CN114200034A - 一种维纳卡兰有关物质的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种盐酸维纳卡兰中间体的对映异构体的分离与分析测定方法，选用硅胶表面共价键合有纤维素‑三‑(3,5‑二氯苯基氨基甲酸酯)为填充剂的手性固定相，以一定比例的正己烷‑无水乙醇‑三氟乙酸混合溶剂为流动相，用于分离和分析盐酸维纳卡兰中间体A4的对映异构体。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱法，尤其涉及是一种拆分盐酸维纳卡兰中间体的对映异构体的手性拆分方法，本发明属于化学分析领域。
背景技术
盐酸维纳卡兰(vernakalant hydrochloride)，[CAS：748810-28-8化学名为(3R)-1-[(1R,2R)-2-[2-(3,4-二甲氧基苯基)乙氧基]环己基]-3-吡咯烷醇盐酸盐]，化学结构式如下：
维纳卡兰是一种新型的心房选择性的III类抗心律失常药物。由加拿大CardionmePharma制药公司和美国Astellas Pharma制药公司共同研制开发，作用机制是在心房颤动发作期选择性地阻滞心房的钠和钾(IKur)离子通道，抑制IKur电流能延长心房的动作电位时程，降低发生心律失常的危险。从现有的数据来看，在转复新近发生的心房颤动上它显示良好的有效性和安全性，疗效好于胺碘酮，临床上用于治疗心房纤维性颤动。
维纳卡兰及其中间体可通过文献中公开的方法合成：
维纳卡兰及其中间体A4有多个手性碳原子，存在着多种对映异构体。由于细胞表达的不同，使得盐酸维纳卡兰对映体在药代动力学方面存在着显著的差异。将其对映异构体有效的检测或分离除去，是维纳卡兰研发过程中质量控制中的难点。因此，建立一种好的分离维纳卡兰或中间体的对映异构体的高效液相色谱方法，具有重要的应用价值。一是为合成、分离纯化的工艺改进提供依据；二是为制剂质量提供依据；三是用于探讨对映体在动物或人体内的转化或代谢规律，为临床合理用药提供依据。
迄今为止，对于分离或检测维纳卡兰或其中间体的光学异构体，还没有文献报道。
维纳卡兰中间体A4如式(III)所示，由于含有手性中心，存在着多种对映异构体，其中一种光学异构体如式(IV)所示，由于结构相近，在检测和分离方面存在较大的难度。
药物的研发过程中，为保证药物的安全有效，需要对药物原料及其制剂中的杂质进行研究、检测和监控。药品在临床使用过程中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关，与杂质的影响也密不可分。为保证临床安全用药，必须严格控制药品中的杂质含量。
发明内容
本专利申请的发明人发现了一种高效液相色谱法，可以将维纳卡兰中间体A4的对映异构体进行有效分离。本发明方法操作简便、成本低廉，能简单、快速、准确地拆分维纳卡兰中间体A4的对映异构体。
本发明的目的在于提供一种既简便又快速的拆分维纳卡兰中间体A4的对映异构体的高效液相色谱方法，从而实现式(III)所示的维纳卡兰中间体A4的与式(IV)所示的维纳卡兰中间体A4对应异构体的有效分离与准确测定。
具体地说，在本发明的一种实施方案中，提供了一种维纳卡兰有关物质的分析方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，将待测物在纤维类手性柱中进行洗脱；所述的纤维类手性柱优选为纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱；
所述待测物是包含以下式(I)的化合物和/或其对映异构体式(II)
其中R各自独立地选自氢原子、C1-3烷基、C1-3烷氧基、羟基、氨基、巯基、羰基、醛基、羧基、硝基、氰基、酯基、酰胺基、卤素、C1-3卤代烷基、磺酰基、磺酸基、季铵基；
优选的，所述待测物是包含式(III)的维纳卡兰中间体A4和/或维纳卡兰中间体A4的对映异构体式(IV)：
在本发明提供的一种实施方案中，一种维纳卡兰有关物质的分析方法，以正己烷-醇类溶剂-酸类溶剂的混合溶剂为流动相，所述醇类溶剂选自无水甲醇、无水乙醇、乙醇-异丙醇、异丙醇中的一种或多种；优选为无水乙醇；所述酸类溶剂选自冰醋酸、三氟乙酸、甲酸中的一种或多种，优选为三氟乙酸。
在本发明提供的一种实施方案中，所述纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱为DAICEL
优选的，所述DAICEL
的长度是50mm-300mm，进一步优选的，为250mm；所述
的粒径为1μm-10μm，优选的为3μm；更优选的，所述DAICEL
为4.6mm×250mm，3μm。
在本发明提供的一种实施方案中，所述正己烷-醇类溶剂-酸类溶剂的混合溶剂为流动相的体积比为85：15～95：5：0.5；优选为85：15：0.08～95：5：0.12，进一步优选为85：15：0.1～95：5：0.1；流速为0.5-1.2ml/min，进一步优选为0.8-1.1ml/min，最优选为1.0ml/min。
本发明提供的一种实施方案中，所述正己烷-醇类溶剂-酸类溶剂的混合溶剂为流动相是正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的混合溶剂；所述正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的混合溶剂的体积比为86:14:0.1；和/或，流速为1.0mL/min。
关于维纳卡兰中间体A4及其对映异构体的拆分无现有技术报道。本发明通过大量的实验摸索发现，采用常规填料的手性分离柱均难以实现维纳卡兰中间体A4及其对映异构体的完全分离并获得良好的峰形，尤其是方法的运行时间较短时，对映异构体的完全拆分存在较大的难度。再者，在采用本发明所使用的特定手性分离柱条件下，如果流动相组成和配比不在所选范围内，也难以有效的分离，充分说明本发明选择存在明显的特异性。
在本发明提供的一种实施方案中，提供了一种高效液相色谱拆分和定量维纳卡兰中间体A4的对映异构体的方法，包括如下步骤：
(1)取维纳卡兰中间体A4样品适量，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml约含维纳卡兰中间体A4样品0.2mg的供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(2)设置流动相流速为0.5-1.2ml/min，优选1.0ml/min，检测波长为210±2nm，优选210nm，柱温：25～35℃，优选30℃；
(3)取步骤(1)的样品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
其中，所述的液相色谱仪为高效液相色谱仪，可选用沃特世e2695高效液相色谱仪；
其中，色谱柱：纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱；
检测波长：210nm；
流速：1.0mL/min；
进样体积：10μl。
其中，所述正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的混合溶剂为流动相的体积比为85：15：0.08～95：5：0.12，优选86：14：0.1。流速优选0.5-1.2ml/min，最优选1.0ml/min。
本发明通过选取特定的分离柱和流动相，通过流速，柱温，以及流动相的组成比例选择，使得本发明整体的分离效果尤为更佳。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
(1)采用纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm)，能够有效的拆分维纳卡兰中间体A4对映异构体；
(2)选择流动相溶解样品，所述正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的混合溶剂为流动相的体积比为85：15：0.08～95：5：0.12，改善了色谱峰峰形；选择进样体积10μl，柱温为30℃，提高了色谱峰的对称性。本发明解决了维纳卡兰中间体A4对映体的拆分问题，对于药物代谢研究、手性杂质和纯度控制等诸多方面均具有重要意义。
(3)选择流动相溶解样品，所述正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的混合溶剂为流动相的体积比为86：14：0.1，在优选的各条件配合下，实现了维纳卡兰中间体A4对映体在极短的时间(20min)内的最优分离。
附图说明
图1是维纳卡兰中间体A4色谱图；
图2是维纳卡兰中间体A4对映体的色谱图；
图3是维纳卡兰中间体A4样品供试品溶液的色谱图；
图4是在实施例2色谱条件下，供试品溶液的色谱图；
图5是在实施例3色谱条件下，供试品溶液的色谱图；
图6是在实施例4色谱条件下，供试品溶液的色谱图；
图7是在实施例5色谱条件下，供试品溶液的色谱图；
图8是对照实施例1色谱条件下，供试品溶液的色谱图；
图9是对照实施例2色谱条件下，供试品溶液的色谱图；
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点会随着描述而更加清楚。但实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节与小试进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
开发过程：方法开发初期进行色谱柱筛选时，发现色谱柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm对中间体A4和其对映异构体有分离效果，于是在色谱柱IC-3，4.6mm×250mm，3μm上进一步优化。当以正己烷：异丙醇：三氟乙酸(80:20:0.1)为流动相等度洗脱时，中间体A4和其对映异构体能够明显分离，但是供试品溶液中的未知杂质峰容易对A4异构体造成干扰。调整流动相中的异丙醇比例后发现：当异丙醇比例增加时，该未知杂质峰出现在A4异构体的峰前；异丙醇比例降低时，该未知杂质峰出现在A4异构体的峰后。于是通过调低调整流动相比例来增大分离度，但是最终都无法达到预期效果。考虑到异丙醇比例增加时(混合溶液极性增大时)，杂质峰出现在A4异构体的峰前这个现象，试图将杂质峰在A4异构体之前洗脱出来，于是将异丙醇替换为极性更大的乙醇，通过调整流动相比例和流速，最终确定方法以正己烷：乙醇：三氟乙酸(86:14:0.1)为流动相；检测波长210nm；柱温30℃；流速为1.0ml/min。
实施例1
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm)；
流动相体积比：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的比例为86：14：0.1；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl。
实验步骤：
维纳卡兰中间体A4：准确称取维纳卡兰中间体A4对照品适量，用流动相溶解后，用流动相稀释成每1ml含约2μg的溶液，精密量取10μl注入色谱仪，记录色谱图，维纳卡兰中间体A4色谱图见图1，出峰在17.098min。
维纳卡兰中间体A4对映体：准确称取维纳卡兰中间体A4的对映体适量，用流动相溶解后，用流动相稀释成每1ml含10μg的溶液，维纳卡兰中间体A4对映体的色谱图见图2，出峰在14.778min。
供试品溶液：准确称取维纳卡兰中间体A4样品适量，用流动相溶解后，用流动相稀释成每1ml含约0.2mg的溶液。维纳卡兰中间体A4样品的色谱图见图3，图中1号峰为A4的对映异构体，保留时间为14.843min；2号峰为维纳卡兰中间体A4，保留时间为17.155min，A4异构体、未知杂质峰和维纳卡兰中间体A4完全分离，分离度分别是2.0和2.4，且对称性良好。在该色谱条件下维纳卡兰中间体A4及其对映异构体可完全分离，且与未知杂质峰也能很好的分离；可采用外标法或自身对照法对异构体含量进行准确定量。
实施例2
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm)；
流动相体积比：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的比例为85：15：0.1；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl。
试验步骤及结果：
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4，维纳卡兰中间体A4及其异构体的出峰时间分别为15.571min和14.155min，二者分离度为3.0，且对称性良好。在该色谱条件下维纳卡兰中间体A4及其对映异构体完全分离。
实施例3
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm)；
流动相体积比：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的比例为95：5：0.1；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl。
试验步骤及结果：
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5，维纳卡兰中间体A4及其异构体的出峰时间分别为44.211min和36.910min，二者分离度为5.7，且对称性良好。在该色谱条件下维纳卡兰中间体A4及其对映异构体完全分离。
实施例4
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm)；
流动相体积比：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的比例为90：10：0.10；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl。
试验步骤及结果：
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图6，维纳卡兰中间体A4及其异构体的出峰时间分别为28.358min和23.886min，二者分离度为5.5，且对称性良好。在该色谱条件下维纳卡兰中间体A4及其对映异构体完全分离。
实施例5
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm)；
流动相体积比：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的比例为85：15：0.1；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：0.5ml/min；
进样体积：10μl。
试验步骤及结果：精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图7，维纳卡兰中间体A4、未知杂质峰及A4异构体的出峰时间分别为31.433min、28.424min和27.330，分离度分别为1.5、3.5，且对称性良好。在该色谱条件下维纳卡兰中间体A4及其对映异构体完全分离。
对比实施例1：
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，5μm)流动相体积比：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的比例为86：14：0.1；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl。
试验步骤及结果：精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图8。由谱图看出，两个物质未完全分离，在该色谱条件下二者无法实现有效的分离，更不可能对其异构体含量进行准确定量。
对比实施例2
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱DAICEL
4.6mm×250mm，3μm)；
流动相体积比：正己烷-无水乙醇-二乙胺的比例为86：14：0.1；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl。
试验步骤及结果：精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图9。由谱图看出，维纳卡兰中间体A4及其对应异构体在该色谱条件下响应偏低，且基线噪音大，在系统适用性溶液中并未看到维纳卡兰中间体A4异构体的谱峰，增大浓度会导致谱峰变宽，峰形变差。在该色谱条件下二者无法实现有效的分离，更不可能对其异构体含量进行准确定量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种维纳卡兰有关物质的分析方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，将待测物在纤维类手性柱中进行洗脱；所述的纤维类手性柱优选为纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱；
所述待测物是包含以下式(I)的化合物和/或其对映异构体式(II)
其中R各自独立地选自氢原子、C1-3烷基、C1-3烷氧基、羟基、氨基、巯基、羰基、醛基、羧基、硝基、氰基、酯基、酰胺基、卤素、C1-3卤代烷基、磺酰基、磺酸基、季铵基；
优选的，所述待测物是包含式(III)的维纳卡兰中间体A4和/或式(IV)的维纳卡兰中间体A4的对映异构体：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以正己烷-醇类溶剂-酸类溶剂的混合溶剂为流动相，所述醇类溶剂选自无水甲醇、无水乙醇、乙醇-异丙醇、异丙醇中的一种或多种；优选为无水乙醇；所述酸类溶剂选自冰醋酸、三氟乙酸、甲酸中的一种或多种，优选为三氟乙酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱为DAICEL 
IC-3，优选的，所述DAICEL
IC-3的长度是50mm-300mm，进一步优选的，为250mm；所述
IC-3的粒径为1μm-10μm，优选的为3μm；更优选的，所述DAICEL
IC-3为4.6mm×250mm，3μm；
和/或，所述正己烷-醇类溶剂-酸类溶剂的混合溶剂为流动相的体积比为85：15～95：5：0.5；优选为85：15：0.08～95：5：0.12，进一步优选为85：15：0.1～95：5：0.1；
和/或，流速为0.5-1.2ml/min，优选的，0.8-1.1ml/min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述正己烷-醇类溶剂-酸类溶剂的混合溶剂为流动相是正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的混合溶剂；所述正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的混合溶剂的体积比为86:14:0.1；
和/或，流速为1.0mL/min。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)取维纳卡兰中间体A4样品适量，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml约含维纳卡兰中间体A4样品0.2mg的供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(2)设置流动相流速为0.5-1.2ml/min，最优选1.0ml/min，检测波长为210±2nm，优选210nm，柱温：25～35℃，优选30℃；
(3)取步骤(1)的样品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为210nm；柱温30℃。
7.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，拆分方法为，
仪器与条件：沃特世e2695高效液相色谱仪
色谱柱：纤维素-三((3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性柱(DAICEL
IC-3，4.6mm×250mm，3μm)；
流动相体积比：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸的比例为86：14：0.1；
检测波长：210nm；
柱温30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl。
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