CN110850012B - 一种1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法 - Google Patents

一种1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种1‑(2,3‑二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法，所述液相色谱检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为乙腈‑磷酸氢二钠缓冲溶液，流动相B为乙腈‑磷酸，检测波长为254nm，采用梯度方式洗脱。该方法具有快速、高效、稳定、准确等有效，能够快速、有效地检测出1‑(2,3‑二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质。

Description

一种1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及检测方法，具体涉及一种1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的高效液相色谱检测方法。
背景技术
1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐，又名1-(2,3-二氯苯基)-哌嗪单盐酸盐、2,3-二氯苯基哌嗪单盐酸盐为一种常用的医药中间体，其结构式如下：
Figure BDA0001772041170000011
分子式：C10H13Cl3N2，分子量：267.58。
1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐是苯基哌嗪类抗抑郁药物的中间体，尤其是合成调节神经类药物阿立哌唑的关键起始物料。根据文献报告：目前1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐主要采用2,3-二氯苯胺作为1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐合成的关键起始物料，通过二步合成法进行合成【赵文环等，1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐合成工艺改进，精细化工中间体，2017年4月第47卷第2期】。因此在1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐合成过程中容易产生1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐、2,3-二氯苯胺。由于上述杂质与1-(2,3-二氯苯基)哌嗪的官能团和结构都比较相似，在制备1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐的后处理工序中，都不能得到完全的去除，同时这几种杂质在制备阿立哌唑的过程中也与123哌嗪能发生相同的反应，生成与阿立哌唑结构相似、性质相近的4种杂质，其结构式分别如下：
Figure BDA0001772041170000012
且在阿立哌唑的后处理和精制工艺中都很难被去除，使得阿立哌唑中的有关物质增加，大大影响阿立哌唑的纯度。
为了减少副反应的发生，提高阿立哌唑收率和纯度，避免后续繁复的分离纯化过程，有必要对1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐原料进行质量控制，然而现有技术并没有公开针对 1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质的检测方法。本发明通过考察现有技术，于慧等 RP-HPLC法测定阿立哌唑片剂中的阿立哌唑及有关物质【东南大学学报(医学版)2005年3 月，24(2)】、查建蓬等HPLC分离阿立哌唑有关物质的方法学研究【中国药学杂志2005年 1月第40卷第2期】、张誉妮等阿立哌唑口腔膜剂的制备与质量评价【中国医药工业杂志2015，46(3)】等所公开的阿立哌唑有关物质检测方法用于检测1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质发现，现有的阿立哌唑有关物质检测方法无法有效检测出1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质。
因此，为了更加准确控制1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐产品质量，确保以其起始原料或中间体制备的最终药物阿立哌唑的质量，有必要研究一种能简单、快速、准确分离检测出 1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质方法。
发明内容
为了解决上述技术问题本发明目的在于提供一种操作简单有效、分离度好、灵敏度高、准确度高的1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法，其包括以下步骤：取含有1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐的乙腈溶液作为供试品溶液，按照高效液相色谱条件进行检测，其中所述高效液相色谱测定条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为乙腈-磷酸氢二钠缓冲溶液，流动相B为乙腈-磷酸，检测波长为254nm，采用梯度方式洗脱。
本发明所提供的1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质的检测方法，其中所述梯 度洗脱程序为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
本发明所述流动相A的磷酸氢二钠缓冲溶液浓度为0.01-0.03mol/L，更优选0.02-0.03mol/L，最优选为0.02mol/L。
本发明所述流动相B的磷酸浓度为0.05-0.3mol/L，优选为0.2-0.3mol/L，最优选为 0.2mol/L。
本发明所述流动相A中的磷酸氢二钠缓冲溶液与乙腈体积比为94-96:6-4，优选95:5，所述流动相B中的乙腈与磷酸体积比为94-96:6-4，优选为95:5。
本发明所提供的1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法，其中所述液相色谱检测条件中，柱温为25-35℃，更优选为30℃；流速优选为0.8-1.2ml/min，更优选为1.0ml/min。
本发明所使用的色谱柱为常规的以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，如YMCC18 色谱柱150mm×4.6mm,5μm、250mm×4.6mm,5μm、150mm×4.6mm,5μm，岛津C18色谱柱150mm×4.6mm,5μm、250mm×4.6mm,5μm、150mm×4.6mm,3μm，WatersC18色谱柱150mm ×4.6mm,5μm、250mm×4.6mm,5μm、150mm×4.6mm,3μm等，以规格为150×4.6mm，3μm 效果更优。
本发明通过考察二级管阵列检测器(DAD检测器检测)检测1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质时，发现1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质均有紫外吸收，结合吸收曲线，背景干扰以及出峰结果稳定性进行考察，检测波长为254nm时，背景干扰及其他杂峰干扰小，且出峰结果更加稳定，检测效果最佳。
本发明通过考察不同进样体积对1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质检测效果的影响，包括5ul、10ul、15ul、20ul、25ul等不同进样体积，结果显示当进样体积为10-20ul 时均能达到较好的分离效果，其中进样体积为20ul的分离效果最佳。
本发明考察了柱温对1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质检测效果的影响，包括20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等不同温度，结果显示25-35℃均能达到较好的分离效果， 30℃的分离效果最佳。
本发明考察流速对1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质检测效果的影响，包括 0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min等不同流速，结果显示，1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质均能达到较好的分离效果，其中流速为1.0ml/min的分离效果最佳。
本发明所述的检测方法，可以通过以下方法实现：
1)供试品溶液制备：取1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐样品，加乙腈定容制成0.4mg/ml 样品溶液，即得；
2)含量检测：取对照品和供试品溶液各20μl注入液相色谱柱，进行检测，其中色谱 条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱规格为150×4.6mm，3μm；流动相 A 为0.02mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液-乙腈，其中磷酸氢二钠缓冲溶液与乙腈的体积比为95: 5；流动相B为乙腈-0.2mol/L磷酸，其中乙腈与磷酸的体积比为95:5；检测波长为254nm；柱 温为30℃；流速为1.0ml/min；梯度洗脱条件如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
本发明所提供的1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质检测方法，与现有技术相比具有以下显著优势：
1、检测时间合理，目标物质出峰时间短，大大提高了样品的检测效率；
2、分离度好，基线波动不大，背景干扰小，能够准确分离1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质；
3、通过对该测定方法的检测限、定量限、专属性、重复性等发明考察，结果显示该检测方法灵敏度高，专属性强，重复性好，能够适合于1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质检测，为控制以其起始原料或中间体制备的最终药物如阿立哌唑的质量提供有力保障。
附图说明
图1对比例1供试品的高效液相色谱图；
图2对比例2供试品的高效液相色谱图；
图3对比例3供试品的高效液相色谱图；
图4对比例4供试品的高效液相色谱图；
图5对比例5供试品的高效液相色谱图；
图6实施例1供试品的高效液相色谱图；
图7实施例2供试品的高效液相色谱图；
图8实施例3供试品的高效液相色谱图；
图9实施例4供试品的高效液相色谱图；
图10实施例5供试品的高效液相色谱图。
图示：
1为1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，2为1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，3为1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸，4为1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐，5为2,3-二氯苯胺。
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，该说明并不能用于限制本发明的保护范围。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，高效液相色谱仪：戴安U3000， Agilent1200
乙腈色谱级，美国Fisher公司；
磷酸为HPLC级，成都市科龙化学试剂有限公司；
磷酸氢二钠为分析纯，安徽省中佳盐化科技有限公司
对照品：1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，供含量测定用，99.53％，批号PCL-#-Cl032,TRC；1- (3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，供含量测定用，98％，批号11-GHZ-89-1,TRC；1-(2，3-氯苯基) 哌嗪二聚体盐酸，供含量测定用，100.00％，批号2-JTN-61-1,TRC；2,3-二氯苯胺，供含量测定用，100.00％，批号2-EMA-95-1,TRC。
样品：1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐，生产批号(LPQY-170103M(1702)、LPQY-170104M(1703)、 LPQY-170901M(1704)),连云港皓海医药科技有限公司。
分离度(R)检测方法：
分离度(R)为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R<1时，两峰有部分重叠；当R＝1.0 时，分离度可达98％；当R＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。R≥1.5称为完全分离。根据《中国药典》规定，R应大于1.5。
分离度(R)计算公式如下：
R＝2(tR2-tR1)/(W1+W2)
tR2:相邻两峰中后一峰的保留时间；
tR1:相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1、W2:此相邻两峰的峰宽
定量限及检测限，将杂质对照溶液稀释后进样，至信噪比(S/N)约为3时的进样量作为检测限(DL)，S/N约为10时的进样量作为定量限(QL)。定量限及检测限越低，其检测方法的灵敏度越高。
其中，主成分为1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐，杂质1为1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，杂质2为1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，杂质3为1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐和杂质4为2,3-二氯苯胺。
对比例1：
样品溶液配制：取样品适量，置50ml量瓶中加流动相溶解，超声数分钟后稀释至刻度，摇匀过滤，制成有关物质检查供试液。
对照品溶液的制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml 含2,3-二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐 0.4μg、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐0.4μg的混合溶液，即得；
检测条件：采用反相高效液相色谱法，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱.流动相为0.05 mol/l磷酸二氢钠水溶液(含l％三乙胺，磷酸调pH至5.5)-乙腈(50：50)，检测波长为254nm，流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量为20μl。
检测结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图1所示。从图中可以看出，杂质1与杂质2分离度为0.77，杂质3和杂质4包裹在一起无法分离。
对比例2：
样品溶液配制:取样品适量，用适量稀醋酸溶解，并以流动相精密加至10mL，为甲液。精密吸取甲液1.0mL于100mL量瓶中，加流动相定容，为乙液。
对照品溶液的制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml 含2,3-二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐 0.4μg、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐0.4μg的混合溶液，即得；
色谱条件：采用反相C8色谱柱，在室温条件下，以甲醇-1.5％三乙胺(用醋酸调节pH5.6)(80：20)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为257nm，进样体积10μl.
检测结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图2所示。从图中可以看出，杂质2与主成分包裹在一起，无法分离。
对比例3：
样品溶液制备：取样品适量，用乙腈溶解定容制成0.4mg/ml的供试品溶液；
对照品溶液的制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml 含2,3-二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐 0.4μg、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐0.4μg的混合溶液，即得；
色谱条件：色谱柱InertSustain C8柱(4.6mm*250mm,5μm)；流动相乙腈：0.01ml/l磷酸二氢铵溶液(50:50)；检测波长253nm；流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量20ul。
检测结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图4所示。从图中可以看出，杂质1与杂质2的分离度小于1.5，杂质3和杂质4包裹在一起无法分离，且主成分塔板数274，远低于正常值2000。
对比例4：
样品溶液制备：取样品适量，用甲醇溶解定容制成0.8mg/ml的供试品溶液；
对照品溶液的制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml 含2,3-二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐 0.4μg、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐0.4μg的混合溶液，即得；
色谱条件：采用Hypersil Cls色谱柱(150mm*4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-磷酸盐缓冲溶液(20mmol/L的磷酸二氢钾溶液，pH 6.3(62：38)，流速：1.0ml/min，检测波长： 257nm。
检测结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图4所示。从图中可以看出，杂质1与杂质2以及杂质2与主成分分离度均小于1.5，且主成分塔板数356远低于正常值2000，无法满足检测要求。
对比例5：
样品溶液制备：取样品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂(甲醇：水＝80：20)超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml 含2,3-二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐 0.4μg、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐0.4μg的混合溶液，即得；
色谱条件：Agilent 1200型液相色谱仪及化学工作站；自动进样；以AgilentEclipse Plus C18柱(5μm，250×4.6mm)为分离色谱柱；紫外检测器波长：254nm；流动相：以0.01mol/L 磷酸二氢钾溶液(用磷酸溶液调节pH值至3.0)为流动相A，以甲醇-乙腈(15：85)为流动相B，梯度洗脱；0分钟，流动相A为90％，流动相B为10％；0分钟至5分钟，流动相A为90％，流动相B为10％；5分钟至35分钟，流动相A线性减少至20％，流动相B线性增加至80％；35分钟至 45分钟，流动相A为20％，流动相B为80％；流动相A和流动相B均为体积百分比。柱温为25℃，流速：1.0ml/min，进样体积为20μl。
检测结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图5所示。从图中可以看出，杂质2、杂质3、杂质4均未检出，可能与主成分包裹在一起。
从对比例1-5可以看出，采用现有技术所公开的阿立哌唑有关物质检测方法无法有效分离1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质。为了能更全面、更有效地进行1-(2,3- 二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质的质量控制，建立一个快速、简便、准确可靠的分析方法，以用于含有1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质检测。本发明通过对检测条件进行了大量摸索实验研究，其摸索实验及考察结果如下：
实验一：不同种类、用量以及PH值的缓冲盐溶液对1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐有关物质检测结果的影响
供试样品溶液制备：取1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐样品适量，加乙腈定容制成0.4mg/ml的供试品溶液；
对照品溶液的制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml 含2,3-二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐 0.4μg、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐0.4μg的混合溶液，即得；
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱规格为150×4.6mm，3μm；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪进行检测，对不同缓冲盐的液相色谱条件进行考察，部分试验及结果见表1：
表1：缓冲盐溶液种类、用量以及PH值对检测结果的影响
Figure BDA0001772041170000081
Figure BDA0001772041170000091
Figure BDA0001772041170000101
实验二：不同洗脱条件对检测结果的影响
基于上述研究过程表明：在等度洗脱条件下，无论是采用不同缓冲盐，还是调整缓冲盐的比例，还是调整缓冲盐的PH值，均无法有效检测出1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸盐有关物质。基于此，本法发明进一步梯度洗脱条件下对检测结果的影响。通过大量实验发现，只有在特定梯度洗脱条件下才能有效分离主成分及其4种杂质，具体实验条件及结果如下：
供试样品溶液制备：同实验一
对照品溶液制备：同实验一
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱规格为150×4.6mm，3μm；流动相A为0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液：乙腈(95:5)，流动相 B为乙腈：0.2mol/L磷酸溶液(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min。
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪进行检测，对不同洗脱条件进行考察，部分试验及结果见表2：
表2：不同洗脱条件对检测结果的影响
Figure BDA0001772041170000102
Figure BDA0001772041170000111
实验三：不同浓度的磷酸氢二钠溶液与磷酸溶液对检测结果的影响
结合实验三，本发明还继续考察了不同浓度的磷酸氢二钠溶液和磷酸溶液也对检测结果有显著影响，只有在特定浓度范围的磷酸氢二钠溶液与磷酸溶液才能保证主成分及其有关杂质的分离效果及其方法的灵敏度，其具体实验条件及结果如下：
供试样品溶液制备：同实验一
对照品溶液制备：同实验一
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱规格为150×4.6mm，3μm；流动相A为磷酸氢二钠溶液：乙腈(95:5)，流动相B为乙腈：磷酸溶液(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min。
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪进行检测，按照表3中的不同浓度磷酸氢二钠溶液和磷酸溶液条件下采用以下梯度洗脱条件进行考察，部分实验及结果见表3：
Figure BDA0001772041170000112
Figure BDA0001772041170000121
表3：磷酸氢二钠缓冲液和磷酸溶液不同浓度对检测结果的影响
Figure BDA0001772041170000122
Figure BDA0001772041170000131
实验四：不同体积比的磷酸氢二钠、乙腈和磷酸对检测结果的影响
结合实验四，本发明还继续考察了流动相A中的0.02mol/L磷酸氢二钠溶液和乙腈以及流动相B中的乙腈和0.2mol/L磷酸溶液体积比也对检测结果有显著影响，只有特定体积比的0.02mol/L磷酸氢二钠溶液和乙腈作为流动相A以及特定体积比的乙腈和0.2mol/L磷酸溶液作为流动相B，才能保证主成分及其有关杂质的分离效果及其方法的灵敏度，其具体实验条件及结果如下：
供试样品溶液制备：同实验一
对照品溶液制备：同实验一
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱规格为150×4.6mm，3μm；流动相A为0.02mol/L磷酸氢二钠溶液：乙腈，流动相B为乙腈：0.2mol/L磷酸溶液，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min。
含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪进行检测，对下表 表4 不同的体积比条件采用以下梯度洗脱条件进行考察，
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
部分实验及结果见表4：
表4：不同体积比的磷酸氢二钠、乙腈和磷酸对检测结果的影响
Figure BDA0001772041170000141
Figure BDA0001772041170000151
实施例1
1、样品制备
样品溶液制备：取1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐样品适量，加乙腈定容制成0.4mg/ml的供试品溶液；
对照品溶液制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml含2,3-二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸0.4μg的混合溶液，即得；
2、检测
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱 规格为 150×4.6mm，3μm；流动相A为0.02mol/L的磷酸氢二钠：乙腈(95:5)，流动相B为乙 腈：0.2mol/L磷酸(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件 如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
试验结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图(6)及表(5)所示：
名称 定量限(ug/ml) 检测限(ug/ml) 分离度 理论踏板数
杂质1 0.04 0.01 6.21 32127
杂质2 0.01 0.003 16.67 55622
主成分 0.04 0.01 29.21 132974
杂质3 0.01 0.003 41.37 892720
杂质4 0.04 0.01 —— 317622
实施例2
1、样品制备
供试样品溶液制备：实施例一
对照品溶液制备：实施例一
2、检测
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱 规格为 150×4.6mm，3μm；；流动相A为0.02mol/L的磷酸氢二钠：乙腈(95:5)，流动相B为乙 腈：0.3mol/L磷酸(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件 如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
试验结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图7及表(6)所示，该检测 方法，检测时间短，分离度高，但主成分与杂质的理论塔板数明显下降：
名称 定量限(ug/ml) 检测限(ug/ml) 分离度
杂质1 0.04 0.01 6.46 14954
杂质2 0.01ug/ml 0.003ug/ml 7.43 27558
主成分 0.04ug/ml 0.013ug/ml 21.53 5529
杂质3 0.02ug/ml 0.005ug/ml 23.73 378133
杂质4 0.04ug/ml 0.01ug/ml —— 83449
实施例3
1、样品制备
供试样品溶液制备：实施例一
对照品溶液制备：实施例一
2、检测
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱 规格为150×4.6mm，3μm；；流动相A为0.02mol/L的磷酸氢二钠：乙腈(95:5)，流动相B为乙 腈：0.05mol/L磷酸(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条 件如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
3、试验结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图(8)及表(7)所示，该 检测方法，检测时间短，分离度高，但主成分与杂质的理论塔板数明显下降。
名称 定量限(ug/ml) 检测限(ug/ml) 分离度 理论塔板数
杂质1 0.04ug/ml 0.01ug/ml 6.49 15422
杂质2 0.01ug/ml 0.003ug/ml 7.35 29029
主成分 0.04ug/ml 0.013ug/ml 20.28 5739
杂质3 0.03ug/ml 0.01ug/ml 9.25 395840
杂质4 0.04ug/ml 0.01ug/ml —— 26697
实施例4
1、样品制备
供试样品溶液制备：实施例一
对照品溶液制备：实施例一
2、检测
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱 规格为 150×4.6mm，3μm；流动相A为0.03mol/L的磷酸氢二钠：乙腈(95:5)，流动相B为乙 腈： 0.2mol/L磷酸(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条 件如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
3、试验结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图9和表(8)所示，检测 时间短，分离度高，但主成分与杂质的理论塔板数明显下降。
名称 定量限(ug/ml) 检测限(ug/ml) 分离度 理论塔板数
杂质1 0.04ug/ml 0.01ug/ml 6.46 14165
杂质2 0.01ug/ml 0.003ug/ml 7.47 26039
主成分 0.04ug/ml 0.013ug/ml 22.51 5173
杂质3 0.03ug/ml 0.01ug/ml 13.49 363419
杂质4 0.04ug/ml 0.01ug/ml —— 39524
实施例5
1、样品制备
供试样品溶液制备：实施例一
对照品溶液制备：实施例一
2、检测
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱 规格为 150×4.6mm，3μm；流动相A为0.01mol/L的磷酸氢二钠：乙腈(95:5)，流动相B为乙 腈：0.2mol/L磷酸(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件 如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
3、试验结果：按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图10和表(9)所示，检测时间短，分离度高，但主成分与杂质的理论塔板数明显下降。
Figure BDA0001772041170000181
Figure BDA0001772041170000191
实施例6方法学验证
1、样品制备
样品溶液制备：取1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐样品适量，加乙腈定容制成0.4mg/ml的供试品溶液；
对照品溶液的制备：取2,3-二氯苯胺，1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐，1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml含2,3- 二氯苯胺0.4μg、1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐0.4μg、 1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸0.4μg的混合溶液，即得；
2、检测
色谱条件：仪器：Agilent1200，色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱 规格为 150×4.6mm，3μm；流动相A为0.02mol/L的磷酸氢二钠：乙腈(95:5)，流动相B为乙 腈：0.2mol/L磷酸(95:5)，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件 如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
10 70 30
25 15 85
25.1 85 15
30 85 15
专属性考察：
杂质定位溶液：1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐-杂质对照品适量，分别置量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，即得。
1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐-杂质浓度
杂质名称 杂质1 杂质2 杂质3 杂质4
称样量mg 25.10 25.03 25.11 25.04
含量 —— 99.53％ 98％ 99.11％
浓度mg/ml 0.1004 0.9965 0.9843 0.9927
空白：乙腈
结果下表10，各主峰出峰顺序为：杂质1、杂质2、杂质3、杂质4。空白溶剂无干扰，主成分与相邻杂质、已知杂质间的分离度均≥1.5。
表10：1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐专属性考察数据
Figure BDA0001772041170000201
重复性考察
样品重复性：精密称取样品10mg，置25ml容量瓶中，精密加入1ml混合对照溶液(10μg/ml) 至容量瓶中，用稀释剂溶解定容，平行制备6份，分别进样，记录色谱图，结果如下表11。
表12：重复性测定结果
Figure BDA0001772041170000202
结果表明：6次测定的测定结果中各杂质的RSD均小于3％，重复性符合要求。

Claims (15)

1.一种1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法，取供试品溶液，按照高效液相色谱条件进行检测，其中所述高效液相色谱测定条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为乙腈-磷酸氢二钠缓冲溶液，流动相B为乙腈-磷酸；所述流动相A的磷酸氢二钠缓冲溶液浓度为0.01-0.03mol/L，所述流动相A的磷酸氢二钠缓冲溶液与乙腈体积比为94-96:6-4；所述流动相B的磷酸浓度为0.05-0.3mol/L，所述流动相B的乙腈与磷酸体积比为94-96:6-4；所检测的成分为1-(2-氯苯基)哌嗪盐酸盐、1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐、1-(2，3-氯苯基)哌嗪二聚体盐酸、1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐、2,3-二氯苯胺；检测波长为254nm，采用梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
Figure FDA0003631199930000011
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的磷酸氢二钠缓冲溶液浓度为0.02-0.03mol/L。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的磷酸氢二钠缓冲溶液浓度为0.02mol/L。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的磷酸氢二钠缓冲溶液与乙腈体积比为95:5。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相B的磷酸浓度为0.2-0.3mol/L。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述流动相B的磷酸浓度为为0.2mol/L。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相B的乙腈与磷酸体积比为95:5。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液进样体积为10-20μl。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液进样体积为20μl。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱测定条件柱温为25-35℃；所述高效液相色谱测定条件流速0.8-1.2ml/min。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱测定条件柱温为30℃。
12.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱测定条件流速为1.0ml/min。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱规格为150×4.6mm，3μm。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液为含有0.4mg/ml的1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐乙腈溶液。
15.根据权利要求1-14任一项所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐样品，加乙腈定容制成0.4mg/ml的供试品溶液；
2)含量检测：取供试品溶液20μl注入液相色谱柱，进行检测，其中色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱规格为150×4.6mm，3μm；流动相A为0.02mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液-乙腈，其中磷酸氢二钠缓冲溶液与乙腈的体积比为95:5，流动相B为乙腈-0.2mol/L磷酸，其中乙腈与磷酸的体积比为95:5，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，梯度洗脱条件如下：
Figure FDA0003631199930000031
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