CN110988200B - 注射用重组人特立帕肽中咪唑残留的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种注射用重组人特立帕肽中咪唑残留的分析方法。该分析方法包括：采用C18色谱柱，以溶液a和溶液b的混合溶液为流动相对注射用重组人特立帕肽中的咪唑残留进行高效液相色谱分析；其中，溶液a为0.4～0.6mg/ml辛烷磺酸钠水溶液，溶液b为乙腈‑甲醇溶液，乙腈‑甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为20:80‑60:40。该分析方法能够使咪唑残留的出峰时间、峰型、分离度均良好，并通过咪唑限量检测法验证该分析方法的专属性、检测限与定量限、线性、重复性、准确性及耐用性均良好，将其应用于PTH中咪唑残留分析中有助于实现对PTH生产工艺过程和产品质量安全的控制。
Description
技术领域
本发明涉及残留物分析领域，具体而言，涉及一种注射用重组人特立帕肽中咪唑残留的分析方法。
背景技术
针对咪唑残留物的检测，现有技术有针对动物源食品(比如猪肉、猪肝等)中的硝基咪唑残留进行检测的报道。其检测原理是将动物组织样品经乙酸乙酯振荡提取、液液分配和固相萃取净化后，用液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。也有针对水产品中左旋咪唑采用液相色谱-串联质谱法进行检测的报道，其检测原理是：在碱性条件下直接用乙酸乙酯提取样品中的左旋咪唑，酸性水溶液萃取，酸性条件下用阳离子交换柱净化。还有针对保鲜剂噻苯咪唑残留的薄层色谱检测方法。
但针对生物制剂产品，如注射用重组人特立帕肽(PTH)，一种用于治疗骨质疏松症的药物，现有技术中却未见有针对此类产品的原液及原液的中间产品进行咪唑残留检测的报道，然而，对咪唑的限量进行控制以达到在生产工艺过程和产品质量安全的控制，是此类生物制剂产品开发所必不可少的质控步骤。
因此，急需提供一种针对注射用重组人特立帕肽(PTH)及其它生物制剂类产品中咪唑残留进行分析的方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种注射用重组人特立帕肽中咪唑残留的分析方法，以解决现有技术中尚无对注射用重组人特立帕肽等生物制剂类产品中的咪唑残留进行分析的问题。
为了实现上述目的，本发明提供了一种注射用重组人特立帕肽中咪唑残留的分析方法，该分析方法包括：采用C18色谱柱，以溶液a和溶液b的混合溶液为流动相对注射用重组人特立帕肽中的咪唑残留进行高效液相色谱分析；其中，溶液a为0.4～0.6mg/ml辛烷磺酸钠水溶液，溶液b为乙腈-甲醇溶液，乙腈-甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为20:80-60:40。
进一步地，注射用重组人特立帕肽的进样量为10-30μL。
进一步地，溶液a与溶液b的体积比为76：24～80:20。
进一步地，色谱柱的柱温为33～37℃。
进一步地，C18色谱柱的规格为4.6mm*250mm，5μm。
进一步地，流动相的流速为0.9～1.1ml/min。
进一步地，高效液相色谱分析是在209-211nm紫外波长下对咪唑残留进行检测。
进一步地，辛烷磺酸钠水溶液的pH值为2.35±0.05。
进一步地，采用磷酸调节辛烷磺酸钠水溶液的pH值。
应用本发明的技术方案，采用C18色谱柱，并采用无机相和有机相混合形成的混合溶液作为流动相进行高效液相色谱分析，其中，无机相采用辛烷磺酸钠水溶液，而有机相采用乙腈与甲醇按照上述体积比混合而成的混合液，这样形成的流动相在分析过程中能够使咪唑残留的出峰时间、峰型、分离度均良好，并通过咪唑限量检测法对该分析方法的专属性、检测限与定量限、线性、重复性、准确性及耐用性进行了验证，且验证结果良好。应用于PTH中咪唑残留分析中有助于实现对PTH生产工艺过程和产品质量安全的控制。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本申请一种在测试条件下的咪唑残留的高效液相色谱图；
图2示出了本申请另一种在测试条件下的咪唑残留的高效液相色谱图；
图3示出了本申请第三种在测试条件下的咪唑残留的高效液相色谱图；
图4示出了本申请第四种在测试条件下的咪唑残留的高效液相色谱图；
图5示出了本申请第五种在测试条件下的咪唑残留的高效液相色谱图；
图6至图10示出了本申请在第四种测试条件其他条件不变时，采用不同浓度的辛烷磺酸钠水溶液的咪唑残留的高效液相色谱图，其中，图6至图10中辛烷磺酸钠水溶液浓度依次为；0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml和0.7mg/ml；
图11至图13示出了本申请在第四种测试条件其他条件不变时，采用不同体积的进样量时的咪唑残留的高效液相色谱图，其中，图11至图13中进样量体积依次为；10μL、20μL和30μL；
图14至图18示出了本申请在第四种测试条件其他条件不变时，采用不同体积比的溶液a与溶液b时的咪唑残留的高效液相色谱图，其中，图14至图18中溶液a与溶液b的体积比为75:25、76:24、78:22、80:20及81:19；
图19至图23示出了本申请在第四种测试条件其他条件不变时，采用不同柱温的情况下的咪唑残留的高效液相色谱图，其中，图19至图23中柱温分别为：32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃及38℃；
图24至图27示出了本申请在第四种测试条件其他条件不变时，采用不同流速的流动相情况下的咪唑残留的高效液相色谱图，其中，图24至图27中流动相的流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min及1.3ml/min；
图28至图31示出了本申请在第四种测试条件其他条件不变时，采用不同pH的辛烷磺酸钠水溶液情况下的咪唑残留的高效液相色谱图，其中，图28至图31中辛烷磺酸钠水溶液的pH分别为：2.30、2.35、2.40及2.42；
图32示出了本申请在第四种测试条件其他条件不变时，采用醋酸调整辛烷磺酸钠水溶液pH值后的咪唑残留的高效液相色谱图；
图33示出了本申请在实施例1中的咪唑残留分析方法的专属性检测结果；
图34示出了本申请在实施例1中的咪唑残留分析方法的检测限检测结果；
图35示出了本申请在实施例1中的咪唑残留分析方法的定量限检测结果；以及
图36示出了根据本发明的优选的实施例中不同浓度的咪唑与峰面积之间的线性关系示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术中所提到的，现有技术中尚无对注射用重组人特立帕肽等生物制剂类产品中的咪唑残留进行分析的报道，为了弥补这一空白，本申请的发明人以注射用重组人特立帕肽为研究对象，深入研究和开发了针对此类生物制品中的咪唑残留的检测方法。具体如下：
产品中咪唑含量较低，且咪唑易溶于水，在210nm左右紫外波长处有较大吸收，产品主成分(PTH)为小分子蛋白质。初期尝试采用现有文献中报道的针对一些无机物成分中的咪唑残留检验方法进行检测，但是，由于小分子蛋白质成分较为复杂，未能达到较好的峰型和参数要求，实验证明这些分析方法并不适用于生物制剂类产品中咪唑的检测，后通过开发新方法来实现咪唑残留的检测。
咪唑较小分子蛋白洗脱时间短，大比例水的流动相可以缩短咪唑的洗脱时间，出峰时间较短，可以节省检验时间。柱温设置为35℃(温度太低，夏季不容易控制柱温，温度太高会加剧色谱柱填充物的流失)。因此，首先采用高效液相色谱法C18色谱(150mm)柱，波长210nm，水相为大比例的流动相(水-乙腈90:10)，常规流速1.0ml/min，进行初步方法摸索。经测试发现，如图1所示，咪唑峰的峰型较宽且不对称，不能达到使用要求。
为改善峰型，将水相换为0.05mol/L的磷酸二氢钾缓冲液，相同条件进行测试，如图2所示，发现峰型有所改善，但是拖尾较严重，仍不能达到使用要求。为了改善拖尾情况，进一步选用离子对试剂0.5mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液替代水相，相同条件进行测试，发现峰型拖尾因子依然达不到要求，但较前几种情况有很大改善。
为进一步改善出峰时间和峰型，将离子对试剂改用0.5mg/ml的辛烷基磺酸钠水溶液，使用250mm长色谱柱，调整流动相比例为水相：有机相为78:22，然后在相同条件下进行测试，如图3所示，发现出峰时间为9.1min且峰型有较大改善。
为使咪唑残留物的分离效果更好，又针对蛋白质与咪唑的差异进行了无机相流动相pH的完善和有机相组成成分及比例的完善，确定将pH调至2.35左右，采用(C18，4.6mm*250mm，5μm)规格色谱柱，有机相调整为甲醇与乙腈的混合物78:22进行测试，如图4所示，发现出峰时间、峰型、分离度均良好，然后进行了空白干扰试验，发现空白样品对主峰检测无影响。初步确定采用该检测方法的参数，并通过验证工作证明了该检测分析方法的可行性和可靠性。
采用流动相pH2.35左右，C18，4.6mm*150mm，5μm规格色谱柱，有机相调整为甲醇与乙腈的混合物78:22进行测试，如图5所示，发现出峰时间较早，分离度不能满足要求，即确定C18，4.6mm*150mm，5μm规格色谱柱不适用于该方法的检测。
在上述研究成果的基础上，申请人提出了本申请的技术方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种注射用重组人特立帕肽中咪唑残留的分析方法，该分析方法包括：采用C18色谱柱，以溶液a和溶液b的混合溶液为流动相对注射用重组人特立帕肽中的咪唑残留进行高效液相色谱分析；其中，溶液a为0.4-0.6mg/ml辛烷磺酸钠水溶液，溶液b为乙腈-甲醇溶液，乙腈-甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为20:80-60:40。
本申请的上述分析方法，申请人针对注射用重组人特立帕肽等生物制剂产品中的咪唑残留，根据咪唑小分子与蛋白大分子的结构及物化特性，设计和优化了高效液相色谱分析的各种条件，通过不同的色谱柱、流动相、检测波长、流速、柱温进行大量的条件摸索，发现通过采用C18色谱柱，并采用无机相和有机相混合形成的混合溶液作为流动相进行高效液相色谱分析，其中，无机相采用辛烷磺酸钠水溶液，而有机相采用乙腈与甲醇按照上述体积比混合而成的混合液，这样形成的流动相在分析过程中能够使咪唑残留的出峰时间、峰型、分离度均良好，并通过咪唑限量检测法对该分析方法的专属性、重复性、准确性及耐用性进行了验证，且验证结果良好。该方法对于注射用重组人特立帕肽(PTH)原液及其中间产品中咪唑含量及其限度控制提供更精准的数据，对质量控制乃至安全健康都具有重要的意义。
上述溶液a的浓度在0.4-0.6mg/ml，更优选为0.5mg/ml。乙腈-甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为20:80-60:40，更优选为40:60。
发明人在试验了0.3～0.7mg/ml的辛烷磺酸钠水溶液作为无机相，乙腈-甲醇体积比为40：60，无机相与有机相按照78:22的比例，采用C18，4.6mm*250mm，5μm规格色谱柱对咪唑残留进行高效液相色谱分析，进样量为20μL时，所检测到的色谱图，按照辛烷磺酸钠水溶液的浓度由低到高分别如图6至图10所示，从图6和图10中可以看出，0.3mg/ml和0.7mg/ml的辛烷磺酸钠水溶液作为无机相时，理论塔板数分别只有1500和1800左右，理论塔板数不高，无法保证检测方法的准确性(理论塔板数可以直接从图谱参数上看出来，一般要求理论塔板数不低于3000，不然峰面积计算不准确，使结果不准确)。
本申请的上述分析方法，所适用于检测的生物制剂产品包括但不仅限于注射用重组人特立帕肽，任何具有与PTH类似的生物制剂产品及其中间产品也可以采用本申请的方法或者在此基础上改进得到的分析方法。应用于PTH中咪唑残留的分析，有助于实现对PTH生产工艺过程和产品质量安全的控制。
上述注射用重组人特立帕肽的进样可以根据实际检测需要进行合理设置，在本申请中优选为10-30μL，优选为20μL。液相色谱进样量低于10μL，响应值太低，高于30μL，峰型较宽，不利于小杂质的分离。
采用0.5mg/ml的辛烷磺酸钠水溶液作为无机相，乙腈-甲醇体积比为40：60，无机相与有机相按照78:22的比例，采用C18，4.6mm*250mm，5μm规格色谱柱，进样量分别为10μL、20μL和30μL时，对咪唑残留进行高效液相色谱分析的图谱分别如图11、图12和图13所示。在该范围内均能实现对咪唑残留的有效分离。
在其他条件不变的情况下，控制溶液a与溶液b的体积比为75:25、76:24、78:22、80:20及81:19的情况下，对咪唑残留的分离效果分别如图14至图18所示，当体积比为75:25或81:19时，存在峰型对称性相对较差，且拖尾相对严重的现象。因此，上述流动相中的溶液a与溶液b的体积比优选为76:24～80:20。该体积比可以在上述优选比例范围内时。对PTH中咪唑残留的分离效果最好。
进一步地，在其他条件不变，仅改变柱温的情况下，对咪唑残留的分离效果分别如图19至图23所示，图19(32℃)与图23(38℃)明显比图20(33℃)至图22(37℃)范围柱温谱图拖尾严重，导致仪器积分不准确，使检测结果准确度不高。而图20(33℃)至图22(37℃)范围柱温谱图对称性良好，几乎无拖尾现象，峰型较为完美。因此，上述分析方法中，通过比较检测可知柱温为33～37℃范围内时，对咪唑残留的分离和检测效果最好。
上述分析方法中，如前述，发明人对色谱柱的长度也进行了优化选择，发现色谱柱的柱长为250mm时，柱长相对更长，能够使咪唑残留的峰型更好，能够有效分离无关杂质。250mm长的C18色谱柱的规格为4.6mm*250mm，5μm。常规色谱柱长度多为150mm与250mm，本申请通过实验比较发现150mm规格分离度不能达到要求(如图5所示)，而250mm的分离度效果好(如图4所示)。
为了进一步提高检测的稳定性，对流动相的流速进行了优化选择，如图24至图27，分别示出了流动相的流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min及1.3ml/min情况下的色谱图。由图24(0.8ml/min)至图26(1.2ml/min)可知，在0.8-1.2ml/min流速范围，峰型对称性良好，几乎无拖尾现象，且分离度良好。由图27(1.3ml/min)可知，在1.3ml/min流速条件下，咪唑峰与杂质峰无法有效分离，使检测结果不准确。因此，在一种优选的实施例中，控制流动相的流速在0.9～1.1ml/min范围内，该检测方法的检测结果稳定性好。
在一种优选的实施例中，高效液相色谱分析是在209-211nm的紫外波长下对咪唑残留进行检测。其他波长下检测的色谱图虽然看似较好，但是因不是咪唑的最大吸收波长，导致检测准确度较低。
辛烷磺酸钠水溶液的pH对咪唑残留分离的影响见图28至图31(按pH值由低到高依次示出)，可见，pH值为2.30、2.35、2.40时，咪唑色谱峰对称性良好，几乎无拖尾现象，分离度较高，而pH值为2.42时，咪唑峰与杂质峰无法有效分离，使检测结果不准确。上述辛烷磺酸钠水溶液的pH值可以根据需要进行合理调整，在一种优选的实施例中，辛烷磺酸钠水溶液的pH值为2.35±0.05。pH高于2.40时，咪唑峰与杂质峰分离度不能满足要求(从谱图可以看出，咪唑色谱峰未走至基线(纵坐标0)便出现了杂质峰，说明分离效果不能达到要求)；pH低于2.30时，峰型略有扭曲。在上述pH范围内时，咪唑残留物的分离效果更好且峰型结构对称。
调pH的物质在本申请中不做特征限定，包括不限于采用磷酸调节辛烷磺酸钠水溶液的pH值。流动相pH值调整常用试剂为磷酸与醋酸，由图32可知，用醋酸调整辛烷磺酸钠水溶液pH值后，色谱峰出现明显拖尾现象，使积分不准确，导致检测结果不准确，故在本申请优选采用磷酸调整pH值。
下面将结合具体的实施例进一步说明本申请的有益效果。
(一)色谱条件
色谱柱：C18色谱柱
流动相：溶液a-溶液b(78:22)；
溶液a：0.5mg/ml辛烷磺酸钠水溶液，加磷酸调pH至2.35±0.05(每1000ml辛烷磺酸钠水溶液加磷酸0.5ml)。
溶液b：乙腈-甲醇(40:60)。
检测波长：210nm
流速：1.0ml/min
柱温：35℃
进样量：20μl
(二)溶液的配制
咪唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100045-201304)溶液：精密称取咪唑对照品约7mg，置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度。精密量取该溶液1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀(平行制备两份)。
供试品溶液：精密量取样品溶液2.0ml置微型试管中，精密加入流动相2.0ml稀释并摇匀，滤过，备用(平行制备两份)。
(三)样品检测
精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。
进样程序如下：
(四)方法验证结果
4.1专属性(指样品中可能存在其他成分的情况下，所用分析方法能够准确地、选择性地检识被测组分的能力，又称为选择性或专一性。主要考察杂质及其他成分对待检成分测序结果的影响，可通过空白试验来考察)
4.1.1溶液配制
空白溶剂：流动相
空白样品溶液(阴离子)：由原液车间提供。
供试品溶液1：精密称取咪唑对照品6.996mg，置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度。精密量取该溶液1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液2：取供试品溶液1适量，用0.45μm规格有机滤头滤过，取续滤液，备用。
4.1.2样品检测：
分别取空白溶剂、空白样品溶液、供试品溶液各20μl注入高效液相色谱仪中，记录色谱图(见图33)。
4.1.3检测结果
表1：
总结：
由以上数据说明上述分析方法专属性良好。
4.2检测限(检测限LOD系指试样中的被分析物在规定实验条件下能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量，LOD≥3时的浓度)与定量限(指样品中被测物能被定量测定的最低量，其检测结果应体现一定的准确度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。LOQ≥10时的浓度)。
4.2.1溶液配制
咪唑对照品储备液(浓度为14.238μg/ml)：精密称取咪唑对照品7.119mg，置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度，摇匀。精密量取该溶液1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
定量限溶液：精密量取咪唑对照品储备液0.1ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，连续进样6针。
检测限溶液：精密量取咪唑对照品储备液0.1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
4.2.2样品检测
分别精密量取定量限溶液与检测限溶液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图(分别如图34和图35所示)。
4.2.3检测结果
表2：
由以上数据表明上述分析方法检测限为0.0142μg/ml(检测限根据色谱图输出的s/n数值得到的，只要该数值在3左右，就可以认定为检测限，不需要在进行其它浓度检测)；定量限为0.0284μg/ml(定量限浓度是根据专属性项下咪唑对照品溶液咪唑峰高倒推得到)，且定量限重复性良好。
4.3线性
4.3.1溶液配制
对照品储备溶液：精密称取咪唑对照品7.119mg，置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度，摇匀。
线性溶液：
线性1溶液：定量限溶液。
线性2溶液(40％)：精密量取对照品储备溶液0.4ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。
线性3溶液(60％)：精密量取对照品储备溶液0.6ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。
线性4溶液(80％)：精密量取对照品储备溶液0.8ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。
线性5溶液(100％)：精密量取对照品储备溶液1.0ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。
线性6溶液(120％)：精密量取对照品储备溶液1.2ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。
4.3.2样品检测：
分别取上述各线性溶液20μL注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。
4.3.3检测结果
表3：
线性曲线见图36。从图36及表3可以看出，咪唑含量在0.0284μg/ml至17.0514μg/ml的浓度范围内，线性系数R2为0.9999，线性良好。
4.4重复性
4.4.1溶液配制
对照品溶液：精密称取咪唑对照品7.119mg、7.108mg，分置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度。精密量取该溶液1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：精密量取样品溶液2.0ml置微型试管中，精密加入流动相2.0ml稀释并摇匀，滤过，备用。(平行制备2份)
4.4.2样品检测：
分别取上述各溶液20μl注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。
4.4.3检测结果
表4：
由以上数据表明6份供试品检测结果RSD为0.13％，远低于规定标准2％，证明该检测方法的重复性良好。
4.6准确度
4.6.1目的：考察咪唑残留分析方法的准确性。
4.6.2溶液配制
空白溶剂：流动相。
对照品储备溶液：精密称取咪唑对照品7.558mg、7.362mg，分置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。精密量取该溶液1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取对照品储备溶液1ml与空白溶剂3ml，混合均匀，滤过，备用。
供试品溶液：精密量取注射用重组人特立帕肽原液2ml与空白溶剂2ml，混合均匀，滤过，备用。
回收率溶液1：精密量取注射用重组人特立帕肽原液2ml、空白溶剂1.5ml、对照品储备溶液(1)0.5ml，混合均匀，滤过，备用。(平行制备3份)
回收率溶液2：精密量取注射用重组人特立帕肽原液2ml、空白溶剂1ml、对照品储备溶液(1)1ml，混合均匀，滤过，备用。(平行制备3份)
回收率溶液3：精密量取注射用重组人特立帕肽原液2ml、空白溶剂0.5ml、对照品储备溶液(1)1.5ml，混合均匀，滤过，备用。(平行制备3份)
4.6.3样品检测
分别取上述各回收率溶液20μl注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。
4.6.4检测结果
表5：
由以上数据表明9份回收率溶液回收率均不低于96.8％，证明该检测方法的准确度良好。
4.7.耐用性
4.7.1目的：考察咪唑残留分析方法的色谱条件微量变化对检测结果的影响。
4.7.2色谱条件
表6：
4.7.3溶液配制
对照品溶液：精密称取咪唑对照品约7mg(详见记录)，置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释置刻度。精密量取该溶液1ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀(平行制备2份)。
供试品溶液：精密量取样品溶液2.0ml置微型试管中，精密加入流动相2.0ml稀释并摇匀，滤过，备用(平行制备2份)。
4.5.4样品检测：
按4.5.1“色谱条件”项各条件分别精密量取对照品溶液与样品溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
4.5.5检测结果
表7：
由于偏差≤2.0表示检测结果稳定，而从以上数据可以看出，该检测方法在优选参数范围情况下，偏差均小于0.5，说明在优选参数范围内的检测方法耐用性良好。而超出优选范围的条件下，检测结果偏差均大于5，表明偏离本申请的优选条件，所检测到的咪唑残留的含量与实际情况偏差较大，分析结果的可信度较低。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：采用C18色谱柱，并采用无机相和有机相混合形成的混合溶液作为流动相进行高效液相色谱分析，其中，无机相采用辛烷磺酸钠水溶液，而有机相采用乙腈与甲醇按照上述体积比混合而成的混合液，这样形成的流动相在分析过程中能够使咪唑残留的出峰时间、峰型、分离度均良好，并通过咪唑限量检测法对该分析方法的专属性、重复性、准确性及耐用性进行了验证，且验证结果良好。应用于PTH中咪唑残留分析中有助于实现对PTH生产工艺过程和产品质量安全的控制。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种注射用重组人特立帕肽中咪唑残留的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括：
采用C18色谱柱，以溶液a和溶液b的混合溶液为流动相，对所述注射用重组人特立帕肽中的咪唑残留进行高效液相色谱分析；
其中，所述溶液a为0.4～0.6mg/ml辛烷磺酸钠水溶液，所述溶液b为乙腈-甲醇溶液，所述乙腈-甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为20:80-60:40；
所述注射用重组人特立帕肽的进样量为10-30μL；
所述溶液a与所述溶液b的体积比为76：24～80:20；
所述色谱柱的柱温为33～37℃；
所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min；
所述高效液相色谱分析是在209-211nm紫外波长下对所述咪唑残留进行检测；
所述辛烷磺酸钠水溶液的pH值为2.35±0.05；
采用磷酸调节所述辛烷磺酸钠水溶液的pH值；
咪唑对照品溶液的浓度为0.014mg/mL；
供试品溶液的配置包括：量取所述注射用重组人特立帕肽2.0ml置微型试管中，加入所述流动相2.0ml稀释并摇匀，滤过，备用；
量取所述对照品溶液与所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述C18色谱柱的规格为4.6mm*250mm，5μm。
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