CN112213407B - 一种左奥硝唑有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种左奥硝唑有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，通过采用不同检测波长并组合梯度和等度洗脱，从而实现了左奥硝唑与有关物质IMP‑1至IMP‑8的有效分离和检测。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，更具体地说，涉及一种左奥硝唑有关物质的分析方法。
背景技术
左奥硝唑，化学名为：S-(-) - (3-氯-2-羟基丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑，化合物结构为：
南京圣和药业有限公司在中国专利申请CN1752749A中公开了一种通过高效液相色谱法检测奥硝唑光学对映体的方法，具体如下：(1)色谱条件：色谱柱采用纤维素酯类为固定相的手性柱；流动相为正己烷－甲基叔丁基醚－异丙醇－冰醋酸；检测波长为280nm～340nm。(2)采用有机溶剂将样品配为含奥硝唑消旋体0.05～0.5mg/ml的溶液。(3)测定，记录色谱图。
成都金典药物科技开发有限公司在中国专利申请CN102539564A中公开了一种奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法，该检测方法用于检测奥硝唑注射液中的杂质2-甲基-5-硝基咪唑和1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑)；HPLC检测条件：流动相为乙腈-水(或甲醇-水)体积比为：15-25∶75-85，杂质2-甲基-5-硝基咪唑及最大杂质检测波长为305-315nm。
扬子江药业集团南京海陵药业有限公司在中国专利申请CN102565271A中公开了一种奥硝唑的质量控制方法，采用高效液相色谱法（色谱条件为：色谱柱：反相C18柱，流动相：体积比为30：70：0.2的甲醇-水-冰醋酸，流速为1.0ml/min，检测波长为310nm，柱温为30℃）检测奥硝唑和2-甲基-5-硝基咪唑。
陕西合成药业股份有限公司;在中国专利申请CN107917979A中公开了一种分离分析左奥硝唑异构体的HPLC方法，采用高效液相色谱法，以直链淀粉键合硅胶为填充剂，水相（pH值2～9.0）与有机相以一定配比组合为流动相，流速为0.1～1.0ml/min，柱温为0～40℃，进样体积为0.1～100μl，使用梯度或等度进行洗脱分离。
为了保证左奥硝唑用药的临床用药安全，本领域仍渴望可以全面检测左奥硝唑质量，特别是其有关物质的检测。
发明内容
本发明人经大量的研究，成功地开发了一种左奥硝唑有关物质的检测方法。
本发明提供了一种左奥硝唑有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，并按照如下检测条件和操作进行检测：
检测条件1为：
色谱柱1：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相1：以甲醇为流动相1A，水为流动相1B；进行梯度洗脱；
检测波长1：310nm至320nm；优选地，为318nm；
柱温1：25℃-40℃，优选地为，30℃；
流速1：1.0 ml/min -1.5 ml/min ，优选地，为1.2ml/min；
对照品溶液1的制备：分别取对照品IMP01、对照品IMP02、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml含对照品IMP02 0.2ug，含对照品IMP01、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06各2.5µg的对照品溶液1；
供试品溶液1的制备：取约含左奥硝唑50mg的左奥硝唑原料药，置20ml量瓶中，加甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg的溶液，作为供试品溶液1；
在检测条件1下，精密量取供试品溶液1及对照品溶液1各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
在本申请的实施方案中，所述的检测方法还包括：
检测条件2为：
色谱柱2：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相2：以甲醇与水的体积比为（15~25）:（75~85）的甲醇水溶液为流动相2，优选地，甲醇与水的体积比为22:78；进行等度洗脱；
检测波长2：310nm至320nm；优选地，为310nm；
柱温2：25℃-40℃，优选地为，30℃；
流速2：0.9 ml/min -1.2 ml/min ，优选地，为1.0ml/min；
检测条件3为：
色谱柱3：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相3：以甲醇为流动相3A，水为流动相3B；进行梯度洗脱；
检测波长3：200nm至220nm；优选地，为210nm；
柱温3：25℃-40℃，优选地为，30℃；
流速3：1.0 ml/min -1.5 ml/min ，优选地，为1.2ml/min；
对照品溶液2的制备：取对照品IMP05适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml含对照品IMP05 0.2ug的对照品溶液2；
供试品溶液2的制备：取约含左奥硝唑50mg的左奥硝唑原料药，置20ml量瓶中，加甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg的供试品溶液2；
对照品溶液3的制备：分别取对照品IMP07、对照品IMP08对照品适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液并稀释制成每1ml含对照品IMP08 0.2ug的溶液，含对照品IMP07 2.5µg的对照品溶液3；
供试品溶液3的制备：取约含左奥硝唑50mg的左奥硝唑原料药，置20ml量瓶中，加甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg的溶液，作为供试品溶液3；
在检测条件2下，精密量取供试品溶液2及对照品溶液2各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；和
在检测条件3下，精密量取供试品溶液3及对照品溶液3各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
在一些实施方案中，所述检测方法采用高效液相色谱法，并按照如下检测条件和操作进行检测：
检测条件1为：
色谱柱1：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相1：以甲醇为流动相1A，水为流动相1B；进行梯度洗脱；
检测波长1：310nm至320nm；优选地，为318nm；
柱温1：25℃-40℃，优选地为，30℃；
流速1：1.0 ml/min -1.5 ml/min ，优选地，为1.2ml/min；
检测条件2为：
色谱柱2：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相2：以甲醇与水的体积比为（15~25）:（75~85）的甲醇水溶液为流动相2，优选地，甲醇与水的体积比为22:78；进行等度洗脱；
检测波长2：310nm至320nm；优选地，为；
柱温2：25℃-40℃，优选地为，30℃；310nm
流速2：0.9 ml/min -1.2 ml/min ，优选地，为1.0ml/min；
检测条件3为：
色谱柱3：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相3：以甲醇为流动相3A，水为流动相3B；进行梯度洗脱；
检测波长3：200nm至220nm；优选地，为210nm；
柱温3：25℃-40℃，优选地为，30℃；
流速3：1.0 ml/min -1.5 ml/min ，优选地，为1.2ml/min；
对照品溶液1的制备：分别取对照品IMP01、对照品IMP02、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml含对照品IMP02 0.2ug，含对照品IMP01、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06各2.5µg的对照品溶液1；
供试品溶液1的制备：取约含左奥硝唑50mg的左奥硝唑原料药，置20ml量瓶中，加甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg的溶液，作为供试品溶液1；
对照品溶液2的制备：取对照品IMP05适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml含对照品IMP05 0.2ug的对照品溶液2；
供试品溶液2的制备：取约含左奥硝唑50mg的左奥硝唑原料药，置20ml量瓶中，加甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg的供试品溶液2；
对照品溶液3的制备：分别取对照品IMP07、对照品IMP08对照品适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液并稀释制成每1ml含对照品IMP08 0.2ug的溶液，含对照品IMP07 2.5µg的对照品溶液3；
供试品溶液3的制备：取约含左奥硝唑50mg的左奥硝唑原料药，置20ml量瓶中，加甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg的溶液，作为供试品溶液3；
在检测条件1下，精密量取供试品溶液1及对照品溶液1各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；和
在检测条件2下，精密量取供试品溶液2及对照品溶液2各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；和
在检测条件3下，精密量取供试品溶液3及对照品溶液3各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
在上述实施方案中，所述流动相1的梯度洗脱为：
| t/min | 0 | 20 | 50 | 60 | 70 | 71 | 80 | |
| 流动相1B体积% | 100 | 80 | 80 | 40 | 40 | 100 | 100 | ； |
或者，所述流动相1的梯度洗脱为：
| t/min | 0 | 20 | 50 | 60 | 70 | |
| 流动相1B体积% | 100 | 80 | 80 | 40 | 40 | 。 |
在上述实施方案中，所述流动相3的梯度洗脱为：
| t/min | 0 | 20 | 50 | 60 | 70 | 71 | 80 | |
| 流动相3B体积% | 100 | 80 | 80 | 40 | 40 | 100 | 100 | ； |
或者，所述流动相3的梯度洗脱为：
| t/min | 0 | 20 | 50 | 60 | 70 | |
| 流动相3B体积% | 100 | 80 | 80 | 40 | 40 | 。 |
在上述实施方案中，还可包括：
系统适应性溶液1的制备：精密称取左奥硝唑、对照品IMP01、对照品IMP02、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含各对照品2.5µg的系统适应性溶液1。
在上述实施方案中，还可包括：
精密量取1.0ml供试品溶液1至100ml容量瓶中，加甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液定容至刻度，作为对照溶液1。
在上述实施方案中，还可包括：在检测条件1下，精密量取系统适用性溶液1，供试品溶液1、对照溶液1及对照品溶液1各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
在上述实施方案中，还可包括：
系统适应性溶液2的制备：分别取左奥硝唑、对照品IMP05适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含对照品IMP05 2.5µg的系统适应性溶液2。
在上述实施方案中，还可包括：
在检测条件2下，精密量取系统适应性溶液2、供试品溶液2及对照品溶液2各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
在上述实施方案中，还可包括：
系统适应性溶液3的制备：分别取左奥硝唑、对照品IMP07、对照品IMP08适量，用甲醇与水的体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含各对照品IMP07和对照品IMP08 2.5µg的系统适应性溶液3。
在上述实施方案中，还可包括：
在检测条件3下，精密量取系统适应性溶液3、供试品溶液3及对照品溶液3各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
在上述实施方案中，在检测条件1得到的色谱图中，扣除供试品溶液1色谱图中的溶剂峰、梯度峰，供试品溶液1的色谱图中如显杂质峰，对照品IMP01、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06按外标法以峰面积计算不得过0.10%，对照品IMP02按外标法以峰面积计算不得过0.008%，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主成分峰面积的0.1倍（0.10%），杂质总量不得过0.20%。
在上述实施方案中，在检测条件2的色谱图中，扣除供试品溶液色谱图中的溶剂峰、梯度峰，供试品溶液2的色谱图中如显杂质峰，对照品IMP05按外标法以峰面积（双峰峰面积合计）计算不得过0.008%。
在上述实施方案中，在检测条件3的色谱图中，扣除供试品溶液3色谱图中的溶剂峰、梯度峰，供试品溶液3的色谱图中如显杂质峰，对照品IMP07按外标法以峰面积计算不得过0.10%，对照品IMP08按外标法以峰面积计算不得过0.008%。
在上述实施方案中，在检测条件1下，系统适应性溶液1的色谱图中左奥硝唑与相邻杂质峰、各杂质峰之间分离度应符合规定。
在上述实施方案中，在检测条件2下，系统适应性溶液2的色谱图中左奥硝唑与相邻杂质峰、各杂质峰之间分离度应符合规定。
在上述实施方案中，在检测条件3下，系统适应性溶液3的色谱图中左奥硝唑与相邻杂质峰、各杂质峰之间分离度应符合规定。
在本发明的实施方案中，所述对照品IMP-1至对照品IMP-8的化学名及其结构如下：
对照品IMP01
对照品IMP02
对照品IMP03
对照品IMP04
对照品IMP05
对照品IMP06
对照品IMP07
对照品IMP08
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法也也可以用于奥硝唑有关物质的检测。
为了严格控制好左奥硝唑的质量，能高效的检测左奥硝唑中有关物质的含量，本发明人经过大量实验对检测波长、降解试验及流动相梯度进行筛选。
1. 本发明对检测波长进行了筛选，分别对IMP01~ IMP08进行了紫外扫描。结果表明，IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06及左奥硝唑在318nm附近有最大吸收，IMP07和IMP08在210nm附近有最大吸收，故拟定有关物质的检测波长为318nm，IMP07和IMP08的方法检测波长为210nm。
2. 本发明对检测条件1、3的流动相及色谱柱进行了考察，
条件A: 色谱柱：Penomenex Luna C18（2），4.6×250mm，5mm； 流动相：甲醇-水（体积比20:80）现有方法（2015版中国药典二部P161页）；
条件B: 色谱柱：Ultimate XB-C18，4.6×250mm，5mm；流动相：A相：甲醇； B相：水；梯度洗脱程序：
| 时间min | 0 | 20 | 50 | 60 | 70 |
| B% | 100 | 80 | 80 | 40 | 40 |
条件C: 色谱柱：Penomenex Luna C18（2），4.6×250mm，5mm；流动相：A相：甲醇； B相：水；梯度洗脱程序：
| 时间min | 0 | 20 | 50 | 60 | 70 |
| B% | 100 | 80 | 80 | 40 | 40 |
结果表明，条件A无法分离，而条件B、C，即A相甲醇—B相水（梯度洗脱）：各杂质出峰时间合适，主峰与杂质间、杂质峰之间分离度符合要求，空白梯度干扰小，样品检出杂质个数多，该条件可作为有关物质研究方法。因此，选择选择色谱柱C18 (4.6×250mm，5mm)，以甲醇、水为流动相进行梯度洗脱，能有效的检测及分离本品的有关物质。
3. 本发明进行了左奥硝唑的降解破坏试验，分别考察了酸、碱、氧化、水浴、光照、高温、高湿等条件。结果表明，在选定的色谱条件下，可以有效检测出破坏试验产生的降解产物峰，降解回收率在97%-100%，回收率符合要求。峰纯度均大于阈值999，符合规定。
有益效果：本发明提供的左奥硝唑中有关物质的质量控制方法具有以下优点：
本发明根据左奥硝唑中各有关物质成分的结构性质及理化特点，通过大量实验筛选出最佳的检测波长、流动相筛选、降解试验等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的左奥硝唑中有关物质的质量控制方法，采用双波长、梯度洗脱的方式可以有效的检出从现有方法的3个已知杂质增加至8个已知杂质，方法的稳定性好、对各分析成分的分离度好，可以灵敏准确的定量检测分析各化合物。因此，本发明提供的左奥硝唑中有关物质的质量控制方法可以客观、全面、准确的评价左奥硝唑氯化钠注射剂的活性成分左奥硝唑的质量，对控制左奥硝唑的质量和保证临床用药安全具有重要意义。
附图说明
图1表示的是实施例1对照品IMP01紫外扫描光谱图；
图2A表示的是实施例2中波长318nm的系统适用性HPLC图；
图2B表示的是实施例2中波长318nm的杂质对照HPLC图；
图2C表示的是实施例2中波长318nm的样品HPLC图；
图2D表示的是实施例2中波长318nm的100%加标样品HPLC图；
图2E表示的是实施例2中波长210nm的系统适用性HPLC图；
图2F表示的是实施例2中波长210nm的杂质对照HPLC图；
图2G表示的是实施例2中波长210nm的样品HPLC图；
图2H表示的是实施例2中波长210nm的100%加标样品HPLC图；
图3A表示的是对比例1中波长318nm的系统适用性HPLC图；
图3B表示的是对比例1中波长210nm的系统适用性HPLC图；
图3C表示的是对比例1中波长318nm的IMP01 HPLC图；
图3D表示的是对比例1中波长210nm的IMP08 HPLC图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例来进一步说明本发明的技术方案；应当理解为，下述实施例并非对保护范围的限制。
实施例1
紫外波长的选择
在本申请的实施例中，采用紫外分析仪Shimadzu UV2450进行扫描，溶剂为20%甲醇水溶液，对照品IMP01浓度为10μg/ml，紫外光谱图如图1所示，其中，1的波长为309.50。
对照品IMP01、对照品IMP02、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP05、对照品IMP06及左奥硝唑在318nm附近有最大吸收，对照品IMP07和对照品IMP08在210nm附近有最大吸收，故拟定有关物质的检测波长为318nm，对照品IMP07和对照品IMP08的方法检测波长为210nm。
试验结果表明，各已知杂质与左奥硝唑的紫外吸收特征显示，IMP01~IMP06和左奥硝唑最大吸收均在309nm~320nm范围内，IMP07及IMP08最大吸收均在200nm~220nm范围内参考中国药典2015版中左奥硝唑的检测条件，选择318nm/210nm波长作为本品有关物质条件考察的检测波长。
实施例2
试验条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm×5µm）
流动相：A相：甲醇 B相：水
按照下表进行梯度洗脱
检测波长：318nm； 流速：1.2ml/min；
进样体积：40µl； 柱温：30℃；
具体试验操作：
系统适用性试验：精密称取左奥硝唑及杂质对照品IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP06适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含各杂质2.5µg的溶液作为系统适用性溶液，取系统适用性溶液40µl注入液相色谱仪，如图2A，左奥硝唑与相邻杂质峰、各杂质峰之间分离度应符合规定。
供试品溶液：取本品适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每lml中约含左奥硝唑（C7H10ClN3O3）2.5mg的溶液，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇水溶液稀释至刻度，作为对照溶液。
杂质对照溶液：分别取IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP06对照品适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml含IMP02杂质0.2µg/ml，含IMP01、IMP03、IMP04、IMP06杂质2.5µg的溶液作为杂质对照溶液。
供试品加标溶液的制备：取左奥硝唑约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加对照品溶液1的溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品加标溶液。
精密量取供试品溶液、对照溶液、供试品加标溶液与杂质对照溶液各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图（杂质对照HPLC如图2B、样品HPLC如图2C、100%供试品加标HPLC如图2D），扣除供试品溶液色谱图中的溶剂峰、梯度峰，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，IMP01、IMP03、IMP04、IMP06按外标法以峰面积计算不得过0.1%，IMP02按外标法以峰面积计算不得过0.008%，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主成分峰面积的0.1倍（0.1%），杂质总量不得过0.2%。
对照品IMP05
试验条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如Waters sunfire C18，4.6×150mm×3.5µm）
流动相：甲醇-水（体积比为22:78）
检测波长：310nm；流速：1.0ml/min；进样体积：40µl；柱温：30℃；
具体试验操作：
系统适用性试验：精密称取左奥硝唑及杂质对照品IMP05适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含各杂质2.5µg的溶液作为系统适用性溶液，取系统适用性溶液40µl注入液相色谱仪，左奥硝唑与相邻杂质峰、IMP05峰与相邻杂质峰之间分离度应符合规定。
供试品溶液：取本品适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每lml中约含左奥硝唑（C7H10ClN3O3）2.5mg的溶液，作为供试品溶液。
杂质对照溶液：取IMP05对照品适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml含IMP05杂质0.2µg/ml的溶液作为杂质对照溶液。
精密量取供试品溶液与杂质对照溶液各40µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，扣除供试品溶液色谱图中的溶剂峰、梯度峰，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，IMP05按外标法以峰面积（双峰峰面积合计）计算不得过0.008%。
对照品IMP07、对照品IMP08
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm×5µm）
流动相：A相：甲醇 B相：水
按照下表进行梯度洗脱
检测波长：210nm； 流速：1.2ml/min；
进样体积：40µl； 柱温：30℃；
具体试验操作：
系统适用性试验：精密称取左奥硝唑及杂质对照品IMP07、IMP08适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含各杂质2.5µg的溶液作为系统适用性溶液，取系统适用性溶液40µl注入液相色谱仪，如图2E，左奥硝唑与相邻杂质峰、各杂质峰之间分离度应符合规定。
供试品溶液：取本品适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每lml中约含左奥硝唑（C7H10ClN3O3）2.5mg的溶液，作为供试品溶液。
杂质对照溶液：分别取IMP07、IMP08对照品适量，用甲醇与水体积比为20:80的甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml含IMP08杂质0.2µg/ml，含IMP07杂质2.5µg的溶液作为杂质对照溶液。
供试品加标溶液的制备：取左奥硝唑约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加对照品溶液3的溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品加标溶液。
精密量取供试品溶液、供试品加标溶液与杂质对照溶液各40µl，分别注入液相色谱仪（杂质对照HPLC如图2F、样品HPLC如图2G、100%供试品加标HPLC如图2H），记录色谱图，扣除供试品溶液色谱图中的溶剂峰、梯度峰，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，IMP07按外标法以峰面积计算不得过0.1%， IMP08按外标法以峰面积计算不得过0.008%。
具体结果见表1。
表1 左奥硝唑中有关物质的检测结果
由表1的实验结果表明，本发明提供的左奥硝唑有关物质的检测方法，各化合物和对照品具有很好的匹配度，具有良好的分离度，并且从本发明的实验结果表明，本发明配制的左奥硝唑样品中，IMP01、IMP02杂质的百分含量均小于0.1%，其余各杂质均未检出，也表明本发明样品的质量可靠性。
本发明提供的奥左硝唑的质量控制方法稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确的评价左奥硝唑注射剂的质量，对控制左奥硝唑氯化钠注射液活性成分的质量和保证临床用药的安全性具有重要意义。
对比例1
实验条件：
流动相：甲醇-水（体积比20:80）；
色谱柱：Penomenex Luna C18（2），4.6×250mm，5μm；
流速：1.2ml/min； 检测波长：318nm/210nm；
柱温：30℃； 进样量：40μl。
318nm的系统适用性HPLC图如图3A，210nm的系统适用性HPLC图如图3B，试验结论：主峰左奥硝唑与对照品IMP01~对照品IMP08分离度符合规定，但杂质对照品IMP01和杂质对照品IMP08分离度较差，分离度为0.809（210nm，如图3C）、0.770（318nm，如图3D），无法有效分离。
在下列对照品IMP08的制备例中MS的测定使用飞行时间质谱仪质谱仪（ESI），生产商：Waters，型号： LCT Premier 。核磁的测定使用核磁共振波谱仪，生产商：布鲁克，型号Bruker AV400。
制备例1
将左奥硝唑（5g，22.7mmol）、间氯过氧苯甲酸（7.86g，45.4 mmol），加入到100ml二氯甲烷中，控温20～30℃，反应20小时。反应毕，过滤除掉不溶物。收集滤液，柱层析（洗脱剂变化依次用二氯甲烷：甲醇=70：1），浓缩干得到5g黄色固体。收率93.8%。
1H-NMR（400MHz; DMSO）：δ8.512(s,1H), 5.910～5.923(d,1H), 4.650～4.692(d,1H), 4.229～4.289(t,1H), 4.048～4.078(s,1H), 3.681～3.776(m,2H), 2.459(s,3H)。
13C-NMR（400MHz; DMSO）：δ142.50, 131.93, 123.21, 69.17, 50.84, 47.01,9.10。
采用ESI源正离子检测：
得到对照品IMP08 [M+H]+236峰，[2M+H]+471峰，[2M+Na]+493峰
制备例2
将左奥硝唑（5g，22.7mmol）、间氯过氧苯甲酸（7.86g，45.4 mmol），加入到100ml四氢呋喃中，控温20～30℃，反应20小时。反应毕，过滤除掉不溶物。收集滤液，柱层析提纯。洗脱剂变化依次为二氯甲烷：甲醇=70：1，浓缩干得到4.5g黄色固体对照品IMP08，收率84.9%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种左奥硝唑原料药有关物质的检测方法，其特征在于：该检测方法采用高效液相色谱法，并按照如下检测条件和操作进行检测：
检测条件1为：
色谱柱1：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相1：以甲醇为流动相1A，水为流动相1B；进行梯度洗脱；洗脱程序为：
t/min 0 20 50 60 70
流动相1B体积％ 100 80 80 40 40
检测波长1：310nm至320nm；
柱温1：25℃-40℃；
流速1：1.0ml/min-1.5ml/min；
对照品溶液1的制备：分别取对照品IMP01、对照品IMP02、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06适量，用体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml含对照品IMP020.2ug，含对照品IMP01、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06各2.5μg的对照品溶液1；
对照品IMP01
对照品IMP02
对照品IMP03
对照品IMP04
对照品IMP06
供试品溶液的制备：取约含左奥硝唑50mg的左奥硝唑原料药，置20ml量瓶中，加体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg的溶液，作为供试品溶液；
在检测条件1下，精密量取供试品溶液及对照品溶液1各40μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：
检测条件2为：
色谱柱2：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相2：以甲醇与水的体积比为(15～25):(75～85)的甲醇水溶液为流动相2；进行等度洗脱；
检测波长2：310nm至320nm；
柱温2：25℃-40℃；
流速2：0.9ml/min-1.2ml/min；
以及检测条件3为：
色谱柱3：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相3：以甲醇为流动相3A，水为流动相3B；进行梯度洗脱；洗脱程序为：
t/min 0 20 50 60 70
流动相3B体积％ 100 80 80 40 40
检测波长3：200nm至220nm；
柱温3：25℃-40℃；
流速3：1.0ml/min-1.5ml/min；
对照品溶液2的制备：取对照品IMP05适量，用体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml含对照品IMP05 0.2ug的对照品溶液2；
对照品IMP05
对照品溶液3的制备：分别取对照品IMP07、对照品IMP08对照品适量，用体积比为20:80的甲醇水溶液并稀释制成每1ml含对照品IMP08 0.2ug的溶液，含对照品IMP07 2.5μg的对照品溶液3；
对照品IMP07
对照品IMP08
在检测条件2下，精密量取供试品溶液及对照品溶液2各40μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；和
在检测条件3下，精密量取供试品溶液及对照品溶液3各40μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：检测波长1为318nm；柱温1为30℃；流速1为1.2ml/min。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：检测波长2为310nm；柱温2为30℃；流速2为1.0ml/min；流动相2A与流动相2B的体积比为22:78；检测波长3为210nm；柱温3为30℃；流速3为1.2ml/min。
5.根据权利要求1至4任一项所述的检测方法，其特征在于，还包括：
系统适应性溶液1的制备：精密称取左奥硝唑、对照品IMP01、对照品IMP02、对照品IMP03、对照品IMP04、对照品IMP06适量，用体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含各对照品2.5μg的系统适应性溶液1。
6.根据权利要求1至4任一项所述的检测方法，其特征在于，还包括：
精密量取1.0ml供试品溶液至100ml容量瓶中，加体积比为20:80的甲醇水溶液定容至刻度，作为对照溶液1。
7.根据权利要求2或4所述的检测方法，其特征在于，还包括：
系统适应性溶液2的制备：分别取左奥硝唑、对照品IMP05适量，用体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含对照品IMP05 2.5μg的系统适应性溶液2。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，还包括：
在检测条件2下，精密量取系统适应性溶液2、供试品溶液及对照品溶液2各40μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
9.根据权利要求2或4所述的检测方法，其特征在于，还包括：
系统适应性溶液3的制备：分别取左奥硝唑、对照品IMP07、对照品IMP08适量，用体积比为20:80的甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml约含左奥硝唑2.5mg、约含各对照品IMP07和对照品IMP08 2.5μg的系统适应性溶液3。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，还包括：
在检测条件3下，精密量取系统适应性溶液3、供试品溶液及对照品溶液3各40μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
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Denomination of invention: A detection method for levononidazole related substances Effective date of registration: 20231125 Granted publication date: 20220809 Pledgee: Zijin Branch of Nanjing Bank Co.,Ltd. Pledgor: NAN JING CAVENDISH BIO-ENGINEERING TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980066950 |
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