CN104407077B - 一种mes,nhs残留的hplc检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MES,NHS残留的HPLC检测方法，是采用反相C18硅胶键合色谱柱，流动相由pH6.5~6.8的磷酸盐缓冲液和有机溶剂组成，检测波长205~210nm；所述有机溶剂为甲醇或乙腈。该方法样品无需特殊处理，操作方法简单易行，准确度高，能够满足实际检测中的需要，MES和NHS这两种物质的检测能够达到微克级。
Description
技术领域
本发明涉及一种MES,NHS残留的HPLC检测方法。
背景技术
在现今较为稳定的化学交联方法中，碳二亚胺的交联体系越来越受到关注，碳二亚胺的交联体系能够应用于生物多糖、多肽、蛋白质，核酸以及高分子改性等各个生物、有机合成等领域，其本身毒性小，交联效果迅速，结果稳定等优点都极好地弥补了传统采用甲醛，戊二醛交联方式所带来的安全性等问题。相比于热交联等物理交联方法而言，碳二亚胺的交联体系更为稳定，交联出的产品更加均一。2-吗啉乙磺酸（MES）在交联体系中提供较为稳定的pH范围，为EDC的交联反应提供稳定的酸碱环境，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联反应中稳定交联产生的中间体。这两种物质在碳二亚胺的交联体系中为交联提供条件的重要物质，在制药工程中，NHS还是半合成卡那霉素及医药中间体的原料。在交联工艺完成以后，交联剂本身的残留定量检测就成为一个亟待解决的问题，在ICH(TheInternationalConferenceonHarmonizationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse人用药物注册技术要求国际协调会议）在《Q3AR2：新原料药中杂质》中规定，每日最大剂量的药物中，其含有的杂质界定阈值为0.1%或者1mg，现今，对于MES和NHS作这两种交联物质的微量残留检测方法还不完善。这为碳二亚胺交联体系在药物或者医疗器械的广泛应用带来了限制，筛选一种MES和NHS有效的检测方法对于碳二亚胺交联体系的广泛应用有着重要意义。
2-吗啉乙磺酸（MES）和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)这两种物质极性较大，其在水中的溶解度较大，这实际上为两种物质实现单独定量增加了困难。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种精确度较高，能够满足实际需求的MES,NHS残留的HPLC检测方法。
本发明的MES,NHS残留的HPLC检测方法，采用反相C18硅胶键合色谱柱，流动相由pH值为6.5~6.8的磷酸盐缓冲液和有机溶剂组成，检测波长205~210nm；所述有机溶剂为甲醇或乙腈。
其中所述的磷酸盐缓冲液为《中华人民共和国药典》2010年版二部，附录ⅩⅤD缓冲液部分记载的pH值在6.5~6.8范围内的磷酸盐缓冲液。
HPLC检测方法具有定量准确、检测周期短等优点，是较为适于进行微量检测的方法之一。而要实现MES和NHS的HPLC单独定量检测就必须首先实现这两种物质之间的分离度R≥1.5。经过研究发现，两种物质的分离度和流动相的组分，流动相的pH值，流动相配比等多种因素相关，综合性考察各方面因素后得出上述检测方法，能够获得良好的分析结果。
作为优选方案，所述磷酸盐缓冲液与有机溶剂的体积比为95:5~98:2。由于MES和NHS都极易溶于水而从色谱柱中洗脱出来，会导致保留时间不够而分离度较低，所以有机溶剂的体积含量不能太大，水相和有机相的体积比在95:5~98:2比较合适，满足MES和NHS两种物质之间的分离度R≥1.5的要求。其中以磷酸盐缓冲液与有机溶剂体积比为97:3的比例混合最佳，采用单通道分析，最大程度克服因为高效液相色谱仪的泵头计量等因素，在水相和有机相比例悬殊时可能会导致的计量不准确问题。
作为优选方案，所述有机溶剂为甲醇。MES和NHS在甲醇中的保留时间差别较大，更有利于两种物质的单独定量检测，磷酸盐缓冲液和甲醇体积比为97:3，选择该比例的混合液作为流动相，MES和NHS的分离度可以达到2.3，可以保证检测结果更加精确。
作为优选方案，磷酸盐缓冲液的pH值为6.5，用该pH值的磷酸盐缓冲液与有机相组成的流动相，相较于其他pH值分离效果更优。
作为优选方案，检测波长为210nm。选择该检测波长值，能够进一步降低边缘吸收。
作为优选方案，流动相流速为1.0mL/min。流速过快会导致分离物质太快出峰，分离度不好，过慢会导致物质峰形变宽而影响峰形，本发明的检测方法中1.0mL/min的流速最为适合。
作为优选方案，反相C18硅胶键合色谱柱可以选择商品ZORBAX.SB-C18。这种类型的色谱柱能够较好适用于本发明方法且价格相对便宜，可以降低检测成本。
作为优选方案，所述色谱柱内径4.6mm，柱长250mm，填料粒径5μm。柱长过短容易造成分离物质出峰太快，保留时间较短等缺陷，250mm柱长能够很好地克服该缺陷，使检测方法更加稳定可控。
作为优选方案，进样量为10μL，选择该进样量能够使被检测物质在检测波长段内出的响应高低适中，进一步增加检测方法的准确性。
作为优选方案，还包括配制MES的标准品溶液和NHS的标准品溶液，分别注入色谱仪，记录色谱图，绘制MES的标准曲线和NHS的标准曲线；供试样品按照与标准品溶液相同的条件进行HPLC检测，根据标准曲线确定供试样中MES和NHS的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的MES,NHS残留的HPLC检测方法，样品无需特殊处理，操作方法简单易行，准确度高，NHS和MES在20μg/mL~60μg/mL范围内有较为良好的线性范围，能够满足实际检测中的需要，这两种物质的检测能够达到微克级。
附图说明
图1：流动相比例为97:3样品色谱图；
图2：NHS标准曲线；
图3：MES标准曲线；
图4：标准曲线空白-纯化水；
图5：1#样品色谱图；
图6：2#样品色谱图；
图7：3#样品色谱图；
图8：4#样品色谱图；
图9：5#样品色谱图。
具体实施方式
1.设备信息
色谱仪：岛津高效液相色谱仪LC-20AB；
色谱柱：ZORBAX.SB-C184.6mm*250mm*5μm；
进样量：10μL。
2.高效液相色谱法对MES和NHS检测方法考察
2.1MES和NHS试验液的配制
MES试验液（300μg/mL）：精密称取样品30.09mg，用纯化水溶解，定容至100mL。
NHS试验液（300μg/mL）：精密称取样品30.07mg，用纯化水溶解，定容至100mL。
2.2检测波长的确定
分别取MES和NHS的试验液在紫外可见分光光度计上进行全波长扫描。结果表明，NHS从300nm开始出现吸收，至200nm处达到最大，MES自220nm处出现吸收，200nm处达到最大，因为流动相的有机相在200nm处存在边缘吸收，因此最终选择210nm作为HPLC的检测波长。
2.3流动相的选择
在流动相中，有机相和水相，缓冲物质以及pH对于样品的分离都存在影响。
2.3.1有机相选择
水相为磷酸盐缓冲液，分别采用甲醇和乙腈进行分离，结果见表1。
表1：甲醇和乙腈对比
| 有机相 | MES保留时间（min） | NHS保留时间 |
| 甲醇 | 2.956 | 4.018 |
| 乙腈 | 2.813 | 3.962 |
通过数据可以看出，两种有机相均可作为NHS和MES分离检测。甲醇作为有机相MES和NHS保留时间间隔较长，更利于二者分离，因此甲醇更优，本实施例后续试验选择甲醇作为有机相。
2.3.2水相的pH选择
分析两种物质的结构发现，两种物质在碱性溶液中会出现离子化，使得其水溶性更大进而极大地降低其保留时间，不利于两种物质之间的分离检测。用碱性的碳酸钠流动相进行试验发现，两种物质的分离度R=0.566，因此考虑采用酸性水相，按照表2进行筛选，有机相为甲醇。配制好的NHS和MES母液混合进样，各进样5针比较。按照表2进行流动相组别的配制。
表2：水相pH梯度配制
| 流动相组别 | 流动相pH | 配制方法（磷酸盐缓冲液） |
| 1 | 6.5 | 称取磷酸二氢钾2.8g，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液152mL，再稀释至1000mL，微孔滤膜过滤超声待用 |
| 2 | 5.8 | 取磷酸二氢钾8.34g，和磷酸氢二钾0.87g，定容至1000mL，微孔滤膜过滤超声待用 |
| 3 | 5.0 | 取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量，用氢氧化钠试液调节至pH=5.0，微孔滤膜过滤超声待用 |
试验结果见表3：
表3：三种水相检测结果对比
以上可以看出没在水相pH为6.5时分离度较为优良。且MES在流动相pH小于等于5.8的时候不出峰。
2.3.3水相和有机相比例选择
水相为：pH=6.5的磷酸盐缓冲液，有机相为：甲醇。将二者按照表4进行一定比例混合，取NHS和MES的试验液各进样5针进行检测，计算RSD值。
表4：水相和有机相比例选择
表4-1：峰表
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 高度 |
| 1 | 2.952 | 1573010 | 252662 |
| 2 | 4.010 | 118625 | 19121 |
| 总计 | 1691635 | 271783 |
注：检测器A210nm。
通过筛选可以看出，因为两种物质都及易溶于水而容易从柱子中冲出来，导致保留时间不够而分离度较低，所以小比例的有机相作为首选，通过实验发现，水相：有机相=97:3的比例较为可靠。同时因为高效液相色谱仪的泵头计量的因素，在水相和有机相比例悬殊过大时可能会导致计量的不准确，所以将水相和有机相按照97:3的比例进行混合后采用单通道分析。
2.4NHS，MES样品重复性试验
分别取NHS和MES的试验液按照筛选好的色谱条件各进样5针，进行重复性试验考察。结果见表5。
表5：NHS，MES重复性试验结果
2.5标准曲线
分别精密称定NHS100.77mg和MES100.78mg，分别用纯化水进行溶解，定容至100mL作为母液。再按照表6所示进行标准曲线梯度配制。
表6：标准曲线梯度配制
将配制好的梯度溶液进行检测，结果见表7。
表7：标准曲线
通过标准曲线结果可以看出，NHS和MES在20μg/mL~60μg/mL范围内有较为良好的线性范围，能够满足实际检测中的需要，这两种物质的检测能够达到微克级。
Claims (9)
1.一种2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，采用反相C18硅胶键合色谱柱，流动相由pH值为6.5~6.8的磷酸盐缓冲液和有机溶剂组成，检测波长205~210nm；所述有机溶剂为甲醇或乙腈；磷酸盐缓冲液与有机溶剂的体积比为95:5~98:2。
2.根据权利要求1所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液与有机溶剂的体积比为97:3。
3.根据权利要求2所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇。
4.根据权利要求1所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的pH值为6.5。
5.根据权利要求1所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，检测波长为210nm。
6.根据权利要求1所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，流动相流速为1.0mL/min。
7.根据权利要求1所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，所述色谱柱内径4.6mm，柱长250mm，填料粒径5μm。
8.根据权利要求1所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，进样量为10μL。
9.根据权利要求1所述的2-吗啉乙磺酸,N-羟基丁二酰亚胺残留的HPLC检测方法，其特征在于，还包括配制2-吗啉乙磺酸的标准品溶液和N-羟基丁二酰亚胺的标准品溶液，分别注入色谱仪，记录色谱图，绘制2-吗啉乙磺酸的标准曲线和N-羟基丁二酰亚胺的标准曲线；供试样品按照与标准品溶液相同的条件进行HPLC检测，根据标准曲线确定供试样中2-吗啉乙磺酸和N-羟基丁二酰亚胺的含量。
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- 2014-12-30 CN CN201410839225.6A patent/CN104407077B/zh active Active
Patent Citations (2)
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