CN109975440A - 一种nhs残留的检测方法 - Google Patents

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颜莎
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Abstract

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种NHS残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱优选亲水性液相色谱(HILIC)。本发明通过添加剂及其浓度、流动相pH、溶剂、柱温、洗脱方式等多个条件的筛选与优化，最终得到了较好的分离效果。本发明的NHS液相检测方法，不同于一般的反相分离模式，样品无需进行柱前特殊处理，操作简单快捷，准确度高，灵敏度高，能够满足药物质量控制需求。

Description

一种NHS残留的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种NHS残留的检测方法，更具体的是一种NHS残留的液相色谱检测方法。
背景技术
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是一种重要的有机合成中间体，在医药生产领域中应用广泛，同时也可以用于合成丁胺卡那霉素、放射性药物的标记、制造生物医学材料。NHS也是一种生物相容性较好的新型交联剂，可用作胶原、明胶等三维网状结构的生成，其交联效率高，交联较为稳定，毒性低，近年来越来越受到关注。
交联工艺完成后，交联剂本身的残留定量检测是个亟待解决的问题，但目前NHS残留含量的检测方法并不成熟，如本发明前期尝试了反相色谱法和体积排阻色谱法，发现均不能满足检测需求，故急需寻找到一种高效、精准的NHS残留检测方法。
发明内容
本发明目的在于填补现有技术空白，提供一种新的准确、快速、可靠和高灵敏度的NHS残留的液相检测方法。
本发明首先提供了一种NHS残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱优选亲水性液相色谱(HILIC)。
优选的，所述液相色谱检测方法以键合了酰胺基团的亚已基桥杂化颗粒(BEH)为固定相。
优选的，所述液相色谱检测方法中流动相由pH值为9.0的10mM乙酸铵溶液和乙腈组成。
优选的，所述液相色谱检测方法中检测波长为265nm。
优选的，所述液相色谱检测方法中流速为0.2ml/min。
优选的，所述液相色谱检测方法中柱温为30℃。
优选的，所述液相色谱检测方法中洗脱方式为等度洗脱。
优选的，所述液相色谱检测方法检测时，配制NHS的标准品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，绘制NHS的标准曲线；供试品按照相同的检测条件进行检测，根据标准曲线计算供试品中NHS的含量。
本发明的NHS液相检测方法，不同于以往的反相分离模式，样品无需进行柱前特殊处理，操作简单快捷，准确度高，灵敏度高，能够满足日常检测需求。
附图说明
图1反相色谱法NHS的出峰情况；
图2不同乙腈含量下NHS的出峰情况；
图3体积排阻色谱法NHS的出峰情况；
图4不同流动相下NHS的出峰情况；
图5不同溶剂条件下NHS的出峰情况；
图6不同pH条件下NHS的出峰情况；
图7全波长扫描；
图8不同乙酸铵浓度下NHS的出峰情况；
图9不同柱温下NHS的出峰情况；
图10不同洗脱方式下NHS的出峰情况，其中a为梯度洗脱色谱图；b为等度洗脱色谱图；
图11不同浓度NHS液相检测图谱中峰面积和对应浓度的标准曲线。
具体实施方式
实施例1比较实施例
NHS的检测方法较少，而发明人也尝试了多种检测方法，均未能取得理想的效果，其中以反相色谱法和体积排阻色谱法为例做如下说明：
1.1反相色谱法检测NHS
仪器：品牌型号：Waters AcquityUPLC H class；bioQuaternary solventManager；BioSample Manager-FTN；PDA Detector；Empower 3.0数据处理软件
色谱柱：Waters BEHC18，1.7μm，2.1×50mm
流动相：20mMpH6.5磷酸缓冲液：乙腈＝95:5(V/V)
流速：0.2mL/min，检测波长210nm，进样量10μL，样品池温度10℃，色谱柱温25±5℃。结果如图1所示，从图中可以看出NHS较早的洗脱至柱外，在色谱柱上无保留。
故对流动相进行调整，降低有机相的比例，结果如图2所示，发现即使调整了流动相中有机相的比例，NHS仍难以在色谱柱上有所保留。
1.2体积排阻色谱法检测NHS
仪器：品牌型号：Waters AcquityUPLC H class；bioQuaternary solventManager；BioSample Manager-FTN；PDA Detector；Empower 3.0数据处理软件
色谱柱：ACQUITYUPLCBEH125SEC1.7μm，4.6mm*300mm
流动相：含10％含异丙醇(V/V)的20mMpH7.5磷酸盐缓冲液
流速：0.2mL/min，检测波长265nm，进样量10μL，样品池温度10℃，色谱柱温25±5℃。结果如图3所示：在该条件下，NHS峰形较差，不利于后续的含量的测定。
2.在尝试了多种检测方法和不同条件摸索，均未得到理想的分离效果后，发明人偶然间尝试了亲水作用色谱(HILIC)，却取得了理想的检测效果。通过实验，对比反相(RP)和亲水作用色谱(HILIC)两种不同分离模式对NHS的保留时间的影响，结果见表1(流速等条件参见上述反相色谱法)：
表1不同分离模式对NHS保留时间的影响
RP分离中无保留的NHS在HILIC分离模式下，保留时间明显增加，为NHS含量的检测提供一个新的思路。故继续针对HILIC的分离，对其色谱条件进行筛选和优化，以得到更优的峰形。
2.1流动相添加剂的选择
比较了三种流动相条件(①A:含0.1％TFA的水溶液，B：含0.1％TFA的乙腈溶液；②A:水，B：乙腈；③A:含10mM pH9.0的乙酸铵水溶液；B：含10mM pH9.0的乙酸铵乙腈溶液)，并按以下梯度洗脱，出峰情况见图4，
时间(min) 流速(ml/min) ％A ％B
0 0.2 5 95
5 0.2 5 95
20 0.2 50 50
20.01 0.2 5 95
25 0.2 5 95
从上述实验结果可以发现，当流动相中添加乙酸铵时，即流动相为A:含10mMpH9.0的乙酸铵水溶液；B：含10mM pH9.0的乙酸铵乙腈溶液时；样品在色谱柱上的保留增强，分离效果更佳。
2.2样品溶剂的选择
根据上述优化的流动相条件，考察不同溶剂条件下NHS的出峰情况如图5所示，从图中可见NHS用水稀释溶解时，由于水的极性较强，峰形扭曲，而改用有机相(含10mM pH9.0的乙酸铵乙腈溶液)作为溶剂时，峰形明显改善。
2.3流动相pH的选择
根据上述优化的流动相条件下，考察不同pH对出峰的影响。如图6所示，pH为9.0时，峰形和分离度相对更好。
2.4检测全波长的确定
根据上述优化的流动相条件下，对NHS样品进行全波长扫描，结果如图7及图5所示，结果表明，15.366min处为溶剂峰，9.058min处为NHS的出峰，故确定265nm为NHS的最大吸收波长，检测波长更改为265nm。
2.5添加剂浓度的选择
根据上述优化的流动相条件下，考察不同乙酸铵浓度对出峰的影响。从图8可以看出，添加剂乙酸铵浓度过低或过高不仅会引起保留时间的变化，同时也导致峰形变差，乙酸铵浓度为10mM时峰形较好。
2.6柱温的选择
根据上述优化的流动相条件下，考察不同柱温对出峰的影响。从图9可以看出，提高柱温，保留时间不断前移，也会导致主峰变歪，同时考虑较高的柱温会影响色谱柱的使用寿命，故而选择30℃的柱温。
2.7洗脱方式的选择
根据上述优化的流动相条件下，比较了以下两种洗脱方式对保留时间的影响：
(1)梯度洗脱：A:含10mM pH9.0的乙酸铵水溶液；B:含10mM pH9.0的乙酸铵乙腈溶液
时间(min) 流速(ml/min) ％A ％B
0 0.2 5 95
5 0.2 5 95
20 0.2 50 50
20.01 0.2 5 95
25 0.2 5 95
(2)等度洗脱：含pH9.010mM乙酸铵的95％的乙腈溶液
将100mMNHS标准品溶液用流动相稀释至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM的梯度标准品溶液进样，结果如下：
如图10所示，梯度洗脱时，随着进样次数，保留时间不断前移，出峰不稳定；等度洗脱时，保留时间更为稳定。
根据上述方法优化的过程，最终确定NHS残留的液相检测方法，具体如下：采用Waters Glycan BEH Amide(1.7μm，2.1×150mm)为色谱柱，以含pH9.010mM乙酸铵的95％的乙腈溶液为流动相，上样量为10μl，检测波长为265nm，流速为0.2ml/min，柱温为30℃，采集时间为20min。
实施例2方法验证
1.相关溶液的配制
1.1流动相的配制
pH9.0200mM乙酸铵备用缓冲液：称取15.4g的乙酸铵加入适量的去离子水溶解后，加入约8ml的氨水，用pH计调节至9.0后，再加水定容至1L。
含pH9.010mM乙酸铵的95％的乙腈溶液：在950ml乙腈溶液中加入50ml200mM的乙酸铵备用缓冲液，混匀并超声脱气10min，待用。
1.2NHS标准品的配制
称取115.09mgNHS溶解于10ml流动相，制得100mM的NHS标准品溶液，再用流动相稀释至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM的梯度标准品溶液。
2.仪器及参数
2.1UPLC(含紫外检测器)
品牌：Waters，型号：H-Class；
2.2色谱柱
品牌：Waters，型号：Glycan BEH Amide，1.7μm，2.1×150mm；
2.3色谱条件
以含pH9.010mM乙酸铵的95％的乙腈溶液为流动相，上样量为10μl，流速为0.2ml/min，检测波长为265nm，柱温为30℃，采集时间为20min。
3.方法验证
3.1标准曲线
将上述制备的0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM的梯度标准品溶液，依次注入液相色谱检测，结果如下表，峰面积和浓度的标准曲线为：y＝2,384,958.2466x-9,489.4274，R2为0.9999。
表2梯度标准品溶液的液相分离相关参数结果
通过标准曲线结果，如图11，可以看出，NHS在0.1mM-1.0mM范围内线性较好，且可以满足日常NHS残留的检测。
3.2重复性
平行制备6份0.5mMNHS标准品溶液进样检测，结果如下，保留时间和峰面积的RSD值分别为0.18％和0.54％，均小于2％。
表3重复性考察结果
样品 保留时间 面积
1 10.415 1095502
2 10.416 1087752
3 10.438 1082718
4 10.441 1080797
5 10.45 1080232
6 10.463 1088661
mean 10.437167 1085943.7
std 0.0189041 5857.1656
RSD 0.18 0.54
3.3准确度
由于供试品中未检测到NHS，故在供试品中添加一定量的NHS标准品溶液，制成低中高(0.1、0.4、0.8mM)三个浓度的样品，每个浓度平行3个样品。结果如下，平均回收率为100.79％，在90-110％的要求范围内，RSD为1.53％，小于2％，符合要求。
表4准确度考察结果

Claims (7)

1.一种NHS残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱为亲水性液相色谱。
2.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法以键合了酰胺基团的亚已基桥杂化颗粒为固定相。
3.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法中流动相由pH值为9.0的10mM乙酸铵溶液和乙腈组成。
4.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法中检测波长为265nm。
5.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法中流速为0.2ml/min。
6.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法中柱温为30℃。
7.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法中洗脱方式为等度洗脱。
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