CN109374784B - 一种用hplc分离测定达格列净原料药有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，采用紫外检测器对达格列净原料药的有关物质进行检测，所述紫外检测器的检测波长为205～230nm。本发明方法通过综合考虑分析柱、流动相、梯度洗脱程序以及流速、柱温对分离检测的综合影响，使得检测结果达到了最优化，从而有效的控制原料药的质量，并且该检测方法具有快速简便、灵敏度高、专属性强、精密度高、准确可靠和操作方便的优点，适用于分离测定达格列净原料药的有关物质。

Description

一种用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法。

背景技术

达格列净(Dapagliflozin，商品名Farxiga)，由百时美施贵宝和阿斯利康公司联合开发的一种新型的抗糖尿病药物，于2012年11月12日被欧洲药品管理局批准上市，是第一个获准上市用于治疗2型糖尿病的SGLT2抑制剂。2014年1月8日获美国FDA批准上市，用于改善2型糖尿病成人患者的血糖控制。达格列净是一种新的钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂药物，通过抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，增加葡萄糖排泄，进而降低糖尿病患者已升高的血糖水平。分子式为C₂₁H₂₅ClO₆·C₃H₈O₂·H₂O，分子量为502.98，结构式如下式(1)：

达格列净在制备过程中，因起始原料、合成工艺、降解等多种因素产生多个杂质，其中以杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H和杂质I为合成工艺中较易产生，作为有关物质项目中主要考察杂质，其限度要求均为不得过0.10wt％。

达格列净杂质A为合成工艺起始原料，分子式：C₁₅H₁₄BrClO，分子量：325.63，化学结构式如下式(2)：

达格列净杂质B为中间体II，分子式：C₂₂H₂₇ClO₇，分子量：438.90，化学结构式如下式(3)：

达格列净杂质C为中间体III，分子式：C₃₀H₃₅ClO₁₁，分子量：607.05，化学结构式如下式(4)：

达格列净杂质D为中间体IV，分子式：C₃₀H₃₃ClO₁₀，分子量：577.02，化学结构式如下式(5)：

达格列净杂质E为中间体-II合成中，原料在丁基锂作用下，形成碳负离子，如有活泼氢存在，将产生副产物杂质E，分子式：C₁₅H₁₅ClO，分子量：246.73，化学结构式如下式(6)：

达格列净杂质F为合成反应中形成的副产物，分子式：C₂₃H₂₇ClO₇,，分子量：408.87，化学结构式如下式(7)：

达格列净杂质G为中间体-II合成中，碳负离子不同位置进攻葡萄糖酸内酯上的羰基，形成不同手性中间体，最终生成达格列净相应的异构体杂质，分子式：C₂₁H₂₅ClO₆，分子量：408.87，化学结构式如下式(8)：

达格列净杂质H为合成达格列净中糖的片断可能开环形成杂质，分子式：C₂₁H₂₇ClO₇，分子量：426.89，化学结构式如下式(9)：

达格列净杂质I为六元环的葡萄糖有微量的五元环糖生成，故在合成达格列净中可能有杂质I，分子式：C₂₁H₂₅ClO₆，分子量：408.87，化学结构式如下式(10)：

为了控制达格列净原料药的质量，需要对主要成分和杂质进行控制，在现有的技术中，没有适合于快速、简便、精确分析检测达格列净原料药有关物质的分析方法。因此，对于达格列净原料药有关物质的测定方法存在进一步的改进和优化需求。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，从而提供了一种用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，具有快速简便、灵敏度高、准确可靠的优点。

本发明采用的技术方案是：

一种用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，采用紫外检测器对达格列净原料药的有关物质进行检测，所述紫外检测器的检测波长为205～230nm。

本发明所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其中，色谱柱长为150mm～250mm，柱内径为4.6mm；优选色谱柱长为250mm。由此，可以提高主峰与杂质G峰的分离度。

本发明所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其中，所述填充剂的粒径为1.8～5μm，优选所述填充剂的粒径为5μm。由此，可以进一步提高分离度。

本发明所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其中，流速为1.0ml/min，柱温为30℃柱温。由此，可提高杂质之间的分离度。

本发明所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其中，所述梯度洗脱的程序为：

时间，分钟	流动相A，体积％	流动相B，体积％
			0	70～72	26～30
10	70～72	26～30
			30～45	10	90
55	10	90
			56	70～72	26～30
70	70～72	26～30

本发明所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其中，所述梯度洗脱的程序为：

时间，分钟	流动相A，体积％	流动相B，体积％
			0	72	28
10	72	28
			40	10	90
55	10	90
			56	72	28
70	72	28

由此得到的分离效果最佳，峰形最好。

本发明所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其中，所述紫外检测器的检测波长为224nm。由此，可以提高杂质的检测灵敏度。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明方法通过综合考虑分析柱、流动相、梯度洗脱程序以及流速、柱温对分离检测的综合影响，使得检测结果达到了最优化，可以将达格列净原料药中的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H和杂质I在同一色谱条件进行快速高效的分离，从而有效的控制原料药的质量，并且该检测方法具有快速简便、灵敏度高、专属性强、精密度高、准确可靠和操作方便的优点，适用于分离测定达格列净原料药的有关物质。

附图说明

图1为本发明中按实施例1条件检测的空白溶液的色谱图；

图2为本发明中按实施例1条件检测的系统适用性溶液的色谱图；

图3为本发明中按实施例1条件检测的供试品溶液的色谱图；

图4为本发明中按实施例1条件检测的达格列净及各杂质定量限的色谱图；

图5为本发明中按实施例2条件检测的系统适用性溶液的色谱图；

图6为本发明中按实施例2条件检测的供试品溶液的色谱图；

图7为本发明中按实施例2条件检测的空白溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。所用试剂及仪器未注明生产厂商者，均可以通过市购获得常规产品。

本发明实施例中所用的达格列净原料药及杂质对照品均为发明人自制。

实施例1

色谱条件：

色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm

流动相A：水

流动相B：乙腈

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

检测波长：224nm

进样量：20μl

梯度洗脱程序为：

表1梯度洗脱程序

时间，分钟	流动相A，体积％	流动相B，体积％
			0	72	28
10	72	28
			40	10	90
55	10	90
			56	72	28
70	72	28

溶液配制：

杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品各约10mg，精密称定，置同一50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，所述稀释剂为：乙腈-水(30:70)(V/V)。

系统适用性溶液：取达格列净工作对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取达格列净原料药约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

达格列净对照品贮备液：取达格列净工作对照品约12.5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

定量限溶液：精密量取上述杂质对照品贮备液及达格列净对照品贮备液各1ml至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml至100ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

测定：分别将空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液和定量限溶液注入高效液相色谱仪进行检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料(粒径为5μm，柱内径为4.6mm，色谱柱长为250mm)，按表1梯度洗脱程序检测，记录色谱图。

空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和定量限溶液的色谱图分别如图1、2、3和4所示，可知，图1表明空白不干扰杂质检查；图2表明各杂质及达格列净之间分离度良好，具体达格列净系统适用性图谱数据见表2；图3自制的达格列净样品中未检出杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G、杂质H和杂质I；检出的杂质F及其他单个杂质均在规定的限度以下；图4表明达格列净及杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H和杂质I检测限分别为0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％和0.02wt％，远低于各杂质的限度0.10wt％，本法的检测灵敏度高。

表2实施例1中达格列净系统适用性图谱数据表

实施例2

色谱条件：

色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm

流动相A：水

流动相B：乙腈

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

检测波长：224nm

进样量：20μl

梯度洗脱程序为：

表3梯度洗脱程序

时间，分钟	流动相A，体积％	流动相B，体积％
			0	72	26
10	72	26
			43	10	90
55	10	90
			56	72	26
70	72	26

溶液配制：

杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品各约10mg，精密称定，置同一50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，所述稀释剂为：乙腈-水(30:70)(V/V)。

系统适用性溶液：取达格列净工作对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取达格列净原料药约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

测定：将系统适用性溶液、供试品溶液和空白溶液注入高效液相色谱仪进行检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料(粒径为5μm，柱内径为4.6mm，色谱柱长为250mm)，按表3梯度洗脱程序检测，记录色谱图。

系统适用性溶液、供试品溶液和空白溶液的色谱图分别如图5、6和7所示，可知，在此条件下，空白不干扰已知杂质及未知杂质的检查，各杂质及达格列净峰之间的分离度良好，自制的达格列净样品检出杂质F在规定的限度以下，未检出其它已知杂质。实施例2在实施例1方法的基础上主要考察杂质与达格列净之间的分离度试验(即系统适用性试验)及与实例1供试品溶液杂质谱进行对比，结果基本一致。

表4实施例2中达格列净系统适用性图谱数据表

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其特征在于：包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以水为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，采用紫外检测器对达格列净原料药的有关物质进行检测，所述紫外检测器的检测波长为205～230nm；

所述梯度洗脱的程序为：

时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％ 0 72 28 10 72 28 40 10 90 55 10 90 56 72 28 70 72 28

或所述梯度洗脱的程序为：

时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％ 0 72 26 10 72 26 43 10 90 55 10 90 56 72 26 70 72 26

所述达格列净原料药有关物质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H和杂质I，所述杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H和杂质I的化学结构式分别为：

2.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其特征在于：所述色谱柱长为150mm～250mm，柱内径为4.6mm。

3.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其特征在于：所述色谱柱长为250mm。

4.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其特征在于：所述填充剂的粒径为5μm。

5.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其特征在于：流速为1.0ml/min，柱温为30℃柱温。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的用HPLC分离测定达格列净原料药有关物质的方法，其特征在于：所述紫外检测器的检测波长为224nm。

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