CN109387588B

CN109387588B - 水溶性紫外吸收剂的分离方法及其应用

Info

Publication number: CN109387588B
Application number: CN201710680941.8A
Authority: CN
Inventors: 龚怡; 贡辉
Original assignee: Jala Group Co
Current assignee: Shanghai Natural Hall Group Co ltd
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: CN109387588A

Abstract

本发明公开了一种水溶性紫外吸收剂的分离方法及其应用。本发明提供的水溶性紫外吸收剂分离方法，流动相组成简单、操作简便、峰形对称无拖尾或前伸、检测精密度与准确度高，可用于含量测定；还可用于PBS和DPDT的混合物的分离及其含量测定。该检测方法优于现有的《化妆品安全技术规范》中的检测方法。

Description

水溶性紫外吸收剂的分离方法及其应用

技术领域

本发明涉及水溶性紫外吸收剂的分离方法及其应用。

背景技术

苯基苯并咪唑磺酸(Phenylbenzimidazole Sulfonic，PBS)是防晒产品中常用的水溶性紫外吸收剂，苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠(Disodium phenyldibenzimidazoletetrasulfonate，DPDT)是一种较新型水溶性紫外吸收剂，在澳大利亚、日本等国被允许使用于化妆品，在国内逐渐受到关注。2015年版《化妆品安全技术规范》规定这两种防晒剂在化妆品使用中的最大允许浓度分别为8％和10％(以酸计)。防晒剂含量控制是防晒产品的重要品质保证，含量过低影响防晒效果，加入量过高则有违反相关法规的风险。因此，开发两种成分的定量检测方法对产品质控非常关键。

2015年版《化妆品安全技术规范》使用HPLC方法检测PBS，流动相复杂，用到了四氢呋喃和高氯酸，实际操作费时费力，四氢呋喃对色谱仪器部件有腐蚀性，高氯酸属于易爆试剂，腐蚀性极强。使用2015版方法PBS保留时间2.2min，与溶剂峰重合，不可避免影响到该物质的准确定量。《化妆品安全技术规范》没有DPDT的检测方法，经过调查，国内知网、万方数据库没有对该物质的检测方法报道。外文文献仅查到有限的几篇文章，A.Balaguer等人开发了DPDT的HPLC检测方法，可同时检测PBS，检测端使用了荧光检测器和二极管列阵检测器。流动相为35:65(v/v)乙醇:乙酸铵溶液(pH＝4，含有50mmol/L四丁基氟化铵)。此方法具有线性良好(PBS:R²＝0.99997；DPDT:R²＝0.99995)，检测限低(PBS:0.016ug/mL；DPDT:0.044ug/mL)等优点。但是，流动相用到的各类盐试剂种类多，配制较繁琐。另外，该方法也存在保留时间早，难以和溶剂峰分离的问题，而且两种分子色谱峰形不对称，有明显拖尾，以至于峰面积的积分重现性不理想(RSD＝5.8％)。

由此可见，目前化妆品行业中对水溶性紫外吸收剂的定量方法较少，对于同时将DPDT和PBS进行定量的检测方法研究更少。已建立的方法仍有不足之处，如流动相组成复杂，配制操作繁琐，色谱峰对称性差，检测精密度不高等问题。因此，如何开发一种能够更好地对水溶性紫外吸收剂的定量方法，既有利于企业对内部产品的质控，也可用来加强政府部门对市场的监控，是本领域的研发难点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为了克服现有技术中水溶性紫外吸收剂的含量检测方法中流动相组成复杂、配制操作繁琐、色谱峰对称性差、或检测精密度不高等缺陷，而提供了一种水溶性紫外吸收剂的分离方法及其应用。本发明提供的水溶性紫外吸收剂分离方法，流动相组成简单、操作简便、峰形对称无拖尾或前伸、检测精密度与准确度高，可用于含量测定；还可用于PBS和DPDT的混合物的分离及其含量测定。该检测方法优于现有的《化妆品安全技术规范》中的检测方法。

在PBS和DPDT的分离中，对DPDT的分离方法的开发尤为困难。基于现有技术中采用偏酸性的流动相体系进行分离的情况，发明人曾尝试对其进行改进，进而调整峰形用于定量。例如，发明人曾经尝试pH＝2.1酸性流动相体系，发现DPDT峰形裂分，推测DPDT的pKa有关。若想将DPDT完全转化为酸式结构需要更低pH值，但是更低的pH值会降低C18色谱柱寿命，所以认为酸性流动相不适用。经过不断努力，最终，本申请的发明人通过实验选择了适当的流动相体系和色谱柱，使DPDT转化为盐的结构，最终实现了DPDT的良好分离，并可用于定量测定。

本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术难题的。

本发明提供了一种水溶性紫外吸收剂的分离方法，其包含下列步骤：采用高效液相色谱法对水溶性紫外吸收剂进行分离；所述高效液相色谱法中色谱中为C18色谱柱或者CR色谱柱，流动相为有机溶剂和pH值为6.5～7.5的缓冲溶液，所述水溶性紫外吸收剂为PBS和/或DPDT。

本发明中，所述的分离方法中，所述水溶性紫外吸收剂可单独存在进行分离，也可存在于化妆品产品或原料中进行分离。

所述pH值为6.5～7.5的缓冲溶液可为pH值为6.8的缓冲溶液，例如pH值为6.8的乙酸铵水溶液和/或乙酸钠的水溶液；再例如pH值为6.8的10mmol/L的乙酸铵水溶液。

所述有机溶剂可为反相HPLC色谱法中的常用有机溶剂，例如选自乙腈、甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或多种，再例如甲醇和/或乙腈。

本发明中，所述C18色谱柱一般是键合十八烷基的色谱柱，例如Athena C18 WP色谱柱；

所述CR色谱柱一般是指填料为强阳离子交换与反相C18混合填料的色谱柱，例如C18与磺酸基按1:4-1:50混合的填料的色谱柱，再例如Capcell Pak CR 1:4色谱柱。

本发明中，所述C18色谱柱或者所述CR色谱柱均可选择以下规格：所述色谱柱的填料颗粒粒径可为2.7μm～5μm；例如3μm～5μm；所述色谱柱的长度可为15mm～250mm；所述色谱柱的进样体积可为1～50μL，例如5～20μL。

本发明中，所述高效液相色谱法中的柱温可为本领域该类操作的常规温度，例如20～40℃，再例如30℃。

本发明中，所述分离方法中的所述高效液相色谱法可采用等度洗脱，所述等度洗脱中，所述流动相中的有机溶剂和pH值为6.5～7.5的缓冲溶液的体积比可为5:95～3:97；或者，采用梯度洗脱，所述梯度洗脱中，所述流动相为有机溶剂和pH值为6.5～7.5的缓冲溶液，所述流动相体积比例随时间的变化范围可如表1所示：

表1

；所述流动相体积比例随时间的变化范围还可如表2所示：

表2

本发明中，所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪可采用本领域的常规高效液相色谱仪，例如安捷伦1260高效液相色谱仪。

本发明中，所述的流动相的流速可参考领域的常规操作，例如0.5～1.5mL/min，再例如0.8～1.0mL/min。

本发明中，所述分离时所述水溶性紫外吸收剂一般以溶液形式存在；

所述溶液中的溶剂选自四氢呋喃、NaOH水溶液和10mmol/L的乙酸铵水溶液中的一种或多种；当所述水溶性紫外吸收剂存在于化妆品产品或原料中时，所述溶剂优选采用体积含量小于20％的四氢呋喃水溶液，进一步优选体积含量为10％的四氢呋喃水溶液。

本发明还提供了一种所述水溶性紫外吸收剂的分析检测方法，其包含以下步骤：采用高效液相色谱法对水溶性紫外吸收剂进行分离；所述高效液相色谱法中色谱柱为C18色谱柱或者CR色谱柱，流动相为有机溶剂和pH值为6.5～7.5的缓冲溶液，所述水溶性紫外吸收剂为PBS和/或DPDT；所述分离时将所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪与检测器联用，所述检测器可为紫外检测器、紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器。

所述分离时的操作与方法如前所述。

所述检测器为紫外检测器、紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器时，检测波长可为300nm～400nm，例如304nm～344nm。

本发明还提供了一种所述分析检测方法在所述水溶性紫外吸收剂含量测定中的应用，所述水溶性紫外吸收剂为PBS和/或DPDT。

所述水溶性紫外吸收剂含量测定的方法可参考本领域常规的含量测试方法，例如：

步骤(1)、分别配置一定浓度的所述水溶性紫外吸收剂标准品溶液和待测品溶液，采用上述分析检测方法对所述标准品溶液和待测品溶液进行分析检测；测得所述标准品溶液和所述待测品溶液中各组分的峰面积；

步骤(2)、根据所述标准品溶液中各组分的峰面积和相应的组分浓度，得到回归方程；

步骤(3)、所述待测品溶液中水溶性紫外吸收剂的含量由步骤(1)中测得的各组分的峰面积的代入步骤(2)中得到的回归方程，即可。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的分析检测方法，流动相组成简单，操作简便，保留时间适中，形对称无拖尾或前伸，检测精密度高，还可对PBS和DPDT进行良好分离，可用于定量检测。该检测方法优于现有的《化妆品安全技术规范》中的检测方法。

附图说明

图1为实施例1中标准品分析检测DPDT和PBS时的HPLC谱图；

图2为采用实施例1的方法制作DPDT系列标样线性回归方程的谱图；

图3为采用实施例1的方法时的DPDT的紫外吸收图谱；

图4为采用实施例1的方法制作PBS系列标样线性回归方程的谱图；

图5为采用实施例1的方法时的PBS的紫外吸收图谱；

图6为实施例2中检测分析DPDT时的HPLC谱图；

图7为实施例3中检测分析DPDT时的HPLC谱图；

图8为实施例4中检测分析DPDT时的HPLC谱图；

图9为对比实施例1中流动相为甲醇：0.1％磷酸水溶液(v/v)＝40:60时的DPDT的HPLC谱图；

图10为对比实施例2中流动相为甲醇：0.1％磷酸水溶液(v/v)＝30:70时的DPDT的HPLC谱图；

图11为对比实施例3中流动相为甲醇：0.1％磷酸水溶液(v/v)＝20:80时的DPDT的HPLC谱图；

图12为对比实施例4中流动相为甲醇：0.1％磷酸水溶液(v/v)＝10:90时的DPDT的HPLC谱图；

图13为对比实施例5中流动相为乙腈：10mmol/L乙酸铵:水溶液(v/v)＝10:90，进样量为5μL时的DPDT的HPLC谱图；

图14为对比实施例5中流动相为乙腈：10mmol/L乙酸铵水溶液(v/v)＝10:90，进样量为20μL时的DPDT的HPLC谱图；

图15为对比实施例6中流动相为乙腈：10mmol/L乙酸铵水溶液(v/v)＝10:90，溶解标准品的溶剂为10mmol/L乙酸铵水溶液，进样量为5μL时的HPLC谱图；

图16为对比实施例6中流动相为乙腈：10mmol/L乙酸铵水溶液(v/v)＝10:90，溶解标准品的溶剂为10mmol/L乙酸铵水溶液，进样量为20μL时的HPLC谱图；

图17为对比实施例7中酸性条件下的PBS的紫外吸收图谱；

图18为对比实施例8中将0.5g防晒产品用THF：H₂O＝20：80(v/v)进行溶解的HPLC图谱；

图19对比实施例9中改变梯度洗脱程序时，PBS进行分析检测时的HPLC谱图；

图20为效果实施例1中市售化妆品中DPDT和PBS分析检测时的HPLC谱图；

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施方式中，

仪器和试剂

仪器：美国Agilent公司的安捷伦1260高效液相色谱仪，配有在线脱气机、二元泵、柱温箱、二极管阵列检测器；

分析天平(精确至0.1mg)：Mettler Toledo公司

超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司

容量瓶10mL，20mL，25mL，50mL，100mL

试剂：

实施例1

1)、标准溶液的配制

0.5mol/L氢氧化钠水溶液：称取2g氢氧化钠，用水溶解并定容至100mL。

标准溶液配制：精确称量苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠约700mg和苯基苯并咪唑磺酸约300mg于100mL容量瓶中，用水溶解并加入10mL氢氧化钠水溶液(0.5mol/L)助溶，稀释至刻度并摇匀作为母液备用。

2)、色谱条件

Athena C18 WP色谱柱(4.6*250mm，5μm)，进样量5μL，柱温30℃，检测波长304nm，流动相为乙腈：10mmol/L乙酸铵水溶液-梯度洗脱，流速:1mL/min。

梯度洗脱程序见表3：

表3

3)、样品处理

称取0.5g待测样品(精确至0.1mg)于100mL容量瓶中，加入10mL四氢呋喃超声至样品完全分散，用水定容至刻度并摇匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液用来色谱检测。

4)、标准曲线

分别取标准储备母液0.5，1，1，1，1mL于100，100，50，25，20mL容量瓶中，用水稀释至刻度并摇匀，对配制好的系列标准溶液进色谱检测。系列标准溶液浓度见下表4。DPDT和PBS的浓度分别为351.95mg/L和153mg/L，分离图谱见图1。图1中，保留时间为4.256min的为水溶性紫外吸收剂DPDT，保留时间为11.513min的水溶性紫外吸收剂为PBS；分离度大于1.5。该分离方法峰形好，无拖尾或前伸，且保留时间适中。

表4

根据上述检测方法，以峰面积y对质量浓度x(mg/L)进行线性回归，结果见下图2～图5。

其中，通过图2可计算得出，DPDT系列标样线性回归方程为y＝6.87x+4.14(相关系数为0.99995)；

通过图4可计算得出，PBS系列标样线性回归方程为y＝26.40x+10.07(相关系数为0.99997)；

该检测方法适合的DPDT的质量浓度范围为31.68mg/L～387.15mg/L；；适合的PBS的质量浓度范围为13.77mg/L～168.3mg/L。

DPDT和PBS在该分析方法中的紫外吸收图谱分别见图3和图5；

5)、方法检测限

上述分析方法中，按照信噪比(S/N≥10)，确定DPDT和PBS的最低检测浓度分别为0.39mg/L和0.11mg/L。

6)、回收率和精密度

取不含防晒剂的防晒类化妆品基础配方0.5g，分别加入低和高质量浓度标样，参照第3)节样品处理方法进行处理后进样检测，平行测试6份，结果见表5。

表5

表5中数据表示DPDT和PBS在化妆品配方中基质加标回收的考察，高低浓度下分别加标回收考察，DPDT的回收率在98.3％-101.5％之间；RSD值在0.3％～0.9％之间；PBS的回收率在100.2％-101.2％之间；RSD值在0.2％～0.3％之间，表明该方法的回收率和精密度均良好。

实施例2

参考实施例1，对于标准样品检测，将流动相改变为乙腈：10mmol/L乙酸铵水溶液＝5:95，采用等度洗脱DPDT的出峰情况见图6。该方法中，DPDT保留时间合适，为5.622min，而且峰形和重现性均满足测试要求。

实施例3

参考实施例2，进样量改为20μL，DPDT的保留时间合适，而且峰形和重现性均满足测试要求。见图7。

实施例4

参考实施例1，对于标准样品检测，将流动相改变为甲醇：10mM乙酸铵水溶液＝5:95，等度洗脱，色谱柱改变为ADME(Shiseido Capcell Pak CR1:4,150mm*4.6mm,5μm)，DPDT的出峰情况见图8。

该方法中，DPDT保留时间合适，而且峰形和重现性均满足测试要求。

由实施例2～4可以看出，C18色谱柱和CR色谱柱在合适的流动相下，均可用于DPDT的检测，且有机相为甲醇时相比为乙腈时，保留时间更长一些。

对比实施例1

参考实施例1的操作与方法，对于标准样品检测，采用甲醇：0.1％磷酸水(v/v)＝40:60作为流动相，分析样品为DPDT标准品(300mg/L)，溶剂为水。测试其出峰情况，见图9。

图9中，DPDT峰发生了裂分，且与溶剂峰接近。可见，采用酸时，DPDT的峰形较差，且保留时间与溶剂峰接近。

对比实施例2

参考对比实施例1，对于标准样品检测，将其流动相调整为甲醇：0.1％磷酸水(v/v)＝30:70；DPDT的出峰情况见图10。

图10中，DPDT峰发生了裂分，峰形仍然不好，且保留时间太短。对比实施例3

参考对比实施例1，对于标准样品检测，将其流动相调整为甲醇：0.1％磷酸水(v/v)＝20:80；DPDT的出峰情况见图11。

该方法中，从图11可以看出，DPDT峰发生了裂分，且保留时间太短，与溶剂峰接近。

对比实施例4

参考对比实施例1，将其流动相调整为甲醇：0.1％磷酸水(v/v)＝10:90；DPDT的出峰情况见图12。

该方法中，从图12可以看出，虽然DPDT的保留时间得到了优化(11.771min)，距离溶剂峰较远，但是峰形差，不利于定量。

从对比实施例1～4可以看出，在有机相体积比大于等于20％时，DPDT的保留时间较短，与溶剂峰分离度差，此结果与文献报道一致。随着有机相比例的下降，DPDT的保留时间逐渐延长，但存在峰形不对称、容易裂分等问题。因此，酸性流动相体系不适用于检测DPDT。

对比实施例5

参考实施例1的操作与方法，对于标准样品检测，将流动相改变为乙腈：10mmol/L乙酸铵水溶液＝10:90，DPDT的出峰情况见图13。峰形对称，但出峰太早。并且若将进样量改为20μL，图谱见图14出现裂分的现象。

由对比实施例5可以看出，当有机相体积比≥10％，虽然峰形对称，峰面积重现性好(2次重复测试峰面积分别为4277和4273)，但是由于DPDT保留时间短，靠近溶剂峰有被干扰的可能。并且进样量大时，由于流动相和溶剂匹配度差，容易造成DPDT峰的裂分的现象的产生。

对比实施例6

参考对比实施例5，若将溶解标准样品溶剂改为10mmol/L乙酸铵水溶液，DPDT的出峰情况见图15及图16；

由图15可以看出，对于标准品的检测，溶剂的种类并不会对峰形有影响，分子是否提前成盐化不是峰形对称性的根本原因。

由图16也可以看出，此种情况下若进样量大时，容易导致峰形变差。

对比实施例7

参考对比实施例1，将DPDT用PBS替换，其紫外吸收图谱见图17。与实施例1中的PBS的吸收图谱有明显差别。

对比实施例8

参考实施例1的操作与方法，将0.5g防晒产品用THF：H₂O＝20：80(v/v)进行溶解。结果参见图18。DPDT峰形明显发生分裂。

对比实施例9

参考实施例1的操作与方法，将梯度洗脱的程序按照表6中进行。

表6

从图19可以看出，该梯度洗脱条件下，PBS与流动相快速变化产生的溶剂倒峰重合，不利于定量的进行。

效果实施例1

测试样品为一款市售防晒霜，其中含有DPDT和PBS。按照实施例1中的方法进行分析检测时的HPLC色谱图如图20所示。

由图20可以看出，该防晒霜中的DPDT和PBS和化妆品中的基质分离度良好，即化妆品中的基质不影响两者的定量检测。

效果实施例2

取市面上5个防晒类化妆品(1～5#)按第四节处理后进行检测，测定结果(w/％)见下表7。其中样品编号1#为防晒凝露；2#和4#为防晒乳；3#为防晒喷雾；5#为防晒露；

表7

样品编号	DPDT	PBS
			1#	4.34	3.71
2#	-	2.10
			3#	-	1.06
4#	-	1.07
			5#	2.22	-

可见，本发明中的检测方法能够有效检测化妆品中DPDT和PBS的含量，检测效率高，应用范围广，对化妆品种类无特殊要求。两种分子检测结果与产品全成分列表一致，且符合2015年版《化妆品安全技术规范》对两种防晒剂添加量的要求。

Claims

1.一种水溶性紫外吸收剂的分离方法，其特征在于，包含下列步骤：采用高效液相色谱法对水溶性紫外吸收剂进行分离；所述高效液相色谱法中色谱柱为C18色谱柱或者CR色谱柱，流动相为有机溶剂和pH值为6.8的10mmol/L的乙酸铵水溶液，所述水溶性紫外吸收剂为苯基苯并咪唑磺酸和苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠；所述有机溶剂为甲醇或乙腈；

所述高效液相色谱法采用等度洗脱，所述等度洗脱中，所述流动相中的有机溶剂和pH值为6.8的10mmol/L的乙酸铵水溶液的体积比为5:95；

或者，所述高效液相色谱法采用梯度洗脱，所述梯度洗脱中，所述流动相体积比例随时间的变化范围如表2所示：

表2

2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Athena C18 WP色谱柱；所述CR色谱柱为Capcell Pak CR 1:4色谱柱。

3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪为安捷伦1260高效液相色谱仪。

4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中的柱温为20～40℃。

5.如权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中的柱温为30℃。

6.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的流动相的流速为0.5～1.5mL/min。

7.如权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述的流动相的流速为0.8～1.0mL/min。

8.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述C18色谱柱或者CR色谱柱的填料颗粒粒径为2.7μm～5μm。

9.如权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述C18色谱柱或者CR色谱柱的填料颗粒粒径为3μm～5μm。

10.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述色谱柱的长度为150mm～250mm。

11.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述色谱柱的进样体积为1～50μL。

12.如权利要求11所述的分离方法，其特征在于，所述色谱柱的进样体积为5～20μL。

13.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述分离时所述水溶性紫外吸收剂以溶液形式存在；

所述溶液中的溶剂选自四氢呋喃、NaOH水溶液和10mmol/L的乙酸铵水溶液中的一种或多种；

当所述水溶性紫外吸收剂存在于化妆品产品或原料中时，所述溶剂采用体积含量小于20％的四氢呋喃水溶液。

14.如权利要求13所述的分离方法，其特征在于，当所述水溶性紫外吸收剂存在于化妆品产品或原料中时，所述溶剂采用体积含量为10％的四氢呋喃水溶液。

15.一种水溶性紫外吸收剂的分析检测方法，其特征在于，包含以下步骤：采用高效液相色谱法对水溶性紫外吸收剂进行分离；所述高效液相色谱法中色谱柱为C18色谱柱或者CR色谱柱，流动相为有机溶剂和pH值为6.8的10mmol/L的乙酸铵水溶液，所述水溶性紫外吸收剂为苯基苯并咪唑磺酸和苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠；所述分离时将所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪与检测器联用，所述检测器为紫外检测器、紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器；所述分离时的操作与方法如权利要求1-14中任一项所述。

16.如权利要求15所述的分析检测方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器、紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器的检测波长为300nm～400nm。

17.如权利要求16所述的分析检测方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器、紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器的检测波长为304nm～344nm。

18.一种如权利要求15-17中任一项所述的分析检测方法在水溶性紫外吸收剂含量测定中的应用；所述水溶性紫外吸收剂为苯基苯并咪唑磺酸和苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠。