CN109738536B - 一种运用高效液相色谱法分离苯甲醛和硝基苯甲醛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种运用高效液相色谱法分离苯甲醛和硝基苯甲醛各异构体的检测方法。本方法以C18与5‑氟苯基混合键合硅胶为固定相，磷酸氢二钾‑甲醇‑有机碱溶液为流动相，在检测波长为240nm下，记录HPLC谱图。采用本方法可排除苯甲醛、邻硝基苯甲醛、间硝基苯甲醛、对硝基苯甲酸对照品岀峰位置的杂峰干扰，专属性和分离度优于现有方法，且耐用性较好，能更好地实现质量控制，有利于药品安全性。
Description
技术领域
本发明涉及化学药品分析技术领域，具体涉及一种运用高效液相色谱法分离苯甲醛和硝基苯甲醛（包含邻、间、对三种异构体）的方法，尤其涉及检测化学药品盐酸乐卡地平中可能存在的杂质苯甲醛和硝基苯甲醛（包含邻、间、对三种异构体）的方法。
背景技术
苯甲醛和硝基苯甲醛（包含邻、间、对三种异构体）是化学药物合成过程中可能引入的潜在基因毒性杂质。
基因毒性杂质是指直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向的化合物。而潜在基因毒性的杂质是指从结构上看类似基因毒性杂质，有警示性，但未经实验证明。
欧盟发布的基因毒性结构警示指导《Development of structural alerts forthe in vivo micronucleus assay in rodents》提示苯甲醛类化合物均具有潜在基因毒性。因此，根据ICH M7的相关要求，苯甲醛和硝基苯甲醛需作为潜在基因毒性杂质控制。
抗高血压药物盐酸乐卡地平中可能存在苯甲醛和硝基苯甲醛的三种异构体杂质，需进行质量控制。
《中国药典》2015年版二部提到了一种检测苯甲醛和硝基苯甲醛的现有方法，该方法系用于氯霉素有关物质检测。该方法为高效液相色谱法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L庚烷磺酸钠缓冲溶液（取磷酸二氢钾6.8g，用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液溶解并稀释至1000ml，再加三乙胺5ml，混匀，用磷酸调节pH值至2.5）-甲醇（68：32）为流动相；检测波长为277nm。
发明人采用上述方法对苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛这四种化合物混合溶液进行了检测，进样混合定位溶液（浓度为7.5μg/ml，稀释剂为乙醇）20μl，记录HPLC图谱，结果详见附图1。采用该方法，苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛的峰完全重合，仅在拖尾处出现一肩峰。
另陆雍华等人发表的《用气相色谱法分析硝基苯甲醛》（化学世界，1992, 2，84-85）一文中提到使用气相色谱分析硝基苯甲醛的方法。我公司参考该文并对该方法进行了调整：以聚乙二醇（DB-WAX）或极性相近色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm）为色谱柱，以FID为检测器；初始温度80℃，保持5min；以每分钟20℃的速率升至200℃，保持10min。气化室温度：250℃，检测室温度：300℃。载气及流速：氮气：1.0ml/min，氢气：30ml/min，空气：400ml/min，记录GLC图谱，详见附图2。由图2可知，采用该方法虽然可以分离苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛混合溶液中的这四种杂质，但将该方法用于分离盐酸乐卡地平原料或制剂样品中的苯甲醛和硝基苯甲醛时，干扰较多，详见附图3。由此可见，该气相方法不能把2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛从盐酸乐卡地平样品中分离出来。
由此可见，现有的分析方法均不能较好地实现同时分离定量苯甲醛及硝基苯甲醛的三个同分异构体。
发明内容
为解决现有分析方法不能较好地同时分离定量苯甲醛及邻、间、对硝基苯甲醛的问题，本发明提供了一种新的苯甲醛和硝基苯甲醛的分离定量方法。
本发明采用一种高效液相色谱法分离苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体的方法，该方法包括：以C18与5-氟苯基混合键合硅胶为固定相，采用磷酸氢二钾-甲醇-有机碱溶液为流动相，将待测定的苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体混合物或含有苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体混合物的盐酸乐卡地平原料药或其制剂使用流动相配制成检测溶液，在检测波长为240nm下记录HPLC谱图。
其中，所述有机碱为三乙胺、二乙胺或乙二胺；优选为三乙胺。
所述流动相中磷酸氢二钾、甲醇、有机碱溶液的体积比为79-81：19-21：0.15-0.35；优选的三者的体积比为80：20：0.3。
所述有机碱溶液的体积百分比浓度为0.15%-0.35%；优选的有机碱溶液的体积百分比浓度为0.3%。
所述固定相的温度为38-42℃，优选的温度为40℃。
所述流动相用磷酸调节pH值至7.2-7.8，优选的pH值至7.5。
优选的，一种高效液相色谱法分离苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体的方法，所述方法包括：以C18与5-氟苯基混合键合硅胶为固定相；以0.05mol/L磷酸氢二钾（加三乙胺3ml，用磷酸调节pH值至7.2-7.6）-甲醇（80：20）为流动相；将待测定的苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体混合物使用流动相配制成检测溶液，检测波长为240nm；流速为每分钟1.0ml；固定相温度为40℃；记录HPLC谱图。
最优选的，一种高效液相色谱法分离苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体的方法，所述方法包括：以C18与5-氟苯基混合键合硅胶为固定相；以0.05mol/L磷酸氢二钾（加三乙胺3ml，用磷酸调节pH值至7.5）-甲醇（80：20）为流动相；将待测定的含有苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体杂质的盐酸乐卡地平原料药或其制剂用稀释液使用流动相配制成检测溶液，检测波长为240nm；流速为每分钟1.0ml；固定相温度为40℃；记录HPLC谱图。
除本发明所述C18与5-氟苯基混合键合硅胶色谱柱（固定相）外，发明人还研究过使用硅胶柱、手性柱和5-氟苯基柱等来进行分离定量苯甲醛和硝基苯甲醛。研究显示：使用硅胶柱（Welch Ultimate SiO2 4.6×250mm,5μm）时，苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛之间无法分离，且与溶剂峰无法分离；使用大赛璐手性柱（Chircalpak AD-H4.6×250mm）分离苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛混合溶液时，四者之间分离情况较好，但用于检测盐酸乐卡地平供试品溶液（0.1g/ml）时，在该色谱条件下主峰过载，且峰宽过宽，将苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛的出峰完全覆盖，因此该柱不能用于分离盐酸乐卡地平中的苯甲醛和硝基苯甲醛；使用5氟苯基柱（CAPCELL PAK PFP S5 4.6×250mm,5μm）时，2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛无法分离开；而使用本发明C18与5-氟苯基混合键合硅胶柱（ACE Excel 5U C18 -PFP，250*4.6mm，5μm）时，苯甲醛和硝基苯甲醛的杂质混合溶液和盐酸乐卡地平原料或制剂中所含的苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛均可较好分离定量。研究表明，采用本发明所用的色谱柱可同时分离定量苯甲醛及三个同分异构的硝基苯甲醛，且对盐酸乐卡地平原料或制剂的分析特别有益。
上述方法采用的流动相为0.05mol/L磷酸氢二钾（加三乙胺3ml，用磷酸调节pH值至7.5）-甲醇，比例为80：20。发明人探索过流动相A为甲醇+磷酸、高氯酸钠，流动相B为乙腈的组合，流动相A为磷酸二氢钾，流动相B为甲醇的情况，以及流动相A为不同浓度的磷酸氢二钾的情况，最终确定该流动相。
上述方法采用的检测波长为240nm。在该波长（盐酸乐卡地平的最大吸收波长）下，苯甲醛和邻、间、对硝基苯甲醛均有较强吸收。
采用本发明所述方法检测盐酸乐卡地平供试品时的各组分分离情况如下表所示（图谱见附图6）。
| 成分 | 浓度(μg/ml) | 保留时间（min） | 分离度 | 信噪比 |
| 苯甲醛 | 2.9990 | 32.913 | / | 179.0 |
| 2-硝基苯甲醛 | 3.1155 | 35.943 | 2.19 | 42.7 |
| 3-硝基苯甲醛 | 2.8964 | 38.270 | 1.53 | 163.6 |
| 4-硝基苯甲醛 | 3.0329 | 39.804 | 1.26 | 39.5 |
| 盐酸乐卡地平 | 39986.00 | 未出峰 | / | / |
本方法可以定量测定苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体，尤其适用于定量测定盐酸乐卡地平原料及其制剂中所含苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体杂质的含量。本发明能够完全分离盐酸乐卡地平中的苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体杂质，不受干扰，且峰型较好，完全有效控制盐酸乐卡地平原料及其制剂的质量。本发明的意义在于提供了一种能较好地同时分离定量苯甲醛和邻、间、对硝基苯甲醛的分析方法，采用本方法，经一次试验即可对这四种杂质分别定量。本方法专属性强，灵敏度高，准确度良好。
附图说明
附图1为按《中国药典》2015年版二部提到的现有方法检测苯甲醛和2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛混合溶液的图谱。
附图2为按气相色谱法分析苯甲醛与2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛混合溶液的图谱。
附图3为按气相色谱法分离盐酸乐卡地平中的苯甲醛和2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛的图谱。
附图4为采用本发明所述方法检测空白溶液的图谱。
附图5为采用本发明所述方法检测盐酸乐卡地平供试品溶液的图谱。
附图6为采用本发明所述方法检测加杂质的盐酸乐卡地平供试品溶液的图谱。
附图7为采用本发明所述方法检测盐酸乐卡地平片供试品溶液的图谱。
具体实施方式
本发明已在下述实施例中公开了一种运用高效液相色谱检测离盐酸乐卡地平中所含杂质苯甲醛和硝基苯甲醛的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种运用高效液相色谱检测盐酸乐卡地平所含杂质苯甲醛和硝基苯甲醛的方法进行详细说明。在具体实施方式中，所用各试剂、药品、试验环境等在未经特殊说明下，均来源相同和一致。
实施例1：盐酸乐卡地平原料药的HPLC检测。
仪器：Waters e2695-2489高效液相色谱仪
色谱柱：菲罗门ACE Excel 5 C18 -PFP (250*4.6mm, 5μm)
流动相：0.05mol/L磷酸氢二钾（加三乙胺3ml，磷酸调节pH至7.5）-甲醇(80:20)
稀释剂：流动相
检测波长：240nm
固定相温度：40℃
流速：1.0ml/min
进样量：20μl
工作站：Empower
取盐酸乐卡地平原料药1.0g加适量流动相溶解并稀释制成含盐酸乐卡地平40mg/ml作为供试品溶液，另取苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛对照品各适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释成每1mL中各含3μg的混合溶液，作为混合杂质对照品溶液。
分别取空白溶液（流动相）、盐酸乐卡地平供试品溶液、混合杂质对照品的盐酸乐卡地平供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见附图4、5、6。
由图5可见，采用本方法检测盐酸乐卡地平供试品溶液时不出峰；由图6可见，采用本方法检测加了苯甲醛及硝基苯甲醛混合杂质对照品的盐酸乐卡地平供试品溶液时，保留时间分别为32.913、35.943、38.270、39.804的苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛色谱峰，均能实现良好的分离。采用本方法检测盐酸乐卡地平中的苯甲醛和硝基苯甲醛杂质不受盐酸乐卡地平本身的干扰。
实施例2：在不同流速下用本方法检查盐酸乐卡地平中苯甲醛和硝基苯甲醛。
仪器与试剂同实施例1，除流速外的其他色谱条件同实施例1。本研究的流速为0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min。
取盐酸乐卡地平原料药2.0g，加苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛对照品母液，再加适量流动相溶解并稀释制成含盐酸乐卡地平40mg/ml、苯甲醛及邻间对硝基苯甲醛各3μg/ml的加杂质供试品溶液。另取苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛对照品各适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释成每1mL中各含3μg的混合溶液，作为混合杂质对照品溶液。
分别取空白溶液（流动相）、混合杂质对照品溶液、加杂质的盐酸乐卡地平供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
检测结果：按外标法计算，在流速0.9ml/min～1.1ml/min范围内，苯甲醛的含量RSD%值为2.3，邻硝基苯甲醛的含量RSD%值为0.8，间硝基苯甲醛的含量RSD%值为0.7，对硝基苯甲醛的含量RSD%值为0.7。
实施例3：在不同柱温下用本方法检查盐酸乐卡地平中苯甲醛和硝基苯甲醛。
仪器与试剂同实施例1，除柱温外的其他色谱条件同实施例1。本研究柱温为38℃、40℃和42℃。
溶液配制同实施例2。
分别取空白溶液（流动相）、混合杂质对照品溶液、加杂质的盐酸乐卡地平供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
检测结果：按外标法计算，在柱温38℃～42℃范围内，苯甲醛的含量RSD%值为4，邻硝基苯甲醛的含量RSD%值为1.4，间硝基苯甲醛的含量RSD%值为0.7，对硝基苯甲醛的含量RSD%值为1.6。
实施例4：在不同流动相比例下用本方法检查盐酸乐卡地平中苯甲醛和硝基苯甲醛。
仪器与试剂同实施例1，除流动相比例外的其他色谱条件同实施例1。本研究流动相比例为78:22、80:20和82:18。3.1 溶液配制。
溶液配制同实施例2。
分别取空白溶液（流动相）、混合杂质对照品溶液、加杂质的盐酸乐卡地平供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
检测结果：按外标法计算，在流动相比例78:22～82:18范围内，苯甲醛的含量RSD%值为7，邻硝基苯甲醛的含量RSD%值为4，间硝基苯甲醛的含量RSD%值为1.1，对硝基苯甲醛的含量RSD%值为4。
实施例5：在不同pH条件下用本方法检查盐酸乐卡地平中苯甲醛和硝基苯甲醛。
仪器与试剂同实施例1，除流动相pH外的其他色谱条件同实施例1。本研究流动相pH为7.4、7.5和7.6。
溶液配制同实施例2。
分别取空白溶液（流动相）、混合杂质对照品溶液、加杂质的盐酸乐卡地平供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
检测结果：按外标法计算，在流动相pH7.4～7.6范围内，苯甲醛的含量RSD%值为5，邻硝基苯甲醛的含量RSD%值为2.2，间硝基苯甲醛的含量RSD%值为1.1，对硝基苯甲醛的含量RSD%值为4。
实施例6：盐酸乐卡地平制剂的HPLC检测。
仪器与试剂同实施例1。
取盐酸乐卡地平片细粉适量（相当于盐酸乐卡地平原料药1.0g）加甲醇50ml超声10min溶解，过滤，滤液蒸干，残渣加流动相溶解并稀释至25ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和4-硝基苯甲醛对照品各适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释成每1mL中各含3μg的混合溶液，作为混合杂质对照品溶液。
分别取空白溶液（流动相）、混合杂质对照品溶液、盐酸乐卡地平片供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见附图7。
由图7可见，采用本方法检测盐酸乐卡地平片供试品溶液时在苯甲醛和硝基苯甲醛峰相对应的保留时间附近未出峰，因此，采用本方法检测盐酸乐卡地平片中的苯甲醛和硝基苯甲醛杂质不受盐酸乐卡地平及其制剂中辅料的干扰。
Claims (8)
1.一种运用高效液相色谱法分离苯甲醛和硝基苯甲醛邻、间、对三种异构体的方法，其特征在于，所述方法包括：以C18与5-氟苯基混合键合硅胶为固定相，采用磷酸氢二钾-甲醇-有机碱溶液为流动相，将待测定的苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体混合物使用流动相配制成检测溶液，在检测波长为240nm下记录HPLC谱图；所述流动相中磷酸氢二钾、甲醇、有机碱的体积比为79-81：19-21：0.15-0.35；所述流动相用磷酸调节pH值至7.2～7.8；所述固定相的温度为38～42℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机碱溶液的体积百分比浓度为0.15％-0.35％，有机碱为三乙胺、二乙胺或乙二胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机碱溶液的体积百分比浓度为0.3％，所述有机碱为三乙胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相中磷酸氢二钾、甲醇、有机碱的体积比为80：20：0.3。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相用磷酸调节pH值至7.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相的温度为40℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以C18与5-氟苯基混合键合硅胶为固定相；以0.05mol/L磷酸氢二钾与甲醇的体积比为80：20的混合液为流动相；其中，0.05mol/L磷酸氢二钾加三乙胺3ml并用磷酸调节pH值至7.2-7.6；将待测定的苯甲醛和邻、间、对三种硝基苯甲醛异构体混合物使用流动相配制成检测溶液，检测波长为240nm，流速为每分钟1.0ml，固定相温度为40℃；记录HPLC谱图。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以C18与5-氟苯基混合键合硅胶为固定相；以0.05mol/L磷酸氢二钾与甲醇的体积比为80：20的混合液为流动相；其中，0.05mol/L磷酸氢二钾加三乙胺3ml并用磷酸调节pH值至7.5；将待测定的含有苯甲醛和硝基苯甲醛邻、间、对三种异构体杂质的盐酸乐卡地平原料药或其制剂使用流动相配制成检测溶液，检测波长为240nm，流速为每分钟1.0ml，固定相温度为40℃；记录HPLC谱图。
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