CN112394112B - 一种检测硫酸羟氯喹中羟氯喹氮氧化物杂质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测硫酸羟氯喹中羟氯喹氮氧化物杂质含量的方法，包括使用高效液相色谱法检测，所述高效液相色谱法的检测条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A为含0.2％磷酸的10%的乙腈水溶液，流动相B为含0.1％磷酸的80%的乙腈水溶液，梯度洗脱。该方法对羟氯喹氮氧化物有较高的分离度。
Description
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种检测硫酸羟氯喹中羟氯喹氮氧化物杂质含量的方法。
背景技术
硫酸羟氯喹为白色或类白色结晶性粉末；无臭，味苦。在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶。其分子结构式如下：
硫酸羟氯喹常作为抗疟药，用于控制疟疾症状、疟疾症状抑制性预防。亦可用于风湿性关节炎和红斑狼疮。目前硫酸羟氯喹原料现行质量标准中有关物质的检查方法仍为薄层色谱法，无法对其杂质进行一定的控制。
参考US2546658、W02010027150公开专利，硫酸羟氯喹合成工艺路线如下所示。
发明内容
发明人发现，目前《中华人民共和国药典》（2015年版）未收录硫酸羟氯喹质量标准，仅卫生部标准（二部）第一册有收录。该公开标准中对有关物质的检查仅采用薄层色谱法进行检查，尚未有很好的检测方法能够定量和定性检查硫酸羟氯喹中杂质羟氯喹氮氧化物的含量。
本发明发明人惊奇地发现，使用本申请公开实施方案的方法能够快速有效地检测出硫酸羟氯喹原料和制剂中的杂质羟氯喹氮氧化物。
进一步，本申请公开实施方案的方法能够对硫酸羟氯喹原料和制剂中的杂质羟氯喹氮氧化物进行定量测定，能够弥补《中华人民共和国药典》（2015年版）和硫酸羟氯喹研发单位质量标准的空白，可为日后有关硫酸羟氯喹有关物质的科学研究提供可靠的检测方法，同时对进一步制定硫酸羟氯喹制剂的安全限量标准提供依据及方法支撑。
本发明的一个目的是提供一种检测硫酸羟氯喹中杂质羟氯喹氮氧化物含量方法。
本发明第一方面提供一种检测硫酸羟氯喹中杂质羟氯喹氮氧化物含量的方法，包括使用液相色谱法检测，所述液相色谱法的检测条件包括：
色谱柱为苯基色谱柱。
流动相由0.05mol/L磷酸二氢钾溶液和甲醇构成，0.05mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相A，甲醇作为流动相B；流动相A和流动相B的体积比为80:20。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：检测波长为340~350nm，例如343nm。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：流动相流速为0.9~1.1mL/min，例如1mL/min。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的柱温为23~27℃，例如25℃。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：
优选地，色谱柱长度200~300mm，例如250mm；
优选地，色谱柱的直径3~6mm，例如4.6mm；
优选地，色谱柱的填料粒径为3~10μm，例如5μm。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱为Vensil MP C18（2）色谱柱。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：采用内标法定量。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的液相色谱法为高效液相色谱法。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，羟氯喹氮氧化物的色谱峰分离度大于或等于1.0。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，根据硫酸羟氯喹色谱峰计算的理论塔板数大于或等于3000。
在一个实施方案中，“分离度”定义为相邻两组分色谱峰的保留时间之差与两峰底宽度之和一半的比值，
即
（式中、/>分别为组分1、2的保留时间；/>、/>分别为组分1、2色谱峰的峰宽。）
在一个实施方案中，术语“理论塔板数”是指色谱的柱效参数之一，用于定量表示色谱柱的分离效率。
在一个实施方案中，“理论塔板数”以n来表示，即
（式中tR为组分的保留时间；W为色谱峰的峰宽。）
在一个实施方案中，理论塔板数根据羟氯喹氮氧化物的色谱峰计算获得。
在一个实施方案中，苯基色谱住为苯基官能团由来的π电子色谱柱。
本申请公开实施方案的有益效果
1）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，能够较好地分离羟氯喹氮氧化物杂质，分离度较高；
2）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，平衡时间短，测定速度快；
3）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法准确度高；
4）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法精密度高；
5）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法重现性好；
6）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法灵敏度高；
7）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，线性方程的线性较好；
8）本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，能够为日后有关硫酸羟氯喹科学研究提供可靠的检测方法，同时对进一步制定硫酸羟氯喹制剂的限量标准提供依据及方法支撑。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
实施例
在一个具体实施方案中，检测硫酸羟氯喹中羟氯喹氮氧化物杂质含量的方法包括以下步骤：
1.制备供试品溶液
取硫酸羟氯喹10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相A[乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）] 制成每1ml中约含0.1mg硫酸羟氯喹的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，加流动相A制成每1ml中约含硫酸羟氯喹0.5μg的溶液，作为对照溶液（0.5%）；精密量取对照溶液适量，加流动相A制成每1ml中约含硫酸羟氯喹0.05μg的溶液，作为报告限溶液（0.05%），供试品溶液色谱图中小于报告限溶液主峰面积的峰忽略不计。
2.制备对照品溶液
取硫酸羟氯喹对照品适量，加流动相A溶解并制成每1ml中含硫酸羟氯喹0.1mg的溶液，作为硫酸羟氯喹贮备液；取羟氯喹氮氧化物对照品适量，加乙腈：水（50:50）溶解并制成每1ml中含羟氯喹氮氧化物0.05mg的溶液，作为羟氯喹氮氧化物贮备液；精密量取各贮备液适量,用流动相A（乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸））定量稀释制成每1ml中约含硫酸羟氯喹1μg、羟氯喹氮氧化物0.5µg，作为杂质定位溶液。精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。各杂质按相对保留时间定位见下表。再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，硫酸羟氯喹峰与相邻杂质峰间的分离度应大于1.0，拖尾因子应不大于1.5，理论板数按硫酸羟氯喹计不得少于3000。供试品溶液色谱图中如有与杂质保留时间一致的色谱峰，按乘以校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量，均应符合表中相应限度规定。供试品溶液色谱图中小于报告限溶液主峰面积的峰忽略不计。
3.照高效液相色谱法测定
用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂(Vensil MP C18（2）5μm 4.6mm×250mm)的色谱柱)，以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B，按下表进行梯度洗脱，检测波长为343nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃。
4.系统适用性
(1)仪器与设备：高效液相色谱仪、量瓶、纯水机、移液管、电子天平；
(2)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(3)系统适用性溶液的配制：取硫酸羟氯喹、杂质羟氯喹氮氧化物对照品各适量，加溶剂溶解后用稀释剂定量稀释至制成每1ml中约含硫酸羟氯喹1μg、羟氯喹氮氧化物0.5µg的溶液，作为杂质定位溶液；
(4)结果：主峰与各杂质分离度符合要求，不对称度均不大于1.5，符合要求。
5.定量限与检测限
(1)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(2)结果：在信噪比S/N约为3时，羟氯喹氮氧化物、硫酸羟氯喹检测限分别为0.098ng、0.123ng；在信噪比S/N约为10时，羟氯喹氮氧化物、硫酸羟氯喹定量限分别为0.328ng、0.409ng。
6.线性范围
(1)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(2)取空白溶剂、各浓度水平供试品溶液20µl进样2针，记录色谱图；
(3)线性结果为：羟氯喹氮氧化物线性范围为0.016μg/ml ~0.614μg/ml,在此范围内线性回归方程为y=65.592x-0.4975，r2为0.9997，r=0.9998（r≥0.999），符合要求。
7.精密度与回收率
7.1重复性
(1)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(2)加标供试溶液（0.5%）的配制：
取制剂约含硫酸羟氯喹10mg，精密称定，置100ml量瓶，加稀释剂适量，精密移取羟氯喹氮氧化物杂质贮备液适量，置同一容量瓶中，超声10分钟，加稀释剂稀释至刻度，滤过，取续滤液作为加标供试溶液（0.5%）（以0.1mg/ml为100%浓度）；精密移取供试品溶液1ml，用稀释剂稀释至200ml，作为对照溶液（0.5%）；精密移对照溶液2ml，用稀释剂稀释至20ml，作为报告限溶液；
(3)取空白溶剂、供试品溶液20µl进样，记录色谱图。
7.2中间精密度
(1)分析员1：沿用同“重复性”项下的实验数据；
(2)分析员2：使用不同仪器与设备照“重复性”重新进行试验；
(3)结果：精密度试验中，分析员1重复性6份加标供试品杂质羟氯喹氮氧化物含量RSD为1.6%，小于5%，符合要求；2个分析员12份加标供试品杂质羟氯喹氮氧化物含量为3.1%，小于10%，符合要求，故有关物质精密度试验结果符合验证要求。
7.3回收率
(1)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(2)3组加标供试溶液（50%、100%、150%）（以0.1mg/ml为100%浓度）的配制：分别取制剂约含硫酸羟氯喹适量，精密称定，置量瓶，加稀释剂适量，分别精密移取羟氯喹氮氧化物杂质贮备液适量，置同一容量瓶中，超声10分钟，加稀释剂稀释至刻度，配制成约含主成分0.1mg/ml与约含杂质相对浓度分别为50%、100%、150%的加标供试溶液（以0.1mg/ml为100%浓度），滤过，取续滤液作为供试溶液；精密移取硫酸羟氯喹贮备液，用稀释剂稀释成相对浓度为0.5%的对照溶液（以0.1mg/ml为100%浓度）；每组浓度平行配制3份样品；
(3)结果：50%浓度加标供试品溶液杂质羟氯喹氮氧化物、回收率为97.6%；100%浓度加标供试品溶液杂质羟氯喹氮氧化物回收率为102.1%；150%浓度加标供试品溶液杂质羟氯喹氮氧化物回收率为105.8%，所得杂质回收率均在在80%~120%之间，故有关物质回收率试验结果符合验证要求。
8.溶液稳定性与耐用性
8.1溶液稳定性
(1)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(2)供试溶液配制：取样品片，研细，取约含硫酸羟氯喹10mg，精密称定，置100ml量瓶，加流动相A适量，超声10分钟，加流动相A稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试溶液。精密移取供试品溶液1ml，用稀释剂稀释至200ml，作为对照溶液（0.5%）；精密移取供试品溶液2ml，用稀释剂稀释至20ml，作为报告限溶液；
(3)杂质溶液配制：精密移取各杂质羟氯喹氮氧化物贮备液适量，稀释制成0.5%浓度的杂质溶液（以0.1mg/ml为100%浓度）；
(4)结果：室温条件下，0、4、8、12小时内，室温放置的供试品溶液中主峰与杂质峰面积RSD小于10%，杂质溶液（0.5%）杂质峰面积RSD小于10%，无显著性变化。以上结果表明，室温条件下，供试品溶液在12小时内杂质含量稳定。
8.2耐用性
(1)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(2)加标供试溶液（0.5%）的配制：取制剂约含硫酸羟氯喹10mg，精密称定，置100ml量瓶，加稀释剂适量，精密移取羟氯喹氮氧化物杂质贮备液适量，置同一容量瓶中，超声10分钟，加稀释剂稀释至刻度，滤过，取续滤液作为加标供试溶液（0.5%）（以0.1mg/ml为100%浓度）；精密移取供试品溶液1ml，用稀释剂稀释至200ml，作为对照溶液（0.5%）；精密移取供试品溶液2ml，用稀释剂稀释至20ml，作为报告限溶液；
(3)进样检测：分别精密量取空白溶剂、供试品溶液、各20μl在以上各色谱条件下进样，记录色谱图；
(4)结果：在不同流速(0.9~1.1mL/min)条件下，杂质含量极差不大于0.05%，相对保留时间RSD均不大于2%，符合要求；在不同柱温（23℃~27℃）条件下，杂质含量极差不大于0.05%，相对保留时间RSD不大于2%，符合要求；同一厂家同一规格不同批次的3根色谱柱（Vensil MP C18（2）5μm 4.6mm×250mm)杂质含量极差不大于0.05%，相对保留时间RSD不大于2%，符合要求；以上表明，在不同流速(0.9mL/min~1.1mL/min)、同一厂家同一规格不同批次的色谱柱（Vensil MP C18（2）5μm 4.6mm×250mm)、不同柱温（23℃-27℃），对有关物质杂质检测没有显著影响。
9.校正因子耐用性
(1)空白溶剂：以乙腈：水（10:90）（含0.2%磷酸）为流动相A，同时作为稀释剂；以乙腈：水（80:20）（含0.1%磷酸）为流动相B；
(2)取空白溶剂、各浓度水平供试品溶液20µl进样2针，记录色谱图；
(3)试验结果：在不同柱温（23℃~27℃）条件下，杂质校正因子与标准条件相比，偏差不大于10%，符合要求；在不同流速(0.9~1.1mL/min)条件下，各杂质校正因子与标准条件相比，偏差均不大于10%，符合要求；同一厂家同一规格不同批次的色谱柱，杂质校正因子与标准条件相比，偏差不大于10%，符合要求，故该方法校正因子耐用性符合验证要求。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (11)
1.一种检测硫酸羟氯喹中有关杂质含量的方法，包括使用高效液相色谱法检测，所述高效液相色谱法的检测条件包括：
色谱柱为十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相A为含0.2％磷酸的10%的乙腈水溶液，流动相B为含0.1％磷酸的80%的乙腈水溶液；
按下表进行梯度洗脱：
所述高效液相色谱法的检测条件包括：流动相流速为0.9～1.1mL/min，色谱柱的柱温为23～27℃；
检测波长为340～350nm；
所述杂质为羟氯喹氮氧化物。
2.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：流动相流速为1mL/min。
3.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的柱温为25℃。
4.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：所述检测波长为343nm。
5.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱长度为200～300mm。
6.根据权利要求5所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱长度为250mm。
7.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的直径为3～6mm。
8.根据权利要求7所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的直径为4.6mm。
9.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的填料粒径为3～10μm。
10.根据权利要求9所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的填料粒径为5μm。
11.根据权利要求1所述的方法，所述羟氯喹氮氧化物的色谱峰分离度大于或等于1.0。
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