CN115327004B - 一种氧化氯吡格雷粗品的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种氧化氯吡格雷粗品的检测方法。本发明的氧化氯吡格雷粗品的检测方法采用高效液相色谱法，操作步骤包括：（1）取(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采集色谱图；色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长220±2nm，流动相以含碱性离子对的带酸性pH值的水溶液为流动相A，醇为流动相B，按梯度洗脱。本发明提供的检测方法专属性好、灵敏度和准确度高，适合用于(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷的药品注册质量研究。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷粗品的有关物质的检测方法。
背景技术
(7aS, 2’S)-2-氧-氯吡格雷（以下用“化合物A”表示），为氯吡格雷在人体的代谢产物，是一款活性更高且更安全的血小板聚集抑制剂，其化学名为：（S）-2-（2-氯苯基）-2-（（S）-2-氧代-2,6,7,7a-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5（4H）基）乙酸甲酯：
。
目前化合物A的制备工艺主要为专利CN104245707A报道的路线，以R-(-)-邻氯扁桃酸（SM1）为起始物料，经甲酯化后生成中间体I，与对硝基苯磺酰氯(SM2)缩合生成关键中间体II，再经取代、提纯生成目标化合物A。大致反应路线如下：
。
在化合物A的制备工艺中，起始物料SM1（杂质编号为M1Z1）和中间体I（杂质编号为M2Z1）作为缩合前物质，经过缩合、取代、纯化后的成品制备过程后，所述杂质较容易除去。因此如果能够将这类工艺杂质在粗品中控制得当，则能够很大程度减轻成品有关物质质量研究的压力。但现有技术中还没有关于化合物A粗品中工艺杂质的质量控制研究报道，而现有技术（CN111943958A）仅公开了一种标定式I化合物的检测方法（说明书试验1），且该方法尚无法满足检测要求。为了更好地控制化合物A的工艺杂质，尤其进行粗品阶段质量研究和控制，开发适合化合物A的有关物质质量控制方法，是目前该药品质量研究期待解决的技术问题。
发明内容
为解决(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷的质量控制需求，本发明提供一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质的检测方法。
本发明提供的(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法，采用高效液相色谱法，至少能够检测工艺杂质，包括但不限于杂质M1Z1和M2Z1。
本发明提供一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法，所述方法采用高效液相色谱法，操作步骤包括：
（1）取(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；
（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用色谱条件检测即可。
在某些实施例中，上述色谱条件包含：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测波长220±2nm；
流动相：酸性pH值的碱性离子对水溶液为流动相A，醇为流动相B，按梯度洗脱。
在某些实施例中，上述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为45%～65%，流动相B的比例为55%～35%，并维持到3～13分钟；8～18分钟时流动相A下降至30%～50%，流动相B上升至70%～50%，并维持到20～60分钟。
在某些实施例中，上述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为45%～65%，流动相B的比例为55%～35%，并维持到6～10分钟；10～14分钟时流动相A下降至30%～50%，流动相B上升至70%～50%，并维持到35～50分钟。
在某些实施例中，上述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为45%～65%，流动相B的比例为55%～35%，并维持到8分钟；12分钟时流动相A下降至30%～50%，流动相B上升至70%～50%，并维持到40分钟。
在某些实施例中，上述碱性离子对包含四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、三乙胺或二乙胺。
在某些实施例中，上述碱性离子对的质量浓度为0.01%～2.0%。
在某些实施例中，上述流动相A的pH值为1.0～6.0。
在某些实施例中，上述流动相A的pH值为2.0～5.0。
在某些实施例中，上述流动相A的pH调节剂包含磷酸、盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸。
在某些实施例中，上述溶剂包含乙腈、醇或流动相A与乙腈的体积比为20：80～40:60的混合溶液。
在某些实施例中，上述溶剂包含流动相A与乙腈的体积比为25:75、30:70、35:65的混合溶液。
在某些实施例中，上述醇包括甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。
在某些实施例中，上述流动相B包括甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。
在某些实施例中，上述梯度洗脱程序为0分钟时流动相A的比例为55%，流动相B的比例为45%，并维持到8分钟；12分钟时流动相A下降至40%，流动相B上升至60%，并维持到40分钟。
在某些实施例中，上述梯度洗脱程序还包括系统平衡程序，所述系统平衡程序包括恢复时间和维持时间。
在某些实施例中，上述恢复时间为0.1～20分钟；上述维持时间为0.1～20分钟。
在某些实施例中，上述恢复时间为0.1～5分钟。
在某些实施例中，上述维持时间为5～10分钟。
在某些实施例中，上述恢复时间的终点流动相A和B的比例分别与上述洗脱程序中0分钟时的比例相同。
在某些实施例中，上述恢复时间的终点流动相A的比例上升为45%～65%，流动相B的比例下降为55%～35%。
在某些实施例中，上述恢复时间的终点流动相A的比例上升为55%，流动相B的比例下降为45%，并维持到50分钟。
在某些实施例中，上述色谱条件的流速为0.5～2.0ml/min，优选0.8～1.5ml/min。
在某些实施例中，上述色谱条件的柱温为0～40℃，优选20～40℃。
在某些实施例中，上述有关物质包含M1Z1、M2Z1中的一种或两种。
在某些实施例中，上述供试品溶液的色谱图中，如有有关物质，单个杂质含量不超0.1%。
在某些实施例中，上述供试品溶液的色谱图中，如有有关物质，按外标法以峰面积计算，单个杂质不超0.1%。
在某些实施例中，上述步骤（1）中的(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷选自粗品、精致品或对照品，优选为粗品。
有益效果：本发明的(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法各峰的峰型好，各峰之间分离度均大于1.5，分离度良好，方法专属性好、灵敏度和准确度高，符合质量分析检测要求，适合本品的工艺杂质有关物质质量研究。
附图说明
图1：系统适用性溶液色谱图。
具体实施方式
下面将结合实验例和实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的各例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。各例中未注明的具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为通过市购获得的常规产品。
化合物A在乙腈中溶解，在甲醇中微溶，在水中几乎不溶。以下实验例和实施例所用的化合物A工作对照品（批号：201113-D，纯度99.6%）和供试品（粗品批号：29201001，纯度90%以上）均来源于成都施贝康生物医药科技有限公司，杂质M1Z1、M2Z1对照品均来自成都施贝康生物医药科技有限公司，纯度98%以上。
实验例1：化合物A有关物质检测方法的方法学考察
⒈各种对照品溶液和供试品溶液的配制
供试品溶液：取样品（化合物A，粗品批号：29201001）适量，精密称定，加稀释剂（流动相A:乙腈=30:70）溶解并定量稀释制成每1ml约含5mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
对照品溶液：分别取M1Z1和M2Z1适量，用稀释剂（流动相A:乙腈=30:70）溶解并定量稀释制成每1ml各约含5μg的混合溶液，作为杂质对照品溶液。
系统适用性溶液：分别取M1Z1和M2Z1适量，用稀释剂（流动相A:乙腈=30:70）溶解并定量稀释制成每1ml各约含0.05mg的混合溶液，作为杂质储备液，另取粗品约50mg，置10ml量瓶中，精密量取1.0ml置10ml容量瓶，加入杂质储备液1.0ml，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
说明：上述溶液还可以使用包含甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇或流动相A与乙腈的体积比为20：80～40:60的混合溶液溶解配制，以及其他可以溶解本品的溶剂。
⒉色谱条件
（1）方法筛选
由于杂质M1Z1带有一个羧基，极性很大，考虑加入离子对试剂四丁基氢氧化铵增强其保留，初步对粗品的有关物质检查方法进行了摸索，色谱条件如下：
条件1：流动相A：0.2%四丁基氢氧化铵水溶液（用磷酸调节pH值至4.0），流动相B：甲醇，A：B（45:55）；色谱柱Chromcore120 C18，4.6×250mm，5μm；检测波长220nm，柱温35℃，流速1.0 ml/min。
条件2：采用梯度洗脱，其他同条件1 。梯度洗脱程序见表1-1。
条件3：采用梯度洗脱，其他同条件1 。梯度洗脱程序见表1-2。
结果说明：色谱条件1所得的供试品溶液色谱图显示待测杂质附近有一干扰峰；色谱条件2的主峰前的峰未达到基线分离；色谱条件3能够对各个杂质有效分离。
（2）流动相水相pH的选择
在上述色谱条件3基础上，在其他条件不变的情况下，选择六种流动相A的pH进行试验，pH1（1.0）、pH2（2.0）、pH3（3.0）、pH4（5.0）、pH5（6.0）、pH6（7.0），pH调节剂采用磷酸、盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸的任意一种。采用上述条件，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。
结果说明：前五种pH值条件下，无论采用何种pH调节剂，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。但pH7.0的中性条件下，部分杂质峰峰型不好，有杂质峰未达到基线分离。表明酸性pH值的流动相对有关物质测定结果无影响。
（3）柱温的选择
在上述色谱条件3基础上，在其他条件不变的情况下，选择四种色谱柱温度进行试验，柱温1（1℃）、柱温2（20℃）、柱温3（30℃）、柱温4（40℃）。采用上述四种条件，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。
结果说明：四种柱温条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明柱温对有关物质测定结果无影响。
（4）流速的选择
在上述色谱条件3基础上，在其他条件不变的情况下，选择三种色谱流速进行试验，流速1（0.5ml/min）、流速2（1.0ml/min）、流速3（2.0ml/min）。采用上述三种条件，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。
结果说明：三种流速条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明流速对有关物质测定结果无影响。
实验例2：方法验证
本实验下所用溶液及其配制同实验例1，色谱条件同实验例1的条件3。
⒈专属性
取各溶液在拟定的色谱条件下检测，试验结果见表2-1，系统适用性溶液的色谱图见附图1。
试验结果表明：拟定色谱条件各杂质色谱峰与主成分峰均能有效分离，各杂质色谱峰之间均能有效分离，表明拟定色谱条件专属性良好。此外，在本色谱条件下，不仅杂质M1Z1、M2Z1和主峰间有效分离，该色谱条件还能有效分离样品自带的结构如下的杂质P1Z2（异构体杂质，保留时间为23.973min，分离度为39.42）和P1Z12（烯醇杂质，保留时间为33.62min，分离度为16.20）。
。
⒉检测线
取各已知杂质的待测溶液，用溶剂逐级稀释，待信噪比为3:1时，为该杂质的检测限，试验结果见表2-2。
粗品的绝对进样量为50000ng，拟定的色谱条件能够确保各杂质被有效检出。
⒊溶液稳定性（有关物质加标供试品溶液）
取粗品的加标溶液进行稳定性考察。试验结果见表2-3。
试验结果显示，供试品溶液在室温条件下考察22h，被测杂质峰峰面积无明显变化，溶液在22h内较稳定。
⒋溶液稳定性（供试品溶液）
取粗品的供试品溶液进行稳定性考察。试验结果见表2-4。
试验结果显示，供试品溶液在室温条件下考察12h，主峰峰面积和面积百分比无明显变化，说明溶液在12h内较稳定。
⒌耐用性
为了验证拟定的液相条件发生微小变动时，测定结果的准确性不受影响的程度，对拟定色谱条件的耐用性进行了考察。
取系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液，按拟定色谱条件进行测定。
试验结果表明，当流速、柱温、色谱柱、流动相及梯度洗脱程序发生微小变动时，如流速变化±0.2ml/min、柱温变化±5℃、变换不同型号色谱柱（填料不变）、流动性A的pH值变化±2，梯度洗脱程序的时间变化±2min，在各条件下，P1Z3、P1Z4的检测结果无显著差异，且溶剂不干扰样品中P1Z3、P1Z4的测定。
实施例1：有关物质测定1（流动相水相pH3.0，更换pH调节剂）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件流动相A采用冰醋酸调节pH值至3.0，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例2：有关物质测定2（碱性离子对1）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的碱性离子对由0.2%四丁基氢氧化铵换为2.0%十二烷基三甲基氯化铵，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例3：有关物质测定3（碱性离子对2）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的碱性离子对由0.2%四丁基氢氧化铵换为0.01%三乙胺，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例4：有关物质测定4（流动相B：异丙醇）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的流动相B由甲醇换为异丙醇，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例5：有关物质测定5（梯度1）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中梯度洗脱程序见如下表3-1，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例6：有关物质测定6（梯度2）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中梯度洗脱程序见如下表3-2，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例7：有关物质测定7（梯度3）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中梯度洗脱程序见如下表3-3，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例8：有关物质测定8（梯度4）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中梯度洗脱程序见如下表3-4，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例9：有关物质测定9（梯度5）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中梯度洗脱程序见如下表3-5，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例10：有关物质测定10（流动相A的pH为1.0）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流动相A的pH值由原来的4.0改为1.0，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例11：有关物质测定11（流动相A的pH为6.0）
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流动相A的pH值由原来的4.0改为6.0，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例12：有关物质测定12
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流速由原来的1.0ml/min改为2.0ml/min，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
实施例13：有关物质测定13
各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流速由原来的1.0ml/min改为0.5ml/min，其他条件不变。
测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。
值得注意的是，上述实施例1～8、10-13的后10分钟以及实施例9的后20分钟为系统平衡时间，且该部分程序不再有杂质洗脱出峰。
数据统计和总结：汇总实验例2“专属性项下”和上述实施例1～13的色谱图，统计峰面积、保留时间和分离度，结果显示：（1）各系统适用性溶液色谱图中：各峰的峰型好，各主峰与杂质峰以及杂质峰与杂质峰之间的分离度均在1.8以上，均大于1.5，各峰之间分离度较好，各方法专属性好，符合质量分析要求。（2）各供试品（粗品）溶液色谱图中：；各主峰化合物A，按外标法以峰面积计算，化合物A的含量与实验例2的差值在0.1%以内；杂质M1Z1、M2Z1均未检出，杂质P1Z2和P1Z12均有检出，按自身对照法以峰面积计算或按峰面积归一化法计算，各实施例的杂质P1Z2和P1Z12含量分别相比于实验例2的差值在0.02%以内，表明拟定的杂质测定方法准确度高、重现性良好。据此可以确定本品（粗品）的质量标准，如果样品（粗品）中有工艺杂质M1Z1和M1Z1，按外标法以峰面积计算，单个杂质不超过0.1%。
Claims (9)
1.一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质的检测方法，其特征在于，所述方法采用高效液相色谱法，操作步骤包括：
取(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；
将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用色谱条件检测即可；
系统适用性溶液：取有关物质适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成混合溶液,作为杂质储备液；另取(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷置量瓶中，加入杂质储备液，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液；
将系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中，采用色谱条件检测；
所述色谱条件包含：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测波长220±2nm；
流动相：含碱性离子对的带酸性pH值的水溶液为流动相A，醇为流动相B，按梯度洗脱；
所述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为45%～65%，流动相B的比例为55%～35%，并维持到3～13分钟；8～18分钟时流动相A下降至30%～50%，流动相B上升至70%～50%，并维持到20～60分钟；
所述有关物质包含M1Z1、M2Z1中的一种或两种，所述M1Z1、M2Z1的结构分别如下：
、/>。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述碱性离子对包含四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、三乙胺或二乙胺。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的pH值为1.0～6.0。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的pH调节剂包含磷酸、盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述溶剂包含乙腈、醇或流动相A与乙腈的体积比为20：80～40:60的混合溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述醇包含甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有关物质还包含结构如下所示的P1Z1、P1Z12中的一种或两种：
。
8.根据权利要求1～6任一所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的色谱图中，如有有关物质，单个不超过0.1%。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀释剂包含甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或流动相A与乙腈的体积比为20：80～40:60的混合溶液。
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