - c4 R iと同一 水素
N アルキレン アルキル の直鎖 Cに
2 Λロケ'ン 二 ニトロ 5位， エチレン メチル又はェチ Rtと同一 水素
N ル
3 Λロケ'ン ニト D 二 5位， 直鎖 C, - c4 R!と R2とで 水素
N アルキレン 直鎖 -(；57ルキレン
4. 赠'ン 二 ニトロ 5位， エチレン と R2とで n-フ'チレン又 水素
N は 11-へ'ンチレン
5 Λ。ケ'ン ニト D ニト π 5位， 直鎖 ( C4 直鎖 C, - C4 R2と R3とで Qと同一の
N アルキレン アルキル 直鎖 C〗- C4アルキレン
6 Λロケ 'ン ニト Π ニトロ 5位， エチレン ヌチル又は:!:チ R2と R3とで Iチレン
N ル
[0042] 表 1に示す各組合せにおいてハロゲン Xはフッ素又は塩素が好ましぐフッ素が特 に好ましい。
[0043] 本発明にお 、て最も好ま 、化合物は、
式 (II)
[化 9]
Figure imgf000011_0001
(式中 Xはハロゲンである）
で表される化合物、特に Xがフッ素である化合物 (Ν'—（5—フルォロ
口フエ-ル）一 Ν, Ν—ジェチルー 1, 2—エタンジァミン）、又は
式 (III)
Figure imgf000012_0001
[0045] (式中 Xはハロゲンである）
で表される化合物、特に Xがフッ素である化合物（1一（5 フルオロー 2, 4 ジニトロ フエニル） 4—メチルーピペラジン）である。
[0046] 上記式 (I)で表される化合物の製造方法は特に限定されな!、。当業者であれば実 施例に示す具体的な合成手順と技術常識とを参照することにより、式 (I)で表される 全ての化合物を製造することが可能である。例えば、以下の式で示す反応を MeCN 等の適切な溶媒中であり行うことにより式 (I)で表される化合物を合成することができ る。
[化 11]
Figure imgf000012_0002
(I)
[0047] (反応式中、各置換基は式 (I)について定義した通りである）
上記式 (I)で表される化合物は酸付加塩として用いられることもできる。
[0048] 上記式 (I)で表される化合物は、 R及び Rで置換された Nに C〜Cアルキル基で
1 2 1 4
ある R
4が付加された、カウンターァ-オンを有する四級化物の形態で使用することが より好ましい。四級化することにより検出感度が高まるからである。力かる四級化は、 上記式 (I)で表される化合物と検出対象化合物 (フエノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕 合物）との反応により誘導体を形成する前に行なってもよいし、後に行なってもよいが
、誘導体形成反応後に行なうことが好ましい。 Rは直鎖の C〜Cアルキル基、すな わちメチル、ェチル、 n—プロピル又は n—ブチルであることが好ましぐ特にメチル又 はェチルであることが好ましい。更にまた、 Rは、 Rが直鎖 C〜Cアルキル基である
4 1 1 4
場合 (例えば表 1の組合せ 5及び 6の場合）には、 Rと同一の基であることが好ましぐ R及び Rが同一の直鎖 C〜Cアルキル基である場合 (例えば表 1の組合せ 1及び 2
1 2 1 4
の場合）には、 R及び Rと同一の基であることが好ましい。
1 2
[0049] 基 Rを有する四級化剤としては、特に限定されないが、典型的には Rのヨウ化物（
4 4 例えばヨウ化メチル、ヨウ化工チル、ヨウ化 n—プロピル、ヨウ化 n—ブチル）のほか、ト リメチルォキソニゥム ·三フッ化ホウ素錯体 [OMe，BF ]、ジメチル硫酸 [ (MeO) S
3 3 2
O ]、ジメチル炭酸 [ (MeO) CO]、メチルトリフラー KMeOSO CF ]等の通常用い
2 2 2 3
られる四級化剤を用いることができる。本発明の化合物の四級化物は通常は四級化 剤に由来するカウンターァ-オンを有する。例えば四級化剤としてヨウ化アルキル、ト リメチルォキソ-ゥム'三フッ化ホウ素錯体、ジメチル硫酸、ジメチル炭酸、メチルトリフ ラートを用いた場合、本発明の化合物の四級化物は、それぞれ Γ、 BF―
3 、 MeOSO
―、 MeOCO―、 CF SO—をカウンターァニオンとして有する。また、本発明の化合
3 2 3 3
物の四級化物では、四級化剤に由来するカウンターァ-オンは適宜他のァ-オンに 置換されてもよい。
[0050] 本発明より検出感度を高めることができる検出対象化合物は、フエノール類ィ匕合物 又はアミン類ィ匕合物に属する化合物であれば特に限定されない。「フエノール類化合 物」とはフ ノール性水酸基を有する化合物を意味し、具体的にはエストロゲン類 (例 えばエストロン、エストラジオール）、カテコールアミン類等の生体内成分、ポリフエノ ール類等の各種生薬成分、ビスフエノール類、ハロゲン化フエノール類、アルキルフ ェノール類等のフエノール性内分泌撹乱物質（「環境ホルモン」とも称される）が挙げ られるがこれらには限定されない。「アミン類ィ匕合物」とはアミノ基を有する化合物を意 味し、具体的にはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリアミン類等が挙げられるがこれ らには限定されない。
[0051] 検出対象化合物の、本発明の誘導体化試薬による誘導体化の条件は特に限定さ れない。本発明の誘導体化試薬における基 Xが結合した炭素に、検出対象化合物 であるフエノール類ィ匕合物のフエノール性水酸基又はアミン類ィ匕合物のアミノ基が求 核反応し、基 xと、水酸基又はアミノ基の水素の一つとが離脱することにより、検出対 象化合物と誘導体化試薬との間に共有結合が形成される条件であればどのような条 件でもよい。
[0052] 本発明は、診療、環境の分析、食品の検査、工業製品の検査等の様々な分野にお V、て、サンプル中に微量に存在するフエノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物を測定 するために応用することができる。本発明の誘導体化試薬を用いたフエノール類ィ匕 合物の測定方法は、例えば、妊婦尿中のエストロンを測定するために使用できる。妊 婦尿中のエストロンの測定は胎児 胎盤系機能の診断に重要である。従来、その測 定にはィムノアツセィが用いられて 、るが、ィムノアツセィを用いた方法は交差反応性 の問題を有し、得られる定量値の信頼性は低いという問題があった。このためより選 択性の高 、LCZMSによる分析が試みられて 、る。しかしエストロンはエレクトロスプ レーイオンィ匕法 (ESI)や大気圧化学イオン化法 (APCI)によるイオンィ匕効率が低!、 ため、エストロンの定量には数 100 L以上の尿サンプルが必要であった。本発明の 誘導体化試薬を用いると、エストロンの微量検出が可能となる。このため尿中エストロ ンの分析が 10 Lのサンプル量で可能となり、従来法と比べて大幅にサンプル量を 減らすことができる。
[0053] 本発明にお!/、て「ソフトイオン化法」としては、エレクトロスプレーイオン化法 (ESI)、 大気圧化学イオン化法 (APCI)等の大気圧イオン化法 (API)のほかに、化学イオン 化法 (CI)、高速原子衝撃法 (FAB)、マトリクス支援レーザーイオンィ匕法 (MALDI) 、電界脱離イオン化法 (FD)等が挙げられる。本発明に係る誘導体化試薬は、特に E SI法及び MALDI法に適したものである。
[0054] 誘導体化されたフエノール類化合物又はアミン類化合物は、上記ソフトイオン化法 によりイオン化された後、質量分離手段により分離される。質量分離手段としては種 々のものが利用可能である。例えば、磁場型の単収束タイプのもの、磁場電場を用 いた二重収束タイプのもの、四重極型 (イオントラップを含む）のもの、飛行時間型の もの、イオンサイクロトロン型のもの等が挙げられるが、質量分離手段はイオンを選択 、分離できるものであれば何れの手段であってもよい。また、これらをいくつ力組み合 わせてイオンの分離の精度を増大させても構わな!/、。 [0055] 以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の具体的な記載により 限定されるものではない。
実施例 1
[0056] N，—（5—フルォロ— 2.4—ジ-トロフエ-ル）— N. N—ジェチル— 1.2—エタンジ ァミンの合成
1, 5—ジフルオロー 2, 4—ジ-トロベンゼン（lOOmg, 0.49mmol)を MeCN(l. OmL)に溶解した。そこへ N, N—ジメチルエチレンジァミン（26. 0.25mmol
)を滴下し室温で 30分攪拌した。反応終了後、窒素気流下、溶媒を留去した。粗生 成物をシリカゲルクロマトグラフィー [移動相： CHC1—MeOH (20： 1)から（8： 1)へ]
3
に付して黄色固体（30mg)を得た。更に 2—プロパノールで再結晶を行い、黄色結 晶を得た。
[0057] mpl31-132°C.1H-NMR(270MHz, CDC1 ) δ :2.32 (6Η, s), 2.67(2
3
Η, t, J = 6Hz), 3.34 (2H, q, J = 6Hz), 6.56(1H, d, J=15Hz), 9.0(1H, b rs), 9.15(1H, d, J = 9Hz). EI -MS m/z 272 [M] + .
実施例 2
[0058] 1— (5—フルオロー 2.4—ジニトロフエニル）ー4ーメチルーピペラジンの合成
1, 5—ジフルオロー 2, 4—ジ-トロベンゼン（lOOmg, 0.49mmol)を MeCN(l. OmL)に溶解し、そこへ 1—メチルビペラジン（27.2 L, 0.25mmol)を滴下し、室 温で 30分撹拌した。反応終了後、窒素気流下、溶媒を留去した。粗生成物をシリカ ゲルクロマトグラフィー [CHC1 -MeOH (20： 1) ]に付して黄色オイル（64mg)を得
3
た。更にへキサンで再結晶を行い、黄色針状物を得た。
[0059] mp78-79°C.1H-NMR(270MHz, CDC1 ) δ :2.37 (3Η, s), 2.57 (4Η, t
3
, J = 6Hz), 3.29 (4H, t, J = 6Hz), 6.80(1H, d, J=15Hz), 8.71 (1H, d, J = 9Hz). EI -MS m/z 284 [M] + .
実施例 3
[0060] 本発明の化合物により誘導体化されたエストロンの枪出感度の確認
N，一（5—フルォロ一 2, 4—ジ-トロフエ-ル）一 N, N—ジェチル一 1, 2—ェタン ジァミン及び 1ー（5—フルオロー 2, 4—ジニトロフエ-ル）ー4ーメチルーピペラジン 並びにこれらの四級化物により誘導体化されたエストロンの LCZESI— MS/MSに よる分析における検出感度を確認した。
[0061] 検出感度は測定試料の検出限界 (LOD) (S/N = 5) (単位: pg)を指標に評価し た。比較のために、誘導体化していないエストロン並びにダンシルクロリド（DNS— C1
)及び N, N ジェチルー 2, 4 ジ-トロー 5 フルォロア-リンで誘導体化したエス トロンについても同様の条件で検出限界を確認した。
[0062] LCZESI— MSZMSにおける測定試料の検出限界量は、液体クロマトグラフィー での保持時間 (t )が短いほど小さくなる (すなわち感度が上がる)。そこで、保持時間
R
の相違による検出限界への影響を取り除くために、各測定試料の液体クロマトグラフ ィ一での保持時間がほぼ同じになるように移動相溶媒の組成を調整した。
[0063] N， - (5 フルォロ一 2, 4 ジ-トロフエ-ル） N, N—ジェチル一 1, 2 ェタン ジァミン及び 1 （5 フルオロー 2, 4 ジニトロフエ-ル）ー4ーメチルーピペラジン のエストロン誘導体のヨウ化メチルによる四級化は次の手順で行った。共栓付試験管 にエストロン（lOpg— lOOng)の EtOH溶液（10 L)にアセトン（40 μ L)を加えた。 次に、前記誘導体ィ匕試薬のアセトン溶液（lmgZmL, 10 /z L)を加え、最後に 1M NaHCO水溶液（10 L)をカ卩えた。これをボルテックスミキサーで撹拌し、 60°Cに
3
て 60分間反応させた。 50% MeOH (500 μ L)を加えて反応を停止後、予め AcO Et (2mL)、 MeOH (2mL)及び H O (2mL)で順次コンディショニングした strata—
2
Xカートリッジに通導し、脱塩操作を行った。すなわち， H 0 (2mL)で洗浄後、 AcO
2
Et (lmL)で目的物を溶出させた。窒素気流下溶媒を留去後、ヨウ化メチル（10 /z L )を加え、 60°Cにて 30分間反応させた。窒素気流下、ヨウ化メチルを留去し、 MeOH — 10mMギ酸アンモ-ゥム水溶液（1 : 1) (100 L)に溶解し、これを試料溶液として LCZESI - MSZMSで分析した。
[0064] LCZESI— MSZMSの測定条件を表 2に、本実験に使用した主な試薬等の入手 先を表 3に、実験結果を表 4にそれぞれ示す。
[表 2] Instrument Applied Biosystems API 2000 with Shiraadzu LC-10AT chromatograph
Column CAPCELL PAK C18 (資生堂） （5 ju m, 150 X 2 mm i. d. )
Mobi le phase e0H-10 mM HC02NH4
Flow rate 0. 2 mL/min
Column temperature 40。 C
Declustering potential 30 V (表 4実験番号 1) 又は 80V (表 4実験番号 2， 3, 4, 5, 6及ぴ 7)
Focusing potential 380 V (表 4実験番号 1及ぴ 2)， 250V (表 4実験番号 3， 4， 5, 6及び 7)
Entrance potential 10 V
Curtain gas 45 psi
Turbo gas temperature 500。 C
Ion source gas 1 80 psi
Ion source gas 2 80 psi
Interface heater on 3]
1, 5-ジフルォロ- 2, 4-ジニトロベンゼン 東京化成工業株式会社
N. N-ジメチルェチレンジァミン 東京化成工業株式会社
1-メチルピペラジン ナカライテスク株式会社
ヨウ化メチル ナカライテスク株式会社
ギ酸アンモニゥム 和光純薬工業株式会社
アセトン 和光純薬工業株式会社
ァセトニトリル 関東化学株式会社
メタノ一ル ナカライテスク株式会社
クロ口ホルム 和光純薬工業株式会社
へキサン 和光純薬工業株式会社
鲊酸ェチル 和光純薬工業株式会社
Strata- X 島津 GLC
[¾4]
Figure imgf000018_0001
N，一（5 フルォロ一 2, 4 ジニトロフエ-ル） N， N—ジェチルー 1 , 2 ェタン ジァミン（表 4実験番号 4)及び 1一（5 フルオロー 2, 4 ジニトロフエ-ル） 4ーメ チルーピペラジン (表 4実験番号 5)は、エストロンの検出感度向上のための誘導体ィ匕 試薬として、既存の誘導体ィ匕試薬であるダンシルクロリド (表 4実験番号 2)及び N， N ジェチル 2, 4 ジ-トロー 5 フルォロア-リン（表 4実験番号 3)と同等またはよ り優れたものであることが明ら力となった。また、 N， - (5 フルオロー 2, 4 ジニトロ フエ-ル）—N, N ジェチルー 1, 2 エタンジァミンの四級化物（表 4実験番号 6) 及び 1— (5—フルォロ一 2, 4 ジ-トロフエ-ル） 4—メチル一ピペラジンの四級 化物（表 4実験番号 7)はエストロンの検出感度向上のための誘導体ィ匕試薬として特 に優れたものであることが明ら力となった。
実施例 4
[0066] 1 （5 フルオロー 2. 4 ジニトロフエニル）ー4ーメチルーピペラジンの四級化物に より謙 体化されたエストロン及びエストラジオールの檢屮 度の確認
1 （5 フルオロー 2, 4 ジ-トロフエ-ル）ー4ーメチルーピペラジンの四級化物 により誘導体化されたエストロン及びエストラジオールの LCZESI— MSZMSによ る分析における検出感度を確認した。
[0067] 検出感度は測定試料の検出限界 (LOD) (S/N = 5) (単位: fmol又は pg)を指標 に評価した。
[0068] 本実施例におけるエストロン及びエストラジオールの誘導体ィ匕反応のスキームは以 下の通りである。
[化 12]
ル) -
Figure imgf000020_0001
エストロン エストロン誘導体
Figure imgf000020_0002
エストラジオール エストラジオ一ル誘導体
1— (5—フルオロー 2, 4 ジニトロフエ-ル） 4—メチルーピペラジンのエストロン 及びエストラジオール誘導体のヨウ化メチルによる四級化は次の手順で行った。共栓 付試験管にエストロン又はエストラジオール（10— 100pg)の EtOH溶液（10 /z L)に アセトン (40 L)をカ卩えた。次に、前記誘導体化試薬のアセトン溶液（1 gZ レ 10 L)を加え、最後に 1M NaHCO水溶液（10 L)をカ卩えた。これをボルテック
3
スミキサーで撹拌し、 60°Cにて 60分間反応させた。 50% MeOH (500 μ L)をカロえ て反応を停止後、予め AcOEt (2mL)、 MeOH (2mL)及び H 0 (2mL)で順次コン
2
ディショユングした Strata— Xカートリッジに通導し、脱塩操作を行った。すなわち H
2
0 (2mL)で洗浄後、 AcOEt (lmL)で目的物を溶出させた。窒素気流下溶媒を留 去後、ヨウ化メチル（100 L)を加え、 60°Cにて 30分間反応させた。窒素気流下、ョ ゥ化メチルを留去し、 MeOH— 10mMギ酸アンモ-ゥム水溶液（1： 1、 vZv、 100 μ L)に溶解し、これを試料溶液として LC,ESI— MSで分析した。 LC,ESI— MSの 測定条件を表 5に示す。
[表 5]
Figure imgf000021_0001
エストロン、エストロン誘導体、エストラジオール及びエストラジオール誘導体のそれ ぞれの検出限界（LOD)を表 6に示す。表 6に示される通り、 1一（5 フルオロー 2, 4 ジニトロフエニル） 4 メチル ピぺラジンの四級化物による誘導体化によりエス トロンの検出感度は 2300倍向上し、エストラジオールの検出感度は 4000倍向上し た。
[表 6]
検出イオン 保持時間 LOD 感度の比
(へ"ースイオン， m/z) (分） (S/N-5) エス卜ロン 271. 1 [M+H] + 5. 9 1300 fmol (350 pg) 1 ェスト ン誘導体 549. 3 [M] + 6. 4 0. 55 fmol (0. 15 pg) 2300 エストラシ"オール 273. 3 [M+H] + 5. 7 2200 fmol (600 pg) 1 エストラ オ-ル誘導体 551. 3 [M] + 6. 1 0. 55 fmol (0. 15 pg) 4000 実施例 5
妊婦尿中のエストロン及びエストラジオールの枪出
共栓付試験管に妊婦尿（10 をとり、内部標準として重水素標識エストロン (20 Opg)を加えた。妊婦尿としては、 16週の妊婦及び 37週の妊婦からの尿を使用した。 この混合物にメタノール（100 μ L)を加え、ボルテックスミキサーにて攪拌を行い遠心 分離（lOOOg, 5分間）した。上清を水（400 L)で希釈し、 Strata— Xカートリッジに 付した。水（2mL)、 30%メタノール（2mL)で順次洗浄後、酢酸ェチル（lmL)で溶 出を行った。溶出液を窒素気流下にて溶媒留去し、残渣を以下の誘導体化反応に 付した。
[0072] 上記残渣に 1 （5 フルオロー 2, 4 ジニトロフエ-ル）ー4ーメチルーピペラジン
(： gZ Lになるよう調製したアセトン溶液を 40 L)、 1M NaHCO ( 10 L)、
3
アセトン (40 L)を順次カ卩え、 60°Cで加熱した。 1時間後、 50%メタノール (400 L )を加えて反応を終了し、 NaHCOの除去を行うため、これを Strata— Xカートリッジ
3
に付した。水（2mL)で洗浄後、酢酸ェチル（lmL)で溶出し、窒素気流下にて溶媒 留去した。得られた残渣にヨウ化メチル（200 L)を加え、 60°C、 30分加熱後、窒素 気流下にてヨウ化メチルの除去を行った。
[0073] メタノール 10mMギ酸アンモ-ゥム（1： 1 , v/v, 30 μ L)で残渣を溶解し、そのう ち 10 Lを用いて LCZMSによる分析を行った。
[0074] 装置： Shimadzu LC— 10AT / Applied Biosystems API 2000
カラム： YMC Pack 08 (5 μ ί, 150 X 2mm i. d. )
移動相： MeCN— MeOH—10mM HCOONH (7 : 3 : 10, v/v/v)
4
流速： 0. 2 mL/ min
検出法:正イオン検出 ESI
選択反応モニタリング（SRM) (エストロン mZz 549. 3→502. 4、内部標準 m /z 554. 3→506. 4)
なお、検量線の作成のために次の操作を行った。共栓付試験管に健常男性尿（10 : L)をとり、エストロン（5, 10, 20, 50, 100, 200pg)の EtOH溶液（10 ： L)と内咅 標準として重水素標識エストロン（200pg)をカ卩えた。なお、ここで用いた男性尿はあ らかじめエストロンが検出されないことを確認している。この混合物に MeOH ( 100 L)を加え、ボルテックスミキサーにて撹拌を行い遠心分離（1000g, 5分間）した。上 清を H 0 (400 L)で希釈し、 Strata— Xカートリッジに付した。 H 0 (2mL)、 30%
2 2
MeOH (2mL)で順次洗浄後、 AcOEt ( lmL)で溶出を行った。溶出液を窒素気流 下溶媒留去し、残渣を以下の誘導体化反応に付した。すなわち， 1一（5 フルォロ —2, 4 ジニトロフエ-ル） 4—メチルーピペラジン（1 μ g/ zz Lになるように調製し たアセトン溶液を 40 L)、 1M NaHCO (10 /z L)、アセトン（40 μ L)を順次加え、
3
60°Cで加熱した。 1時間後、 50%Μ6θΗ (400 υをカ卩えて反応を終了し、 NaHC Oを除去するため、これを Strata—Xカートリッジに付した。 H 0 (2mL)で洗浄後、
3 2
AcOEt (lmL)で溶出し、窒素気流下溶媒留去した。残渣にヨウ化メチル（200 L) を加え、 60°C、 30分間反応を行い、その後、窒素気流下にてヨウ化メチルの除去を 行った。 MeOH— 10mMギ酸アンモ-ゥム（1： 1、 vZv、 30 μ L)で残渣を溶解し、 このうち Lを用いて LCZESI— MSZMSで分析を行い、検量線を作成した。 得られた検量線は、 Xをエストロン濃度 (ngZmL)、 Yをエストロンと内部標準とのピ ーク面積比（エストロンピーク面積 Z内部標準ピーク面積）としたとき、 Y=0. 06597 8Χ+0. 000930 (R2=0. 999894)であった。
16週と 37週の妊婦の尿サンプルについてそれぞれ 5回ずつ、上記手順に沿って 分析を行い、エストロンと内部標準とのピーク面積比を測定した。そして当該面積比 力も上記検量線を用いてエストロン濃度 (ngZmL)を算出した。こうして算出された エストロン濃度の平均値、標準偏差、及び変動係数 (標準偏差 Z平均値 X 100)を 表 7及び 8にまとめた。表 7及び 8に示されるとおり本発明によるエストロン濃度の測定 法の再現性は非常に高力つた。
[表 7]
16週妊婦からの尿サンプルの分析結果
Figure imgf000023_0001
[表 8] 37週妊婦からの尿サンプルの分析結果
Figure imgf000024_0001
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲 [1] 式 (I)
[化 1]
Figure imgf000025_0001
(式中、
Xはハロゲンであり、
Y及び Yは、独立 水素又は-トロ基であり（但し γと γとが同時に水素である ことはない）、
Aは N又は CHであり、
Qは C〜Cァノレキレン基であり、
1 4
R、 R及び Rは以下の（a)〜（c)の何れ力 1つを満たすものである
1 2 3
(a) R及び Rは、独立に、 C〜Cアルキル基であり、且つ、 Rは水素又は C〜C
1 2 1 4 3 1 4 アルキル基である、
(b) Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキレン基を形成しており、且つ、 Rは水
1 2 2 5 3 素又は c〜cアルキル基である、
1 4
(c) Rはじ〜Cアルキル基であり、且つ、 Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキ
1 1 4 2 3 1 4 レン基を形成している）
で表される化合物、又は前記 R及び Rで置換された Nに C〜Cアルキル基である
1 2 1 4
Rが付加された、カウンターァ-オンを有する前記化合物の四級化物を含有する、
4
フエノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物のソフトイオンィ匕法を用いた質量分析測定 のための誘導体化試薬。
[2] 式 (II)
[化 2]
Figure imgf000026_0001
(式中 Xはハロゲンである）
で表される化合物、又はジメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウ ンターァニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、請求項 1記載の誘導体 化試薬。
[3] 式 (III)
[化 3]
Figure imgf000026_0002
(式中 Xはハロゲンである）
で表される化合物、又はメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウン ターァニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、請求項 1記載の誘導体化
[4] 前記フエノール類ィ匕合物がエストロゲン又はフエノール性内分泌撹乱物質である請 求項 1〜3の何れか 1項記載の誘導体化試薬。
[5] 前記ソフトイオンィ匕法がエレクトロスプレーイオンィ匕法である請求項 1〜4の何れか 1 項記載の誘導体化試薬。
[6] 式 (I)
[化 4]
Figure imgf000027_0001
(式中、
Xはハロゲンであり、
Y及び Yは、独立に、水素又は-トロ基であり（但し Yと Yとが同時に水素である
1 2 1 2
ことはない）、
Aは N又は CHであり、
Qは C〜Cァノレキレン基であり、
1 4
R、 R及び Rは以下の（a)〜（c)の何れ力 1つを満たすものである
1 2 3
(a) R及び Rは、独立に、 C〜Cアルキル基であり、且つ、 Rは水素又は C〜C
1 2 1 4 3 1 4 アルキル基である、
(b) Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキレン基を形成しており、且つ、 Rは水
1 2 2 5 3 素又は c〜cアルキル基である、
1 4
(c) Rはじ〜Cアルキル基であり、且つ、 Rと Rとが一体となって、 C〜Cアルキ
1 1 4 2 3 1 4 レン基を形成している）
で表される化合物、又は前記 R及び Rで置換された Nに C〜Cアルキル基である
1 2 1 4
Rが付加された、カウンターァ-オンを有する前記化合物の四級化物と、フエノール
4
類化合物又はアミン類化合物とを反応させて誘導体を形成させた後に、ソフトイオン 化法を用いた質量分析測定を行なう、フエノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物の測 定方法。
[7] 前記式 (I)で表される化合物と、フ ノール類ィ匕合物又はアミン類ィ匕合物とを反応さ せて誘導体を形成させた後に、 C〜Cアルキル基を有する四級化剤を用いて前記
1 4
R及び Rで置換された Nを四級化する工程を更に含む、請求項 6記載の方法。
1 2
[8] 式 (I)
[化 5]
Figure imgf000028_0001
(式中、
Xはハロゲンであり、
Y及び Yは、独立に、水素又は-トロ基であり（但し Yと Yとが同時に水素である
1 2 1 2
ことはない）、
Aは N又は CHであり、
Qは C 〜Cァノレキレン基であり、
1 4
R 、 R及び Rは以下の（a)〜（c)の何れ力 1つを満たすものである
1 2 3
(a) R及び Rは、独立に、 C 〜Cアルキル基であり、且つ、 Rは水素又は C 〜C
1 2 1 4 3 1 4 アルキル基である、
(b) Rと Rとが一体となって、 C 〜Cアルキレン基を形成しており、且つ、 Rは水
1 2 2 5 3 素又は c 〜cアルキル基である、
1 4
(c) Rはじ〜Cアルキル基であり、且つ、 Rと Rとが一体となって、 C 〜Cアルキ
1 1 4 2 3 1 4 レン基を形成している）
で表される化合物（但し、 N1— (5 クロ口 2, 4 ジニトロフエ-ル） N2, N2 ジメ チノレー 1, 2 プロパンジァミン、 N— (5—クロ口一 2, 4 ジニトロフエ-ノレ）一 1—ピ ペリジンエタンァミン、 N— (5—クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル） α—メチル一 1— ピロリジンエタンァミン、 1— (5—クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル）一 4—メチルーピべ ラジン、 Ν，一（5 クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル）一 Ν, Ν—ジェチルー 1, 2 エタ ンジァミン、 Ν，一（5 クロ口一 2, 4 ジ-トロフエ-ル）一 Ν, Ν ジメチル一 1, 2- エタンジァミン、及び Ν— (5—クロ口一 2, 4 ジニトロフエ-ル）一 1—ピロリジンエタ ンァミンを除く）、又は前記 R及び Rで置換された Νに C 〜Cアルキル基である R
1 2 1 4 4 が付加された、カウンターァ-オンを有する前記化合物の四級化物。
[9] 式 (IV) [化 6]
Figure imgf000029_0001
(式中 X'はフッ素、臭素又はヨウ素である）
で表される化合物、又はジメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウ ンターァニオンを有する前記化合物の四級化物。
[10] 式 (V)
[化 7]
Figure imgf000029_0002
(式中 X'はフッ素、臭素又はヨウ素である）
で表される化合物、又はメチル置換された Nに更なるメチル基が付加された、カウン ターァニオンを有する前記化合物の四級化物。
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