CN111721847A

CN111721847A - 一种hplc检测药品中乙二胺含量的方法

Info

Publication number: CN111721847A
Application number: CN201910219082.1A
Authority: CN
Inventors: 唐欢; 胡崇琳; 王丽涛; 肖娟; 陈礼莉
Original assignee: Chengdu Beite Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Chengdu Beite Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: CN111721847B

Abstract

本发明具体涉及一种HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，主要是将本身无紫外吸收的乙二胺通过衍生化反应得到具有紫外吸收的衍生产物来实现的。本发明采用高效液相色谱法检测乙二胺的含量，其检测结果精准，基线平整，峰形对称，稳定性高、重复性好、分离度高、检测限低、灵敏度高，且对仪器无损伤。

Description

一种HPLC检测药品中乙二胺含量的方法

技术领域

本发明涉及检测方法领域，特别是涉及一种检测药品中乙二胺含量的方法。

背景技术

乙二胺为无色或微黄色油状或水样液体，有类似氨的气味，呈强碱性。在药品中会使用乙二胺来作为助溶剂及调节药品的pH值，但乙二胺具有一定腐蚀性，会刺激皮肤对粘膜和皮肤有强烈刺激性，接触该品蒸气引起结膜炎、支气管炎、肺炎或肺水肿，并可发生接触性皮炎，可引起肝、肾损害。故准确检测药品中乙二胺的含量十分重要。

例如，德国史达德药厂奥力宝(通用名称：硫辛酸注射液)，其活性成份为α-硫辛酸，辅料为乙二胺和注射用水，乙二胺主要是作为助溶剂增加硫辛酸的溶解度，并能提高硫辛酸注射液热稳定效果。故准确检测注射液中乙二胺的含量对仿制硫辛酸注射液具有十分重要的作用。

发明内容

目前检测乙二胺含量的方法有很多，如离子色谱法等，申请人在采用离子色谱仪检测乙二胺含量的过程中发现，离子色谱仪容易受损伤，造成设备的利用效率降低，增加使用成本，研究发现是因为流动相含有有机试剂，如乙腈。

本发明通过衍生化反应使乙二胺生成可以通过HPLC检测的衍生产物来检测乙二胺的含量。

本发明提供了一种HPLC检测硫辛酸注射液中乙二胺含量的方法，包括以下内容：

1)取乙二胺与衍生试剂反应制备得到衍生对照品溶液；

2)取样品与衍生试剂反应制备衍生供试品溶液；

3)采用高效液相色谱法分别检测衍生对照品溶液和衍生供试品溶液，计算乙二胺含量；其中高效液相色谱法的色谱条件包括以下内容：采用梯度洗脱，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：流动相A为纯水或缓冲液，流动相B为有机溶剂；所述梯度洗脱中流动相A与流动相B的体积比为：

进一步的，所述梯度洗脱程序优选如下：

优选为：

本发明对乙二胺含量的计算，可以采用如外标法、内标法、面积归一法等常规方法。当采用内标法时，所选择的内标物是不干扰乙二胺吸收峰的物质，具体可以通过现有技术以及一些常规试验得到。本发明一实施例中，采用外标法进行计算，简单方便。

本申请采用衍生化法，衍生试剂与乙二胺发生衍生化反应，通过高效液相色谱法检测衍生化产物来定量分析乙二胺含量。本发明一实施例中，所述衍生试剂选自对甲苯磺酰氯(PTSC)。

对甲苯磺酰氯与乙二胺反应，脱掉一分子或两分子的HCl，生成衍生产物，反应式如下：

本发明一实施例中，所述乙二胺与衍生试剂的质量比为1:10-50；优选为1:25。

本发明一实施例中，所述衍生试剂为与乙二胺反应生成磺酰胺类化合物的一类试剂；常用的衍生试剂有丹磺酰氯、邻苯二甲醛、苯甲酰氯、荧光胺等，其中丹磺酰氯作为最常用的液相色谱柱前衍生试剂具有衍生操作简单、衍生物稳定性好、可定量完成磺酰化反应、有较强的荧光和紫外吸收等优点，但仍存在衍生时间较长，生成干扰副产物等缺点。采用对甲苯磺酰氯(PTSC)作为衍生试剂，其反应机理与丹磺酰氯相似，并且溶解性好、反应迅速和相对价廉。优选的，所述衍生试剂选自对甲苯磺酰氯，该衍生试剂与乙二胺反应生成的副产物很少，并且不干扰衍生产物的检测，同时反应在30min以内进行得非常彻底。所述衍生试剂与乙二胺的反应，是指衍生试剂与乙二胺，在碱性条件下，发生磺酰化反应。反应中使用无机碱，如碳酸氢钠。

本发明一实施例中，衍生反应温度为40-70℃，衍生反应时间为15-60min；优选为50℃和30min。

本发明一实施例中，所述碱性条件的pH值为9-12。

本发明还公开了制备衍生对照品溶液的方法：

取乙二胺储备液、无机碱溶液和对甲苯磺酰氯丙酮溶液，混匀后，在40～60℃反应；取出，加入氨水除去多余的对甲苯磺酰氯，静置，定容，过滤膜，即得衍生对照品溶液。其中，乙二胺储备液为浓度为0.67mg/mL乙二胺，溶剂为0.1mol/L HCl溶液。其中，对甲苯磺酰氯丙酮溶液为取对甲苯磺酰氯适量，加丙酮溶解并稀释制成每1ml中含对甲苯磺酰氯25mg的溶液。

衍生供试品溶液的制备参照衍生对照品溶液的制备方法，仅仅是将乙二胺储备液更换为硫辛酸注射液与适量的HCl溶液。

本发明所述色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；优选Agilent ZORBAX SBC18(4.6mm*250mm,5μm)色谱柱。

本发明一实施例中，所述缓冲液为乙酸铵溶液，浓度为5-10mmol/L，pH值为6.5-8.0。

本发明一实施例中，流动相B为甲醇和/或乙腈；优选为乙腈。

本发明一实施例中，色谱柱的柱温为35-40℃。

本发明所提供的检测方法针对生物胺及含氨基化合物含量的检测的特性开发，在本发明的技术构思下，本领域技术人员可针对特定药品做方法的适应性细化调整，以普遍适用于多种药品中生物胺及含氨基化合物含量的检测。根据本发明的技术构思精神，本发明的检测方法尤其适用于检测硫酸锌注射液中的乙二胺。

本发明有益效果：

本发明采用高效液相色谱法检测乙二胺的含量，其检测结果精准，基线平整，峰形对称，稳定性高、重复性好、分离度高、检测限低、灵敏度高，相较于离子色谱法，该方法采用的试剂均为常规有机试剂，且溶液经过过滤，不会对高效液相色谱仪产生损伤。

说明书附图

图1空白溶液色谱图；

图2对照品溶液色谱图；

图3供试品溶液色谱图；

图4乙二胺线性关系图。

具体实施方式

本申请实验过程如下：

一、分析方法建立

待验证的色谱条件：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB C18：4.6mm×250mm，5μm或等效色谱柱)，以5mmol/L的乙酸铵缓冲液(用乙酸调节pH至6.5)为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为228nm；柱温为40℃。

进行梯度洗脱如下：

制剂含量测定法：

精密量取本品1.0ml，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸9ml、0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml和对甲苯磺酰氯溶液(取对甲苯磺酰氯适量，加丙酮溶解并稀释制成每1ml中含对甲苯磺酰氯25mg的溶液)10ml，摇匀，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，照上述色谱条件检测，精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取乙二胺对照品适量，精密称定，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1mL中约含667μg的溶液。精密量取该溶液10ml，置100ml量瓶中，加0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml和对甲苯磺酰氯溶液10ml，摇匀，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，同法测定，按外标法以乙二胺的衍生物峰(保留时间约12分钟)的峰面积计算，含乙二胺的含量应为6.33～7.00mg/ml。

二、方法验证

2.1、溶液配制

(1)储备溶液的配制

0.1mol/L盐酸溶液：移取盐酸9ml，置1000ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2mol/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠约8g，用100ml水搅拌溶解，摇匀，即得。

0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)：称取碳酸氢钠约4.2g，用200mL水搅拌溶解，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为10，即得。

25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液：称取对甲苯磺酰氯约2.5g，置100ml量瓶中，用丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

乙二胺储备液：称取乙二胺适量，精密称定，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至每1ml中约含乙二胺667μg的溶液，摇匀，即得。

(2)空白溶液的制备

称取硫辛酸原料药约25mg，置100ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液10ml、0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml、25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液10ml，摇匀1min，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得空白溶液。

(3)对照品溶液的制备

精密移取乙二胺储备液10ml，置100ml量瓶中，加0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml、25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液10ml，摇匀1min，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

(4)供试品溶液的制备

精密移取本品1ml，置100ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液9ml、0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml、25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液10ml，摇匀1min，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2、专属性试验

精密移取1中空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪进行测定。

测定的色谱图如图1～图3所示，图1为空白溶液色谱图，图2为对照品溶液色谱图，图3为供试品溶液色谱图。

结果：乙二胺衍生产物的色谱峰的保留时间约为12.1min，该峰与其前后相邻杂质峰之间的分离度大于1.5，拖尾因子在0.8～2.0之间，峰纯度﹥999，理论板数不小于5500。空白溶液的色谱图在衍生产物的出峰位置处无干扰峰存在。

2.3、线性关系试验

乙二胺储备溶液1#：称取乙二胺适量，精密称定，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至每1mL中约含乙二胺6.3mg的溶液，摇匀，即得。

乙二胺储备溶液2#：称取乙二胺适量，精密称定，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至每1mL中约含乙二胺7.0mg的溶液，摇匀，即得。

分别精密量取乙二胺储备溶液1#1.0ml、1.6ml、2.0ml，置20ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度，得到乙二胺线性储备液1、2、3。

分别精密量取乙二胺储备溶液2#2.0ml、2.4ml、3.0ml，置20ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度，得到乙二胺线性储备液4、5、6。

线性溶液：分别精密移取乙二胺线性储备液(1-6)10ml，置100ml量瓶中，0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml、25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液10ml，摇匀1min，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。分别进样分析以上溶液，记录进样峰面积；以峰面积(y)为纵坐标，量瓶中乙二胺质量浓度(x)为横坐标，得到线性回归方程，结果见表1。

本品乙二胺在测定浓度0.03185mg/ml～0.10663mg/ml范围内，主峰面积与浓度应呈良好的线性关系，线性方程为y＝209526.6377x+392.8953，R²＝0.9999,相关系数r为0.9999，如图4。

表1

2.4、精密度试验

精密移取1中对照品溶液10μl，按照1中色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，计算乙二胺衍生产物的保留时间和峰面积的RSD。

结果：保留时间的RSD为0.09％﹤1.0％，峰面积RSD为0.2％﹤2.0％，说明仪器精密度良好。

2.5、稳定性试验

取1中对照品溶液和供试品溶液于室温分别放置0、4、8、12、24h后，精密移取对照品溶液和供试品溶液10μl，按照1中色谱条件进样检测，记录色谱图，计算乙二胺衍生产物峰面积的RSD。

结果：对照品溶液峰面积RSD为0.6％，供试品溶液峰面积RSD为0.3％，说明溶液在室温下放置24h稳定。

2.6、重复性试验

取1中硫辛酸注射液(批号180801)平行制备6份供试品溶液，精密移取供试品溶液10μl，按照1中色谱条件进样检测，记录色谱图，计算乙二胺的含量。

结果：6份样品中，乙二胺的平均含量为6.60％，RSD为0.4％，说明本方法的重复性良好。

2.7、准确度试验

乙二胺储备液100％溶液：精密称定乙二胺约335mg至10ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液并稀释至刻度，作为母液，精密移取母液1ml至50ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

乙二胺储备液150％溶液：精密移取乙二胺母液3ml至100ml瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释，摇匀，即得。

50％回收率溶液：称取硫辛酸原料药约25mg，置100ml量瓶中，加乙二胺储备液100％溶液5ml、0.1mol/L盐酸溶液5ml、0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml、25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液10ml，摇匀1min，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。(同法制备3份)

100％回收率溶液：称取硫辛酸原料药约25mg，置100ml量瓶中，加乙二胺储备液100％溶液10ml、0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml、25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液10ml，摇匀1min，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。(同法制备3份)

150％回收率溶液：称取硫辛酸原料药约25mg，置100ml量瓶中，加乙二胺储备液150％溶液10ml、0.25mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝10)10ml、25mg/ml对甲苯磺酰氯丙酮溶液10ml，摇匀1min，在50℃水浴中反应30min后取出，加入2ml浓氨水终止反应，室温放置30min，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。(同法制备3份)

乙二胺对照品溶液：同1中对照品溶液。

按照待验证方法中色谱条件进样分析以上溶液，记录色谱图，计算回收率，结果见表2。

表2

由表1可知，平均回收率为100.0％，RSD为1.2％，符合要求。

三、检测

基于前述本发明论证的方法，检测硫辛酸注射液中乙二胺含量的一实例如下：

将2.1中(2)-(4)得到的空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，得到空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的高效液相色谱检测结果；

所述测定过程中：色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18(4.6mm*250mm,5μm)；流动相A为5mmol/L乙酸铵溶液(乙酸调节pH值为6.5)，流动相B为乙腈；柱温为40℃；进样量为10μl。所述梯度洗脱中流动相A与流动相B的体积比为：

根据检测得到的高效液相色谱检测结果，计算得到自制样品中乙二胺的峰面积；

所述对照品溶液中，乙二胺的峰面积为14493.777；所述供试品溶液中，乙二胺的峰面积为14129.719(批号180801)；计算得到自制样品中乙二胺的含量为6.60mg/ml。

9、原研药中乙二胺含量测定

采用8中检测方法，分析了1批原研样品；

结果：原研样品中乙二胺的含量为6.58mg/ml。

综上所述，本发明提供了一种药品中乙二胺含量的检测方法，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性好、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率准确度高，方法重现性好，检测结果准确、可靠，为精确检测乙二胺的含量提供了一种行之有效的方法，保证了产品质量，并且采用衍生化法检测乙二胺，有效避免了有机溶剂对仪器的损伤。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于，包括以下内容：

1)取乙二胺与衍生试剂反应制备得到衍生对照品溶液；

2)取样品与衍生试剂反应制备衍生供试品溶液；

3)采用高效液相色谱法分别检测衍生对照品溶液和衍生供试品溶液，计算乙二胺含量；其中高效液相色谱法的色谱条件包括以下内容：

采用梯度洗脱，色谱柱：硅烷键合硅胶为固定相；流动相包括流动相A和流动相B：流动相A为纯水或缓冲液，流动相B为有机溶剂；0-15min梯度洗脱程序如下：

。

2.根据权利要求1所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：1)中，所述乙二胺与衍生试剂的质量比为1:10-50；优选为1:25。

3.根据权利要求1所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：所述衍生试剂为与乙二胺反应生成磺酰胺类化合物的一类试剂；优选的，所述衍生试剂选自对甲苯磺酰氯。

4.根据权利要求1-3任一所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：衍生温度为40-70℃，衍生时间为15-60min；优选为50℃和30min。

5.根据权利要求1-3任一所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：所述色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶。

6.根据权利要求1-3任一所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：所述缓冲液为乙酸铵溶液，浓度为5-10mmol/L，pH值为6.5-8.0。

7.根据权利要求1-3任一所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：所述流动相B为甲醇和/或乙腈；优选为乙腈。

8.根据权利要求1-3任一所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：色谱柱的柱温为35-40℃。

9.根据权利要求1-3任一所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序如下：

优选为：

。

10.根据权利要求1所述HPLC检测药品中乙二胺含量的方法，其特征在于：所述药品为硫辛酸注射液。