CN108828089A - 衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了衍生化HPLC‑UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4‑硝基苯甲醛的方法，包括使用硝基苯肼类衍生化试剂对4‑硝基苯甲醛衍生化生成在紫外可见光区有较强吸收的产物，以反应液作为进样样品，利用HPLC‑UV/Vis法基于反相分配色谱法原理在紫外可见光区测定其中4‑硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4‑硝基苯甲醛的定性或定量检测。本发明基于硝基苯肼类衍生化试剂的4‑硝基苯甲醛衍生化产物由于腙键在硝基对位的生成，紫外吸收带出现明显的红移效应，从而建立了一种简单、通用的柱前衍生化HPLC‑UV/Vis测定4‑硝基苯甲醛的方法。方法学验证的结果显示本发明方法专属性良好。

Description

衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛 的方法
技术领域
本发明属于药品分析检测领域，涉及一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，尤其涉及一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法。
背景技术
基因毒性杂质(Genotoxic impurities,GTIs)是一类特殊的药物杂质，由于其具有潜在的人类致癌作用而越来越受到制药行业和药品监管机构的关注[1-5]。药物中基因毒性杂质的毒理学关注阈值(Threshold of toxicological concern,TTC)取决于药物的日服用剂量和暴露期[6-8]。人用药品注册技术要求国际协调会议(International Conferenceon Harmonization,ICH)M7(step 2)提出分阶段TTC如下：服药持续时间少于1个月的为120μg/天，持续时间为1至12个月的为20μg/天，持续时间为1至10年的为10μg/天，持续时间超过10年的为1.5μg/天[9]。由于对检测基因毒性杂质的方法有简单和高灵敏度的要求，在ppm水平测定复杂药物样品中的这些杂质面临着相当大的挑战[10]。
氯霉素(Chloroamphenicol)是一种广谱抗生素，其各种制剂是常规临床应用的重要药物。4-硝基苯甲醛是氯霉素的主要合成原料和光降解产物[11]。值得注意的是，已有文献报道了在细菌回复突变试验(Ames试验)和枯草杆菌重组修复试验(rec试验)中4-硝基苯甲醛的致突变性[12]，阳性的实验结果表明该化合物能够引起DNA损伤。该作者提出，对位硝基取代的芳香族化合物对DNA的反应活性更高且空间位阻更小，故4-硝基苯甲醛是致突变性最强的硝基芳香醛异构体。同时，根据啮齿类动物体内微核试验的结构“警报”的综述，芳香醛基和芳香硝基都是具有人类遗传毒性潜力的结构“警报”[13]。因此，我们应将药物中的4-硝基苯甲醛作为基因毒性杂质加以控制。氯霉素的最大日服用剂量约为3g[14]，而它通常是短期用药的药物，所以TTC为120μg/天[9]。药物的TTC值(120μg/天)除以最大日服用剂量(3g/天)，得出氯霉素药物中4-硝基苯甲醛的含量不应超过40ppm[6]。因此，我们需要一种灵敏且快速的方法测定氯霉素及制剂中的4-硝基苯甲醛。
各国药典应用了高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)和薄层色谱法对氯霉素中的4-硝基苯甲醛进行控制[15-17]。然而，这些方法缺乏足够的特异性以避免其他相关物质的干扰，且灵敏度不足以将该杂质作为基因毒性杂质来控制。据发明人所知，目前没有文献报道测定药物中痕量4-硝基苯甲醛的方法。Manju等人[18]开发了一种衍生化HPLC-UV方法，结合盐辅助液-液微萃取技术提取和浓缩衍生化产物，用于测定注射剂中的苯甲醛。还有文献报道了结合HPLC-UV的顶空液滴内衍生化方法，采用了微萃取技术将分析物预浓缩了200倍[19]。尽管这两种方法灵敏度较好，但是浓缩衍生物的复杂性和对分析物挥发性的要求都是方法应用的障碍，故不适用于检测氯霉素或其制剂中残留的4-硝基苯甲醛。用于检测药物中苯甲醛的直接的气相色谱法(GC)[20]和HPLC-UV法[21]也已被报道，但均在专属性或灵敏度方面存在不足。此外，有报道采用2-硝基苯肼(2-NPH)[22]用于人血浆样品中杂环醛的定量分析，检测波长仅为330nm，同时需要采用用固相微萃取(SPE)对样品进行了浓缩富集。也有报道采用3-硝基苯肼(3-NPH)[23]用于人血浆样品中脂肪醛的定量分析，采用质谱检测器进行测定，但是并不适用于实验室常规检测。此外，关于硝基苯肼类试剂用于衍生醛类化合物的系统比较还未有报道。
在各种分离分析方法中，HPLC-UV/Vis法因其简单实用而成为了大多数实验室的首选方法，但由于大多数药物及其相关物质有较强的紫外吸收，因此专属性不足是该法的主要缺陷。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，通过比较2-硝基苯肼(2-NPH)，3-硝基苯肼(3-NPH)、4-硝基苯肼(4-NPH)和2，4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)这几种硝基苯肼类衍生化试剂，发现此类衍生化试剂与4-硝基苯甲醛衍生化反应后生成的产物在UV/Vis光区的吸收发生了红移，可使药物和衍生化试剂本身的干扰最小化，因此提供了一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法。
本发明的另一目的是提供衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，包含以下步骤：
步骤(1)、使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化生成在紫外可见光区(350～450nm)有较强吸收的产物；
步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理，在紫外可见光区(350～450nm)测定步骤(1)中衍生化反应产物中4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。
优选的，所述的衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，包含以下步骤：
步骤(1)、在20～80℃条件下，以乙腈-水为反应体系，使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化反应生成在紫外可见光区(390～440nm)有较强吸收的产物；
步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理在紫外可见光区(390～440nm)测定步骤(1)中衍生化反应产物中4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。
所述的硝基苯肼类衍生化试剂选自2-硝基苯肼盐酸盐、3-硝基苯肼盐酸盐、4-硝基苯肼盐酸盐和2,4-二硝基苯肼盐酸盐中的任意一种，优选为3-硝基苯肼盐酸盐。
所述的衍生化反应的条件：以乙腈-水＝10:90～90:10(V:V)为反应体系，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为0.5～2mg/mL，反应温度为60～80℃，反应时间为30～60min。
优选的，所述的衍生化反应的条件：以乙腈-水＝70:30(V:V)为反应体系，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为500μg/mL，反应温度为60℃，反应时间为30min。
衍生化试剂相对于4-硝基苯甲醛是过量的，反应体系中3-硝基苯肼盐酸盐和4-硝基苯甲醛的质量比为100～2000:1，优选为500:1。
优选的，所述的HPLC-UV/Vis法：采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于350～450nm之间，优选位于390～440nm之间，进一步优选位于390～400nm之间。
进一步优选的，所述的HPLC-UV/Vis法使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪，该色谱仪配置有在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的迪马Diamonsil C18色谱柱；进样量：20μL；流动相流速：1.0mL/min；等度洗脱：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸，A:B＝75:25(V:V)，色谱运行时间为10min；柱温：30℃；检测波长：397nm。
本发明所述的方法可用于多种样品中4-硝基苯甲醛的定性与定量检测，优选在测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛中的应用。
一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法，包含以下步骤：
步骤(1)、以乙腈-水为反应体系，使用硝基苯肼类衍生化试剂对待测药物进行衍生化反应，反应液作为样品进样测定；
步骤(2)、以步骤(1)中衍生化反应后的反应液作为进样样品，利用HPLC-UV/Vis法在350～450nm测定其中4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对药物中4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。
所述的硝基苯肼类衍生化试剂选自2-硝基苯肼盐酸盐、3-硝基苯肼盐酸盐、4-硝基苯肼盐酸盐和2,4-二硝基苯肼盐酸盐中的任意一种，优选为3-硝基苯肼盐酸盐。
所述的衍生化反应的条件：以乙腈-水＝10:90～90:10(V:V)为反应体系，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为0.5～2mg/mL，反应温度为60～80℃，反应时间为30～60min。
优选的，所述的衍生化反应的条件：以乙腈-水＝70:30(V:V)为反应体系，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为500μg/mL，反应温度为60℃，反应时间为30min。
优选的，所述的HPLC-UV/Vis法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于350～450nm之间，优选位于390～440nm之间，进一步优选位于390～400nm之间。
更进一步优选的，所述的HPLC-UV/Vis法使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪，该色谱仪配置有在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的迪马Diamonsil C18；进样量：20μL；流动相流速：1.0mL/min；等度洗脱：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸，A:B＝75:25(V:V)，色谱运行时间为10min；柱温：30℃；检测波长：397nm。
所述的药物优选为氯霉素和氯霉素滴眼液，但不局限于上述化合物。待测药物不需要进行预处理，精密称量后用反应体系溶解稀释后，加入硝基苯肼类衍生化试剂完成衍生反应后进样。药物中4-硝基苯甲醛为痕量，反应体系中硝基苯肼类衍生化试剂过量。
本发明的有益效果：
氯霉素及其含有的多种杂质(包括4-硝基苯甲醛)在近可见光区紫外吸收很弱，本发明基于硝基苯肼类衍生化试剂的4-硝基苯甲醛衍生化产物由于在苯环硝基对位给电子基团腙键的生成，紫外吸收带出现明显的红移效应，建立了一种简单、通用的柱前衍生化HPLC-UV/Vis测定4-硝基苯甲醛的方法。方法学验证的结果显示，药物和衍生试剂中的其他杂质均不会对分析造成干扰，表明该方法专属性良好。此外，方法的检测限为0.009μg/mL，定量限为0.03μg/mL，线性关系良好(r>0.999)；精密度项下重复性和重现性的RSD的值分别为1.37％和0.99％；平均回收率在97.8-112.1％之间(RSD<2.67％)，无明显的基质干扰，且衍生化产物在8h内稳定性良好。
附图说明
图1为分别以2-硝基苯肼盐酸盐(A)、3-硝基苯肼盐酸盐(B)、4-硝基苯肼盐酸盐(C)、2，4-二硝基苯肼盐酸盐(D)作为衍生试剂与4-硝基苯甲醛反应生成产物的紫外吸收光谱图。衍生化试剂的浓度均为500μg/mL，4-硝基苯甲醛的浓度均为1μg/mL。
图2为用3-硝基苯肼盐酸盐(500μg/mL)对氯霉素(1mg/mL)中残留的4-硝基苯甲醛进行衍生化时得到的色谱图(a-e代表不同检测波长)：a.224nm，b.265nm，c.320nm，d.354nm，e.397nm。
图3为反应条件对4-硝基苯甲醛衍生化的影响：(A)3-硝基苯肼盐酸盐浓度对衍生化效率的影响；(B)反应温度对衍生化效率的影响；(C)反应时间对衍生化效率的影响；(D)体系中有机相比例对衍生化效率的影响。待测的4-硝基苯甲醛的浓度均为1μg/mL。
具体实施方式
1.1.仪器
Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；METTLER TOLEDO AB135-S分析天平(梅特勒瑞典公司)；Sartorius TE124S分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。
1.2.试剂
4-硝基苯甲醛(≥97％)、2-硝基苯肼盐酸盐(97％)、3-硝基苯肼盐酸盐(97％)、4-硝基苯肼盐酸盐(98％)、2,4-二硝基苯肼盐酸盐(98％)、氯霉素(98％)和氯霉素滴眼液(8mL：20mg)。
纯化水，乙腈(TEDIA，色谱纯)、磷酸(分析纯)、N，N-二甲基乙酰胺(分析纯)。
1.3.溶液的制备
4-硝基苯甲醛储备液：取4-硝基苯甲醛约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用乙腈体积浓度为70％的乙腈-水稀释至刻度线，摇匀即可。
2-硝基苯肼盐酸盐、3-硝基苯肼盐酸盐、4-硝基苯肼盐酸盐和2，4-二硝基苯肼盐酸盐试液(以下简称2-NPH·HCl，3-NPH·HCl，4-NPH·HCl和2,4-DNPH·HCl)：分别取各试剂约100mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用80％乙腈稀释至刻度，摇匀即可。需新鲜配制。其中，2,4-二硝基苯肼盐酸盐先用适量的N,N-二甲基乙酰胺溶解。
1.4.衍生化实验条件
精密称定适量药品，或精密移取一定体积的4-硝基苯甲醛储备液，置于10mL量瓶中，加入500μL衍生化试剂，用70％乙腈稀释至刻度，摇匀。60℃下反应30min，摇匀，过滤后取20μL直接进样。
1.5.HPLC-UV条件
Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；色谱柱：250mm×4.6mm,5μm的迪马DiamonsilC18；进样量：20μL；流动相流速：1.0mL/min；等度洗脱：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸，A:B＝75:25(V:V)，色谱运行时间为10min；柱温：30℃；检测波长：397nm。
实施例1
以4-硝基苯甲醛为待测物，用相同浓度的4种硝基苯肼类衍生化试剂对其进行衍生化。衍生化实验条件见1.4。在相同的色谱条件下，用DAD扫描各衍生化产物，记录产物的光谱图和色谱图，以产物的最大吸收波长和吸收强度来评价衍生化试剂的优劣。
图1显示，除3-硝基苯肼外，其他三种衍生化试剂的最大吸收波长均在350nm以上，分别为426nm(2-硝基苯肼)、384nm(4-硝基苯肼)和356nm(2，4-二硝基苯肼)，这可以归因于在苯肼的苯环上的邻位和/或对位上的硝基的吸电子能力。而3-硝基苯肼的最大吸收波长仅为225nm，4-硝基苯甲醛的最大吸收波长为265nm。本实验的理想情况是在近可见光区处进行检测，从而最小化基质和衍生化试剂的干扰，简化色谱分离条件，提高方法专属性。
4种衍生化试剂与4-硝基苯甲醛生成的产物紫外吸收带均呈现一定的红移效应，最大吸收波长分别为435nm(2-硝基苯肼)、397nm(3-硝基苯肼)、425nm(4-硝基苯肼)和397nm(2,4-二硝基苯肼)，这可归因于衍生化生成的腙键与醛基相比给电子能力更强。由图1B可知，3-硝基苯肼产物的红移效应最为显著，可从紫外光区红移至近可见光区，与在紫外光区检测相比，可以最小化背景干扰，因此，3-硝基苯肼衍生物在色谱图中可以提供一条更为平滑的基线，提高了方法的专属性。另一方面，3-硝基苯肼产物的吸收峰强度高，为方法提供了高灵敏度。故而，选择3-硝基苯肼进行后续研究。
在实际测样中，由于大量药物基底的存在，对微量的4-硝基苯甲醛而言影响较大，若推广使用则每个药物都需要建立一个色谱条件去分离药物和杂质，干扰多，灵敏度低(基线噪音大)。而使用3-硝基苯肼作为衍生化试剂时，由于大多数药物及其杂质在近可见光区(>380nm)紫外吸收很弱，所以在此波长处进行测定可以大大提高方法的专属性，简化色谱分离条件。当用3-硝基苯肼对氯霉素中的4-硝基苯甲醛进行衍生化，并采用DAD记录不同检测波长下的色谱图时(图2)发现，相比于其他较短波长，397nm波长检测下的色谱图(图2e)能够提供更为平滑的基线和较少的杂质吸收峰，有利于减少背景干扰，提高方法的专属性和灵敏度。
实施例2
为了确保衍生化反应快速进行且反应完全，需对体系中的衍生化试剂的用量、反应时间、反应温度和有机相的比例进行考察。以生成的4-硝基苯甲醛衍生化产物的峰面积为指标，单因素试验考察了不同浓度的3-硝基苯肼盐酸盐(0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL)、不同的反应温度(20、30、50、60、70、80℃)、不同的反应时间(10、20、30、45、60、120min)和反应体系的有机相比例(10％、30％、50％、70％、90％)对衍生化反应效率的影响。
由图3A可知，衍生化产物的峰面积随着衍生化试剂浓度的增加而增大，直到3-硝基苯肼盐酸盐浓度为500μg/mL(相当于浓度比为500:1)时达到最大值，继续增加3-硝基苯肼盐酸盐，衍生化产物的峰面积无显著增加，而且500μg/mL的3-硝基苯肼盐酸盐可以提供一条更为平滑的色谱基线和更少的杂峰(图2e)，所以选择500μg/mL 3-硝基苯肼盐酸盐作为衍生化试剂进行后续研究。由图3B可知，衍生化产物的峰面积随反应温度增高而增大，60℃时达到最大值，继续提高温度对衍生化效率无显著影响，故选择60℃作为反应条件。由图3C可知，30min的反应时间就足以使衍生化反应完全。由图3D可知，反应体系有机相比例这一因素对反应效率不存在显著性影响，说明较为广泛的有机相比例(10-90％)是可以接受的，考虑到药物在70％乙腈-水中溶解度良好，最终优选70％乙腈-水为反应体系。
因此，最优衍生化反应条件为：以70％乙腈-水为反应体系，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为500μg/mL，60℃下反应30min。
实施例3方法学验证与应用
3.1.专属性
氯霉素样品溶液：取氯霉素约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加入500μL3-硝基苯肼盐酸盐试液，用70％乙腈稀释至刻度，摇匀；60℃下反应30min，摇匀即得氯霉素样品溶液，过滤后取20μL按1.5项下方法直接进样。
空白溶液：精密移取500μL3-硝基苯肼盐酸盐试液，置于10mL量瓶中，用70％乙腈稀释至刻度，摇匀；60℃下放置30min，摇匀即得空白溶液，过滤后取20μL按1.5项下方法直接进样。
专属性试验主要考察了空白溶液(采用相同衍生化条件，但缺少4-硝基苯甲醛)和氯霉素样品溶液(包含有残留的4-硝基苯甲醛)。氯霉素样品溶液结果如图2e所示，氯霉素及衍生化试剂中的其他杂质在待测物的峰处均没有干扰；空白溶液的色谱图中也未出现干扰4-硝基苯甲醛检测的其他杂质峰，说明该方法的专属性良好。
3.2.线性与范围
对照品溶液制备：精密移取一定体积的4-硝基苯甲醛储备液，置于10mL量瓶中，加入500μL衍生化试剂，加70％乙腈稀释至刻度，摇匀；60℃下反应30min，摇匀即得对照品溶液。
色谱条件：Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；色谱柱：250mm×4.6mm,5μm的迪马Diamonsil C18；进样量：20μL；流动相流速：1.0mL/min；等度洗脱：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸，A:B＝75:25(v/v)，色谱运行时间为10min；柱温：30℃；检测波长：397nm。
标曲绘制方法：按照对照品溶液制备方法，精密移取4-硝基苯甲醛储备液置于10mL量瓶中，加入500μL衍生化试剂，加70％乙腈稀释至刻度，摇匀，制成含4-硝基苯甲醛浓度分别为30、60、120、180、20、300ng/mL的系列浓度溶液；上述溶液60℃下反应30min后过滤，分别取20μL注入液相色谱仪，测定衍生化产物的峰面积。以4-硝基苯甲醛浓度C(μg/mL)为横坐标，衍生化产物峰面积(A)为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归分析，计算线性回归方程及相关系数。结果见表1，显示，4-硝基苯甲醛线性范围为0.03～0.3μg/mL，且线性关系良好(r>0.999)。
定量方法：采用外标法进行定量。
3.3.检测限与定量限
以信噪比3:1为方法的检测限，以信噪比10:1为方法的定量限。结果见表1，显示，4-硝基苯甲醛的检测限为0.009μg/mL，定量限为0.03μg/mL。
3.4.精密度试验(重复性和重现性)
精密称取氯霉素约10mg，置于10mL量瓶中，用70％乙腈溶解后，加入适量4-硝基苯甲醛储备液(加入的4-硝基苯甲醛的终浓度为0.15μg/mL)，按照1.4.项下方法加入衍生化试剂进行衍生化，重复性在同一天内重复进样6次，重现性更换不同的实验室重复进样6次，以衍生化生成物峰面积计算RSD值。由表1可知，此方法的重复性和重现性良好，RSD分别为1.37％和0.99％。
3.5.衍生物稳定性
加标样品溶液：精密称取氯霉素约10mg，置于10mL量瓶中，用70％乙腈溶解后，加入适量4-硝基苯甲醛储备液(加入的4-硝基苯甲醛的终浓度为0.15μg/mL)，按照1.4.项下方法加入衍生化试剂进行衍生化，取出后摇匀即得。
按3.2.项下方法配制加入4-硝基苯甲醛浓度0.15μg/mL的对照品溶液。上述对照品溶液和加标样品溶液均分别于室温下放置0，1，2，3，5，8h时进行测定，以待测物峰面积的变化考察衍生物的稳定性。由表1可知，衍生化产物室温放置时，在0～8h内峰面积的RSD小于1.52％，即在对照品溶液和加标样品溶液中稳定性均良好。
3.6.加样回收率
为了评价该方法的准确性，发明人计算4-硝基苯甲醛在氯霉素(1mg/mL)中的加样回收率。
回收率对照品溶液：按3.2.项下方法配制低、中、高三个浓度(含4-硝基苯甲醛浓度分别为0.03、0.15、0.30μg/mL)的对照品溶液，不加药物本底，衍生化反应结束的反应液过滤后取20μL进样。每个浓度水平3份。
回收率样品溶液：取氯霉素约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用70％乙腈溶解后，再精密移取4-硝基苯甲醛储备液适量，70％乙腈稀释至刻度，配制成加入的4-硝基苯甲醛在反应体系中的终浓度为0.03、0.15、0.30μg/mL的加标样品溶液，按1.4.项下方法进行衍生化，过滤后取20μL进样。每个浓度水平3份。
加样回收率＝(样品峰面积—本底峰面积)/对照品峰面积×100％。
并计算各个浓度水平加样回收率的平均值和RSD。由表1可知，4-硝基苯甲醛的加样回收率在97.8～112.1％之间，且RSD均小于2.67％。
表1方法学试验结果
注：回归方程中x-待测物的浓度(μg/mL)，y-峰面积，r–回归方程的相关系数
实施例4
根据药物的最大服用剂量以及TTC值，制备含有一定浓度药物的供试品溶液(氯霉素：1mg/mL；氯霉素滴眼液：200μg/mL)，浓度以氯霉素计。
供试品溶液制备：精密称定适量药品，置于10mL量瓶中，加入500μL衍生化试剂，用70％乙腈稀释至刻度，摇匀。60℃下反应30min，摇匀即得供试品溶液，过滤后取20μL按1.5项下方法直接进样。
记录衍生化产物的峰面积，以外标法计算待测物在药物中的含量(μg/g)。结果表明，氯霉素原料药和氯霉素滴眼液中4-硝基苯甲醛含量分别达到103.1和201.2μg/g，均超过标准限度。
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Claims (10)

1.衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，其特征在于包含以下步骤：
步骤(1)、使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化生成在紫外可见光区350～450nm有较强吸收的产物；
步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理，在紫外可见光区350～450nm测定步骤(1)中获得的4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包含以下步骤：
步骤(1)、以乙腈-水为反应体系，使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化反应生成在紫外可见光区390～440nm有较强吸收的产物；
步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理在紫外可见光区390～440nm测定步骤(1)中获得的4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的硝基苯肼类衍生化试剂选自2-硝基苯肼盐酸盐、3-硝基苯肼盐酸盐、4-硝基苯肼盐酸盐和2，4-二硝基苯肼盐酸盐中的任意一种，优选为3-硝基苯肼盐酸盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于反应体系中乙腈的体积浓度为10％～90％，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为0.5～2mg/mL，反应温度为60～80℃，反应时间为30～60min；优选为反应体系中乙腈的体积浓度为70％，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为500μg/mL，衍生化反应温度为60℃，衍生化反应时间为30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的HPLC-UV/Vis法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于350～450nm之间，优选位于390～440nm之间，进一步优选位于390～400nm之间。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法在测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛中的应用。
7.衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法，其特征在于包含以下步骤：
步骤(1)、以乙腈-水为反应体系，使用硝基苯肼类衍生化试剂对待测药物进行衍生化反应，反应液作为样品进样测定；
步骤(2)、以步骤(1)中衍生化反应后的反应液作为进样样品，利用HPLC-UV/Vis法在350～450nm测定其中4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对药物中4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的硝基苯肼类衍生化试剂选自2-硝基苯肼盐酸盐、3-硝基苯肼盐酸盐、4-硝基苯肼盐酸盐和2，4-二硝基苯肼盐酸盐中的任意一种，优选为3-硝基苯肼盐酸盐。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于反应体系中乙腈的体积浓度为10％～90％，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为0.5～2mg/mL，反应温度为60～80℃，反应时间为30～60min；优选为反应体系中乙腈的体积浓度为70％，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为500μg/mL，反应温度为60℃，反应时间为30min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的HPLC-UV/Vis法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于350～450nm之间，优选位于390～440nm之间，进一步优选位于390～400nm之间；所述的HPLC-UV/Vis法优选使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪，该色谱仪配置有在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的迪马Diamonsil C18色谱柱；进样量：20μL；流动相流速：1.0mL/min；等度洗脱：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸，A:B＝75:25(V:V)，色谱运行时间为10min；柱温：30℃；检测波长：397nm。
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