CN104678026A - 一种测定有机药物中四丁基溴化铵含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定有机药物中四丁基溴化铵残留量的方法，该方法采用液相色谱法，选用反相色谱柱，以四甲基氢氧化铵-磷酸溶液与乙腈组成流动相，进行梯度洗脱。与现有技术相比，本发明的方法可以将四丁基溴化铵与有机药物较好分离，检测的重现性好、灵敏度高、专属性强，操作简便，有助于控制有机药物的质量和用药安全。

Description

一种测定有机药物中四丁基溴化铵含量的方法

技术领域

本发明属于药物分析方法领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法测定有机药物中四丁基溴化铵含量的方法。

背景技术

四丁基溴化铵为一种有机化学相转移催化剂，用于如苄基三乙基氯化铵，肉桂酸乙酯，假性紫罗兰酮等药物中间体的合成，也用于抗感染药物巴氨西林、舒他西林等有机药物的合成，在新作用机制的抗糖尿病药物达格列净等列净类药物的合成中也采用了四丁基溴化铵作为催化剂。由于四丁基溴化铵对人体皮肤、眼睛和呼吸系统有刺激作用，当人体吸入、摄取或皮肤接触一定量四丁基溴化铵时有中毒可能。当药物中残留四丁基溴化铵时，除了会直接影响药物的纯度和质量，更会影响用药安全。因此，需要控制药物中四丁基溴化铵的限量，以确保药物安全有效。

四丁基溴化铵的化学结构式如下：

                                                 。

要控制四丁基溴化铵在药物中的限量，需要将四丁基溴化铵与药物，特别是列净类药物有效分离，目前，有关有机药物中四丁基溴化铵含量的测定主要有UPLC-MS/MS法、离子色谱法、溴离子选择电极法等。这些方法都存在不少缺点，主要有:

操作繁琐：UPLC-MS/MS法需在使用前花费较长时间进行真空控制和调谐，

溴离子选择电极在使用前需经过数十分钟的活化；

专属性不佳：离子色谱法、溴离子选择电极法等都存在被药物中残留的其他含溴化合物干扰的可能；

对环境不够友好：由于在离子色谱法中会用到甲磺酸，在溴离子选择电极法中会用到N，N-二甲基甲酰胺，这些试剂均有较大毒性。

同时，UPLC-MS/MS法和离子色谱法还存在仪器普及率低、使用成本高等缺点。

但采用高效液相色谱法测定有关有机药物中四丁基溴化铵含量的方法未见报道。为保证有机药物的质量可控，以确保其有效性和安全性，亟需一种简便有效的检测方法，能够分离测定有机药物中的四丁基溴化铵。本发明人经过大量的科学试验和测试条件的筛选，发现一种快速分离测定有机药物中的四丁基溴化铵的方法，该方法可以有效将有机药物与四丁基溴化铵分离，检测出药物中四丁基溴化铵的残留量，保证了药物的质量可控，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离测定有机药物中四丁基溴化铵的方法，该方法能将有机药物与四丁基溴化铵有效分离，准确检测药物中四丁基溴化铵的含量，从而保证药物的质量控制，从而也确保了药品的有效性和安全性。

为实现本发明的目的，提供如下实施方案。

在一实施方案中，本发明的一种分离测定有机药物中四丁基溴化铵的方法，该方法包括采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，以乙腈为有机相与以离子对试剂溶液为水相混合作为流动相，进行洗脱，以紫外检测器进行检测。

在上述实施方案中，本发明的方法，所述离子对试剂溶液的pH值为2～6，优选为3.0，其中，所述离子对试剂为选自四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵和四丙基氢氧化铵，pH值调节剂选自磷酸、乙酸和硫酸，离子对试剂溶液浓度为0.001～0.1mol/L，优选0.005mol/L。

在上述实施方案中，本发明的方法，水相与有机相的洗脱初始体积比为100∶0～90∶10，对色谱系统进行再进样平衡时，水相与有机相的洗脱终止体积比为70∶30～10∶90。

在上述实施方案中，本发明的方法，紫外检测波长为200nm～220nm，优选为210 nm。

在上述实施方案中，所述有机药物为列净类药物，所述列净类药物为选择性2型钠离子-葡萄糖协同转运蛋白抑制剂（SGLT2），属于小分子口服降糖药，优选为达格列净（dapagliflozin）、卡格列净（canagliflozin）、恩格列净（empagliflozin）、伊格列净（Ipragliflozin）等，优选为卡格列净。

在上述实施方案中，本发明的方法，进一步包括以下步骤：

（1）取有机药物或其药物组合物适量，加乙腈水溶液溶解并稀释制成每1ml中含1～10mg的溶液，优选4mg，滤过，作为供试品溶液，取四丁基溴化铵对照品适量，加乙腈水溶液溶解并稀释制成每1ml中含1～10μg的溶液，优选4μg，滤过，作为对照品溶液；

（2）以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为色谱柱，流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min，柱温为25～35℃, 优选30℃,波长为200nm～220nm，优选210nm；

（3）取供试品溶液和对照品溶液各10～30μl，优选20μl，注入高效液相色谱仪；

（4） 将水相pH2～6的离子对试剂溶液与有机相乙腈以100∶0～90∶10为初始体积比洗脱至四丁基溴化铵峰出来后，完成有机药物中四丁基溴化铵的测定；

（5）逐渐增大乙腈比例，至水相与有机相的体积比达到 70∶30～10∶90并保持一定时间，对色谱系统进行再进样平衡；

（6）采用外标法以峰面积计算有机药物中四丁基溴化铵的含量。

在上述实施方案中，本发明的方法，步骤（1）的乙腈水溶液为乙腈：水=90∶10v/v的溶液，步骤（4）中水相为pH3.0的四甲基氢氧化铵溶液；水相与有机相的初始体积比为99∶1，洗脱至四丁基溴化铵峰出来后，逐渐增大乙腈比例，至水相与有机相的体积比达到10∶90并保持25分钟，完成四丁基溴化铵的测定。

本发明所说的用高效液相色谱分离测定有机药物中四丁基溴化铵含量的方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为以0～0.1mol/L四甲基氢氧化铵溶液为水相和以乙腈作为有机相的混合液，柱温为：25～35℃，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长为200～220nm，包括以下步骤：

（1）取列净类药物，精密称定，加乙腈水溶液适量使溶解，再乙腈水溶液稀释制成每1ml中含4mg的溶液，必要时滤过，作为供试品溶液；另精密量取四丁基溴化铵溶液适量，用乙腈水溶液稀释制成每1ml中含4μg的溶液，必要时滤过，作为对照品溶液；

（2）取供试品溶液和对照品溶液各10～30μl，注入高效液相色谱仪，进行梯度洗脱：0min至第5min时，流动相中水相与有机相的体积比为100∶0～90∶10，此时已完成四丁基溴化铵的测定，记录色谱图；

（3）任选的，第6min时，水相与有机相的体积比匀速变化至70∶30～10∶90，保持至第30min；第31min时，水相与有机相的体积比匀速变化至100∶0～90∶10；第50min时水相与有机相的体积比保持比例不变，完成对色谱系统进行再进样平衡。

上述本发明的方法，所述乙腈水溶液为乙腈：水=90∶10（体积比）的溶液。

上述本发明的方法，所述列净类药物选自达格列净（dapagliflozin）、卡格列净（canagliflozin）、恩格列净（empagliflozin）、伊格列净（Ipragliflozin）等，优选为卡格列净。

上述本发明的方法，四甲基氢氧化铵溶液的pH为2-6，优选为3，pH调节剂为磷酸。

上述本发明所说的用高效液相色谱分离测定有机药物中四丁基溴化铵的方法，优选的，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（AichromBond-AQ C18 4.6 mm×250mm，5μm），以0.005mol/L四甲基氢氧化铵溶液，用磷酸调pH值至3.0作为水相,以乙腈作为有机相，流动相为所述水相与所述有机相的混合液，包括以下步骤：

（1）取有机药物卡格列净，精密称定，加乙腈水溶液（乙腈：水=90∶10v/v）适量使溶解，再用乙腈水溶液稀释制成每1ml中含4mg的溶液，必要时滤过，作为供试品溶液；另精密量取四丁基溴化铵溶液适量，用乙腈水溶液稀释制成每1ml中含4μg的溶液，必要时滤过，作为对照品溶液;

（2）取供试品溶液和对照品溶液各10～30μl，注入高效液相色谱仪，进行梯度洗脱，柱温为：30℃；流速为1.0ml/min检测波长为210nm，洗脱条件如下：0min至第5min时，流动相中水相与有机相的体积比为99∶1，此时已完成四丁基溴化铵的测定，记录色谱图；任选的，

（3）为了连续再进样，设置一段平衡色谱系统过程，即第6min时，水相与有机相的体积比匀速变化至10∶90，保持至第30min；第31min时，水相与有机相的体积比匀速变化至99∶1；第50min时水相与有机相的体积比保持比例不变，完成冲洗和平衡过程。

本发明的方法，有益效果或优势在于：

①专属性强，能够提供四丁基溴化铵的定量结果，同时溶剂、有机药物，药物的杂质不会干扰测定；

②灵敏度高，本发明中四丁基溴化铵最低检测浓度为47.9ng/ml，能够保证微量杂质的检出；

③耐用性好，微调色谱条件中流动相pH值、流动相比例、流速等参数在本发明的范围内波动，不会对检测结果产生显著影响；

④实用性强，本发明中仅需6min即可完成四丁基溴化铵测定，且检测过程简单、便捷。如果需要连续进样测定，在检测完四丁基溴化铵之后设计有平衡色谱系统过程，保证了检测结果能够良好重现。

总之，本发明可以实现有机药物与四丁基溴化铵的快速分离分析，四丁基溴化铵峰峰形对称、理论板数高；采用合适的等度洗脱，提供了较小基线噪音的同时避免了分析用时过长；采用合适的平衡过程能够保证连续进样时的良好重现性。因此，本发明的方法还拥有简便、快捷和重现性好等优点。

附图说明

图1：乙腈水溶液空白的高效液相色谱图；

图2：卡格列净供试品溶液的高效液相色谱图；

图3：四丁基溴化铵对照品溶液的高效液相色谱图；

图4：混有四丁基溴化铵的有机药物供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（AichromBond-AQ C18 4.6 mm×250mm，5μm）；

流动相A即水相：0.005mol/L四甲基氢氧化铵溶液，用磷酸调节pH值为3.0，流动相B即有机相：乙腈。

按梯度洗脱表（见表1）洗脱（5min后为平衡系统阶段）。

进样体积：20μl；

柱温：30℃；

检测波长：210nm。

实验步骤

取卡格列净原料药粗品约400mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加乙腈水溶液（乙腈∶水=90∶10v/v，下文均同）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取四丁基溴化铵对照品约10mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.1ml，置10ml容量瓶中，加乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。

分别取乙腈水溶液（溶剂空白）、供试品溶液和对照品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见图1、图2、图3。结果四丁基溴化铵峰、卡格列净峰保留时间分别约为3.2分钟、11.8分钟。结果表明溶剂不干扰四丁基溴化铵的检测，原料药中无色谱峰与四丁基溴化铵峰重合，方法专属性好。

实施例2

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（AichromBond-AQ C18 4.6 mm×250mm，5μm）；

流动相A：水相0.005mol/L四甲基氢氧化铵溶液，用磷酸调节pH值为3.0，流动相B：乙腈；

按梯度洗脱表（见表2）洗脱（5min后为平衡系统阶段）。

进样体积：20μl；

柱温：30℃

检测波长：210nm。

实验步骤

取卡格列净原料药粗品约400mg，精密称定，置10ml容量瓶中，精密加入四丁基溴化铵溶液适量，加乙腈水溶液溶解并稀释制成每1ml中含四丁基溴化铵4μg的混合溶液，摇匀，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见图4。结果表明，原料药中各组分与四丁基溴化铵均能良好分离，方法专属性好。

实施例3

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（AichromBond-AQ C18 4.6 mm×250mm，5μm）；

流动相A：水相0.005mol/L四甲基氢氧化铵溶液，用磷酸调节pH值为2.0，流动相B：乙腈；

按梯度洗脱表（见表3）洗脱（5min后为平衡系统阶段）。

进样体积：20μl；

柱温：30℃。

实验步骤

取四丁基溴化铵对照品约10mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。取恩格列净原料药500mg，精密称定，置10ml容量瓶中，精密加入贮备液0.1ml，加乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

取供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，分别以200nm和220nm作为检测波长，记录色谱图。结果恩格列净峰保留时间约为10分钟。结果表明检测波长在200nm和220nm时，溶剂不干扰四丁基溴化铵的检测，原料药及其杂质与四丁基溴化铵能良好分离，方法专属性好。

实施例4

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（AichromBond-AQ C18 4.6 mm×250mm，5μm）；

一组流动相A：0.005mol/L四甲基氢氧化铵溶液，用磷酸调节pH值为2.0，另一组流动相A：0.005mol/L四甲基氢氧化铵溶液，用磷酸调节pH值为6.0，流动相B：乙腈；两组流动相A分别与流动相B组合按梯度洗脱表（见表4）各洗脱一次（5min后为平衡系统阶段）。

 进样体积：20μl；

柱温：30℃；

波长：210nm。

实验步骤

取四丁基溴化铵对照品约10mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。取达格列净原料药600mg，精密称定，置10ml容量瓶中，精密加入贮备液0.1ml，加乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

取供试品溶液，以pH值2.0流动相和pH值6.0流动相，在上述色谱条件下分别进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果达格列净峰保留时间约为11分钟。结果表明pH值2.0和6.0流动相与pH值3.0的检测的结果基本一致，本方法流动相的pH值适用范围广。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种采用高效液相色谱法测定有机药物中四丁基溴化铵的方法，该方法包括以十八烷基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，以乙腈为有机相与以离子对试剂溶液为水相的混合液作为流动相，所述离子对试剂溶液的pH值为2～6，进行梯度洗脱，以紫外检测器进行检测，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～35℃，波长为200nm～220nm。

2.根据权利要求1所述的方法，所述离子对试剂溶液的pH值为3.0。

3.根据权利要求1所述的方法，所述离子对试剂选自四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵和四丙基氢氧化铵。

4.根据权利要求1所述的方法，水相中离子对试剂浓度为：0.001～0.05mol/L。

5.根据权利要求4所述的方法，水相中离子对试剂浓度为：0.005mol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱，水相与有机相的洗脱初始体积比为100∶0～90∶10，水相与有机相的洗脱终止体积比为70∶30～10∶90。

7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：

（1）取有机药物或其药物组合物适量，加乙腈水溶液溶解并稀释制成每1ml中含1～10mg的溶液，滤过，作为供试品溶液，取四丁基溴化铵对照品适量，加乙腈水溶液溶解并稀释制成每1ml中含1～10μg的溶液，滤过，作为对照品溶液；

（2）取供试品溶液和对照品溶液各10～30μl，注入高效液相色谱仪；

（3） 进行梯度脱洗：将水相pH2～6的离子对试剂溶液与有机相乙腈以100∶0～90∶10为初始体积比洗脱至四丁基溴化铵峰出来后，完成有机药物中四丁基溴化铵的测定；任选的，

（4）逐渐增大乙腈比例，至水相与有机相的体积比达到 70∶30～10∶90并保持一定时间，对色谱系统进行再进样平衡；

（5）采用外标法以峰面积计算有机药物中四丁基溴化铵的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，步骤（1）中，供试品溶液中每1ml含有机药物4mg，对照品溶液中每1ml含四丁基溴化铵4μg，所述乙腈水溶液为乙腈：水=9：1v/v的溶液；或步骤（2）中，取供试品溶液20μl；或步骤（3）中水相与有机相的初始体积比为99∶1，洗脱至四丁基溴化铵峰出来后，完成测定；步骤（4）中水相与有机相的体积比到10∶90，完成色谱系统再进样平衡。

9.根据权利要求1所述的方法，所述流速为1.0ml/min，柱温为30℃，波长为210nm。

10.根据权利要求1或7所述的方法，所述有机药物选自达格列净、卡格列净、恩格列净和伊格列净。