CN109725073B - 乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，在有机溶剂中，使用衍生化试剂与N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸及其对映异构体进行衍生化反应，制备得到N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸及其异构体的衍生化产品，再使用正相高效液相色谱法进行分离和检测；衍生化试剂采用异氰酸酯类。本发明的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，将衍生试剂与N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸及其对映异构体进行反应，采用柱前衍生正相高效液相色谱法，依据手性分离的机理，增加色谱柱中固定相与待分离手性物质之间的相互吸引作用，有效提高手性分离的选择性。该法操作简便、耗时短、易于推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及乙酰半胱氨酸的分离检测领域，特别地，涉及一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法。
背景技术
乙酰半胱氨酸，化学名为N-乙酰基-L-半胱氨酸，分子式为C5H9NO3S，是一种呼吸道粘液溶解剂，其对白色粘痰和浓痰都有分解作用，以改善病人的呼吸状况。乙酰半胱氨酸的药品已在国内外批准上市，用于治疗浓稠粘液分泌物过多的呼吸道疾病如：急性支气管炎、慢性支气管炎及其病情恶化者、肺气肿、粘稠物阻塞症以及支气管扩张症。
乙酰半胱氨酸含有一个手性中心，其对映异构体的化学名为N-乙酰基-D-半胱氨酸，是乙酰半胱氨酸质量控制的重要指标。专利201010297844.9公开了一种乙酰半胱氨酸对映异构体的测定方法，取乙酰半胱氨酸用稀酸溶液溶解，用碱溶液将pH值调至6.0～8.0，与1mol/L碳酸盐溶液混合，加入Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物混匀；于40～60℃避光反应，反应完毕后，加入盐酸溶液；在预置五氧化二磷与氢氧化钾的干燥系统中，加磷酸盐缓冲溶液-乙腈，超声处理使残渣溶解，过滤，滤液作为供试品溶液；用高效液相色谱法或高效液相色谱法-质谱法分离测定。操作步骤较复杂，反应步骤较多，不易于推广使用。
发明内容
本发明提供了一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，以解决现有技术中操作复杂，灵敏度低，不利于推广使用的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，在有机溶剂中，使用衍生化试剂与N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体进行衍生化反应，制备得到N-乙酰基-L-半胱氨酸及其异构体的衍生化产品，再使用正相高效液相色谱法进行分离和检测；衍生化试剂采用异氰酸酯类。
进一步地，异氰酸酯类采用(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯、(S)-(-)-a-甲基苄基异氰酸酯、3-甲基苄基异氰酸酯和苯异氰酸酯中的至少一种。
进一步地，有机溶剂采用甲醇、乙醇或异丙醇中的至少一种。
进一步地，N-乙酰基-L-半胱氨酸溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸的衍生化产品；N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的衍生化产品。N-乙酰基-L-半胱氨酸溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，待用，N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入待用溶液，然后加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体的衍生化产品。
进一步地，氢氧化物溶液采用氢氧化钾溶液或氧化钠溶液；N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体与氢氧化物的质量比为4～5∶1。
进一步地，反应温度为45℃～65℃；反应时间为15min～25min。
进一步地，正相液相色谱柱的固定相采用多糖类手性填料；多糖类手性填料采用正相液相色谱柱采用表面涂覆有纤维素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶中的一种。
进一步地，正相液相色谱柱采用的流动相为正己烷-低级醇混合液，正己烷与低级醇的体积比为88～95∶5～12；流动相的流速为1.1～1.3ml/min；检测波长为200nm～230nm。
进一步地，流动相还包括酸碱调节剂，酸碱调节剂采用甲酸、冰醋酸、三氟乙酸中的至少一种；正己烷-低级醇混合液与酸碱调节剂的体积比为100∶0.05～0.15；低级醇采用无水乙醇或异丙醇。
进一步地，还包括利用外标法以色谱图的峰面积计算乙酰半胱氨酸对映异构体的质量。
本发明具有以下有益效果：
本发明的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，将衍生试剂与N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体进行反应，采用柱前衍生正相高效液相色谱法，基于手性分离的机理，异氰酸酯类作为衍生试剂含有不饱和的N＝C＝O双键，具有很高的活性，容易与带活泼氢原子的化合物反应，而乙酰半胱氨酸及其对映异构体中含有带活泼氢原子的氨基基团，可获得稳定的衍生产物，并增加色谱柱中固定相与待分离手性物质之间的相互吸引作用，再根据化学键或活性基团性能的差异，有效提高手性分离的选择性。该法操作简便、耗时短、易于推广使用。
本发明的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，衍生反应条件温和，反应速度快，N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体衍生物峰保留时间具有差异，将N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体分离，衍生试剂保留时间短，因此，过量的衍生试剂不干扰N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的测定。
本发明的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体的衍生物出峰时间短，可大大提高分析检测的效率。
本发明的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，专属性强，准确度好，灵敏度高，定量限可达1.514ng，适于N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的定量分析测定。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例1的混合溶液的色谱图；
图2是本发明优选实施例1的对照品溶液的色谱图；
图3是本发明优选实施例2的混合溶液的色谱图；
图4是本发明优选实施例3的混合溶液的色谱图；
图5是本发明优选实施例4的混合溶液的色谱图；
图6是本发明优选实施例5的混合溶液的色谱图；
图7是本发明优选实施例6的混合溶液的色谱图；
图8是本发明优选实施例7的混合溶液的色谱图；
图9是本发明优选实施例8的混合溶液的色谱图；
图10是本发明优选实施例9的对照品溶液的色谱图；
图11是本发明优选实施例9的供试品溶液的色谱图；
图12是本发明优选实施例10的空白溶液溶液的色谱图；
图13是本发明优选实施例11的对照品溶液的色谱图；以及
图14是本发明优选实施例12的乙酰半胱氨酸原料药溶液的色谱图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
图1是本发明优选实施例1的混合溶液的色谱图；图2是本发明优选实施例1的对照品溶液的色谱图；图3是本发明优选实施例2的混合溶液的色谱图；图4是本发明优选实施例3的混合溶液的色谱图；图5是本发明优选实施例4的混合溶液的色谱图；图6是本发明优选实施例5的混合溶液的色谱图；图7是本发明优选实施例6的混合溶液的色谱图；图8是本发明优选实施例7的混合溶液的色谱图；图9是本发明优选实施例8的混合溶液的色谱图；图10是本发明优选实施例9的对照品溶液的色谱图；图11是本发明优选实施例9的供试品溶液的色谱图；图12是本发明优选实施例10的空白溶液溶液的色谱图；图13是本发明优选实施例11的对照品溶液的色谱图；图14是本发明优选实施例12的乙酰半胱氨酸原料药溶液的色谱图。
本实施例的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，在有机溶剂中，使用衍生化试剂与N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体进行衍生化反应，制备得到N-乙酰基-L-半胱氨酸及其异构体的衍生化产品，再使用正相高效液相色谱法进行分离和检测；衍生化试剂采用异氰酸酯类。本发明的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，将衍生试剂与N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体进行反应，采用柱前衍生正相高效液相色谱法，基于手性分离的机理，异氰酸酯类作为衍生试剂含有不饱和的N＝C＝O双键，具有很高的活性，容易与带活泼氢原子的化合物反应，而乙酰半胱氨酸及其对映异构体中含有带活泼氢原子的氨基基团，可获得稳定的衍生产物，并增加色谱柱中固定相与待分离手性物质之间的相互吸引作用，再根据化学键或活性基团性能的差异，有效提高手性分离的选择性。该法操作简便、耗时短、易于推广使用。
上述酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，衍生反应条件温和，反应速度快，N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体衍生物峰保留时间具有差异，将N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体分离，衍生试剂保留时间短，因此，过量的衍生试剂不干扰N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的测定。
上述乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体的衍生物出峰时间短，可大大提高分析检测的效率。
上述乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，专属性强，准确度好，灵敏度高，定量限可达1.514ng，适于N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的定量分析测定。
本实施例中，异氰酸酯类采用(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯、(S)-(-)-a-甲基苄基异氰酸酯、3-甲基苄基异氰酸酯和苯异氰酸酯中的至少一种。异氰酸酯类作为衍生试剂含有不饱和的N＝C＝O双键，因此具有很高的活性，容易与带活泼氢原子的化合物反应，而乙酰半胱氨酸及其对映异构体中含有带活泼氢原子的氨基基团，可获得稳定的衍生产物。
以(R)-(+)-ɑ-甲基苄基异氰酸酯作为衍生试剂为例，其化学反应方程式分别如下：
N-乙酰基-L-半胱氨酸：
N-乙酰基-D-半胱氨酸：
乙酰半胱氨酸及其对映异构体与(R)-(+)-ɑ-甲基苄基异氰酸酯衍生反应后，引入了苯基，增加了固定相与手性物质间的π-π相互作用，因乙酰半胱氨酸手性中心的存在，导致乙酰半胱氨酸及其对映异构体的衍生物与固定相之间的π-π相互作用产生差异，从而提高了手性分离的选择性。
本实施例中，有机溶剂采用甲醇、乙醇或异丙醇中的至少一种。上述利用有机溶剂对N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体进行溶解和稀释。
本实施例中，衍生化反应包括以下步骤：N-乙酰基-L-半胱氨酸溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸的衍生化产品。N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的衍生化产品。N-乙酰基-L-半胱氨酸溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，待用，N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入待用溶液，然后加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体的衍生化产品。上述衍生化试剂和N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体进行衍生化反应，衍生试剂含有不饱和的N＝C＝O双键，因此具有很高的活性，容易与带活泼氢原子的化合物反应，而乙酰半胱氨酸及其对映异构体中含有带活泼氢原子的氨基基团，制备得到N-乙酰基-L-半胱氨酸及其异构体的衍生化产品，由于乙酰半胱氨酸及其对映异构体的衍生化产品与固定相之间相互作用产生差异，从而提高了手性分离的选择性。上述N-乙酰基-L-半胱氨酸的衍生化产品的制备，N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的衍生化产品的制备，N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体的衍生化产品的制备可以同时进行，也可以分开制备，三者制备的先后顺序并没有限定。
上述N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体或二者的混合物呈现酸性，加入到氢氧化物溶液中，使用氢氧化物调节溶液的pH至中性，使得N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的氢原子电离，增加化学键活性，加快与衍生试剂的反应进程。
本实施例中，氢氧化物溶液采用氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液。N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体与氢氧化物的质量比为4～5∶1。上述氢氧化物溶液用于调节溶液的pH，使得N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液、N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体溶液、N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体溶液为中性，以保证样品的同一性，避免造成误差。
本实施例中，反应温度为45℃～65℃。反应时间为15min～25min。上述衍生反应温度控制在45℃～65℃，有利于反应进行，增加衍生化试剂与N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体反应基团的活性，加快反应进程。当反应温度高于65℃，容易导致有机物质挥发，改变反应体系环境，阻止反应进程。上述衍生反应时间为15min～25min，反应时间较短，操作简便，不需要再进行其他的操作，就可以进行正相液相色谱柱分离检测。
本实施例中，正相液相色谱柱的固定相采用多糖类手性填料。多糖类手性填料的正相液相色谱柱采用表面涂覆有纤维素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶为固定相的手性色谱柱中的一种。
如图1所示，上述正相液相色谱柱的固定相采用多糖类手性填料，多糖类手性填料对衍生试剂结合能力最弱，因此衍生试剂与固定相结合时间最短，在4min～6min被洗脱下来，基于手性分离的机理，与N-乙酰基-L-半胱氨酸的衍生化产品和N-乙酰基-D-半胱氨酸的衍生化产品相互吸引并形成包埋复合物，依据乙酰半胱氨酸手性中心的存在，N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-D-半胱氨酸与固定相之间的相互作用的差异，导致保留的时间不同，从而将N-乙酰基-D-半胱氨酸，即乙酰半胱氨酸对映异构体分离，乙酰半胱氨酸对映异构体先被洗脱下来，N-乙酰基-L-半胱氨酸后被洗脱下来。并且衍生试剂不干扰乙酰半胱氨酸对映异构体的测定。
本实施例中，正相液相色谱柱采用的流动相为正己烷-低级醇混合液，正己烷：低级醇的体积比为88～95∶5～12。流动相的流速为1.1～1.3ml/min。检测波长为200nm～230nm。上述正相液相色谱分析条件下，可以将乙酰半胱氨酸与其对映异构体进行有效分离，乙酰半胱氨酸与其对映异构体的对应峰分离度高，在上述正相液相色谱分析条件下，能够简单、快速、准确地检测出乙酰半胱氨酸对映异构体的含量。上述检测波长为200nm～230nm，采用紫外检测器，而高效液相色谱仪一般均配备有紫外检测器，无需额外采购其他类的检测器，利于方法的推广使用。
本实施例中，流动相还包括酸碱调节剂，酸碱调节剂采用甲酸、冰醋酸、三氟乙酸中的至少一种。正己烷-低级醇混合液与酸碱调节剂的体积比为100∶0.05～0.15；低级醇采用无水乙醇或异丙醇。上述酸碱调节剂添加，可以保证流动相体系的pH值，稳定的洗脱环境，抑制弱解离化合物的解离，提高测量准确性。
本实施例中，优选地，正己烷：无水乙醇：三氟乙酸的体积比为90∶10∶0.1；流动相的流速为1.2ml/min；检测波长为215nm。经过试验研究，确定最佳的正相液相色谱分析条件，准确的测定乙酰半胱氨酸对映异构体的含量。
本实施例中，还包括利用外标法以色谱图的峰面积计算乙酰半胱氨酸对映异构体的质量。
乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法步骤如下：
供试品溶液：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，精密加入衍生试剂10μl，密塞，摇匀，置50～60℃水浴保温15～25min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
对上述供试品溶液中的乙酰半胱氨酸，其辅料中含有氢氧化物，乙酰半胱氨酸溶液的pH已处于中性，因此在制备供试品溶液时，乙酰半胱氨酸溶液处理过程中未加氢氧化物溶液。
对照品母液：精密称取乙酰半胱氨酸对映异构体对照品25mg，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法进行衍生化处理，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液。
对照品溶液：精密量取对照品母液1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。每1ml溶液中含乙酰半胱氨酸对映异构体为5μg。
系统适用性溶液：量取供试品溶液5ml和对照品母液1ml，同置10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
进样检测：精密量取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算乙酰半胱氨酸对映异构体的量。
上述系统适用性溶液用来验证高效液相色谱系统性能是否符合检测要求。主要检测乙酰半胱氨酸及其对映异构体衍生产物的分离度是否达到要求。供试品溶液中含乙酰半胱氨酸为0.5mg/ml；进行方法验证时，乙酰半胱氨酸异构体的检测限为0.0005mg/ml，线性范围至少为0.0015～00.0126mg/ml。实施样品检测试验时，配制的对照品溶液含乙酰半胱氨酸对映异构体的浓度为0.005mg/ml。
实施例
高效液相色谱仪戴安Ultimate 3000。
液相色谱柱CHIRALPAK IC，4.6×250mm，5μm。
检测器紫外检测器。
以下实施例中各化学试剂均为市售。
实施例1
待测样品1：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸对映异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液3ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置55℃水浴保温20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
另精密量取对照品母液5ml，置10ml量瓶中，再精密加入衍生试剂(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置55℃水浴保温20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝90∶10∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图1为混合溶液的色谱图，保留时间为15.623min和13.793min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰；图2为对照品溶液的色谱图，保留时间为13.843min的色谱峰为乙酰半胱氨酸异构体衍生物色谱峰；表明乙酰半胱氨酸与其对映异构体可以达到基线分离，能准确测定乙酰半胱氨酸中对映异构体杂质。
实施例2
待测样品1：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠异丙醇溶液3ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂(S)-(-)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置50℃水浴保温18min，放冷，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝89∶11∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图3为混合溶液的色谱图，保留时间为15.780min和13.784min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰。
实施例3
待测样品2：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠异丙醇溶液3ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂(S)-(-)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置50℃水浴保温18min，放冷，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝89∶11∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图4为混合溶液的色谱图，保留时间为15.619min和13.798min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰。
实施例4
待测样品3：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠异丙醇溶液3ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂(S)-(-)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置50℃水浴保温18min，放冷，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝89∶11∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图5为混合溶液的色谱图，保留时间为15.112min和13.620min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰。
实施例5
待测样品4：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠乙醇溶液3ml，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂3-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置50℃水浴保温20min，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-异丙醇-冰醋酸＝90∶10∶0.09；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图；。
图6为混合溶液的色谱图，保留时间为15.623min和13.723min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰。
实施例6
待测样品4：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液3ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂苯异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置50℃水浴保温24min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有直链淀粉-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-甲酸＝88∶12∶0.13；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图7为混合溶液的色谱图，保留时间为15.692min和13.769min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰。
实施例7
待测样品4：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液3ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置50℃水浴保温20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝90∶10∶0.11；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图8为混合溶液的色谱图，保留时间为15.710min和13.884min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰。
实施例8
待测样品4：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，溶液的pH为中性，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，待用；
另取乙酰半胱氨酸异构体对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液3ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密量取对照品母液1ml，置20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，加入到上述待用的样品溶液中，再精密加入衍生试剂(R)-(+)-ɑ-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置60℃水浴保温22min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝90∶10∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图9为混合溶液的色谱图，保留时间为15.726min和13.880min的色谱峰分别为乙酰半胱氨酸衍生物及其对映异构体衍生物色谱峰。
实施例9
供试品：精密量取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，精密加入衍生试剂(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置55℃水浴保温20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
另取乙酰半胱氨酸异构体25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液3ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法进行衍生化处理，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液，精密量取对照品母液1ml置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝90∶10∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图10为对照品溶液的色谱图，保留时间在4.0～6.0min之间的色谱峰为过量的衍生试剂色谱峰；保留时间为13.798min的色谱峰为乙酰半胱氨酸异构体衍生物色谱峰。图11供试品溶液，保留时间为15.590min的色谱峰为乙酰半胱氨酸衍生物色谱峰，对映异构体衍生物位置处未出峰，说明样品溶液中无乙酰半胱氨酸对映异构体。表明乙酰半胱氨酸与其异构体和过量的衍生试剂可以达到基线分离，能准确测定乙酰半胱氨酸中对映异构体杂质。
实施例10
精密量取甲醇5ml，置10ml量瓶中，精密加入衍生试剂(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置55℃水浴保温20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得空白溶液；
分别精密量取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝90∶10∶008；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图12空白溶液的色谱图，保留时间在4.0～7.0min处的色谱峰为衍生试剂峰；保留时间在10～25min内无色谱峰，表明衍生试剂不干扰测定。
实施例11
对照品：精密称取N-乙酰基-L-半胱氨酸100mg，置100ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液至中性，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，精密加入衍生试剂(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置55℃水浴保温20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
精密量取对照品溶液10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝90∶10∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图13为对照品溶液的色谱图，保留时间为15.043min的色谱峰为N-乙酰基-L-半胱氨酸衍生物色谱峰。
实施例12
精密称取乙酰半胱氨酸原料药100mg，置100ml量瓶中，加0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液至中性，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，精密加入衍生试剂(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯10μl，密塞，摇匀，置55℃水浴保温20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为乙酰半胱氨酸原料药溶液；
精密量取乙酰半胱氨酸原料药溶液10μl，注入高相液相色谱仪，固定相：表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶，流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸＝90∶10∶0.1；流速为每分钟1.2ml；紫外检测器：检测波长为215nm；进样体积：10μl。记录色谱图。
图13为乙酰半胱氨酸原料药溶液的色谱图，保留时间为14.994min的色谱峰为乙酰半胱氨酸衍生物色谱峰。
综上所述，乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，衍生反应条件温和，反应速度快，N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体衍生物峰保留时间具有差异，将N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体分离，并且N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体的衍生物出峰时间短，一般小于18min，可大大提高分析检测的效率。衍生试剂保留时间短，过量的衍生试剂不干扰N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的测定。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，其特征在于，在有机溶剂中，使用衍生化试剂与N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体进行衍生化反应，制备得到N-乙酰基-L-半胱氨酸及其异构体的衍生化产品，再使用正相高效液相色谱法进行分离和检测；
所述衍生化试剂采用异氰酸酯类；
所述异氰酸酯类采用(R)-(+)-a-甲基苄基异氰酸酯、(S)-(-)-a-甲基苄基异氰酸酯、3-甲基苄基异氰酸酯和苯异氰酸酯中的至少一种；
所述有机溶剂采用甲醇、乙醇或异丙醇中的至少一种；
所述衍生化反应包括以下步骤：
所述N-乙酰基-L-半胱氨酸溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸的衍生化产品；
所述N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体的衍生化产品；
所述N-乙酰基-L-半胱氨酸溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，待用，所述N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体溶于氢氧化物溶液并采用有机溶剂稀释，加入待用溶液，然后加入衍生化试剂进行反应，获得N-乙酰基-L-半胱氨酸及其对映异构体的衍生化产品；
正相液相色谱柱的固定相采用多糖类手性填料；
所述多糖类手性填料采用表面涂覆有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶、表面涂覆有直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶中的一种；
所述正相液相色谱柱采用的流动相为正己烷-低级醇混合液，正己烷与低级醇的体积比为88～95∶5～12；
所述流动相的流速为1.1～1.3ml/min；
检测波长为200nm～230nm；
所述流动相还包括酸碱调节剂，所述酸碱调节剂采用甲酸、冰醋酸、三氟乙酸中的至少一种；
所述正己烷-低级醇混合液与酸碱调节剂的体积比为100∶0.05～0.15；
所述低级醇采用无水乙醇或异丙醇。
2.根据权利要求1所述的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，其特征在于，
所述氢氧化物溶液采用氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液；
所述N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或所述N-乙酰基-L-半胱氨酸对映异构体与所述氢氧化物的质量比为4～5∶1。
3.根据权利要求1所述的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，其特征在于，
反应温度为45℃～65℃；
反应时间为15min～25min。
4.根据权利要求1所述的乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法，其特征在于，还包括利用外标法以色谱图的峰面积计算乙酰半胱氨酸对映异构体的质量。
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