CN114689737A - 一种s-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法 - Google Patents

一种s-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种S‑邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法，所述分析方法采用高效液相色谱‑UV检测器进行检测，所述高效液相色谱的色谱柱为C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为pH＝1.6‑1.9的磷酸盐缓冲溶液，进行梯度洗脱。本发明的分析方法操作简单且可以有效分离并准确定量检测S‑邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及其杂质。

Description

一种S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，涉及一种S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法。
背景技术
S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐，分子量为349.72，其化学名结构式为
Figure BDA0003451958360000011
S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐是一种重要的医药中间体，为合成氯吡格雷药物的起始物料。其杂质主要来源于合成工艺过程中残留的中间体、工艺杂质以及物料储存过程中产生的降解杂质。
当以S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐为起始原料合成氯吡格雷时，其降解杂质邻氯苯甘氨酸(简称杂质A)，工艺杂质邻氯苯甲胺酒石酸盐(简称杂质B)，间氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐(简称杂质C)，对氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐(简称杂质D)也会参与反应，生成原料药相应的杂质。其中杂质C与杂质D为S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐的同分异构体，是关键控制杂质，它们的含量会直接影响S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐成品质量，但是这两种杂质在常规色谱条件中较难分离。
中国专利申请CN 110940745 A公开了一种S-2-氨基-2-(2-氯苯基)乙酸甲酯或其盐中有关物质的检测方法，其分析方法未对S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐工艺杂质C与杂质D进行控制，并且根据其提供的空白色谱图上看出，空白存在干扰，杂质有可能包含在空白干扰峰里面，导致杂质出现漏检的风险，所以该方法不能用于实际的药物分析中。
因此，需要开发能够分离同分异构体的分析方法，对S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐杂质的研究有助于氯吡格雷药物的合成工艺优化和质量控制，同时也为其自身的工艺改进及质量研究提供重要的参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法，该分析方法操作简单且可以有效分离并准确定量检测S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及其杂质。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法，所述分析方法采用高效液相色谱-UV检测器进行检测，所述高效液相色谱的色谱柱为C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为pH＝1.6-1.9的磷酸盐缓冲溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0 10 90
3 10 90
23 26 74
48 85 15
60 85 15
61 10 90
70 10 90
本发明所述的S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质是指S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及其杂质，所述杂质来源于合成工艺过程中残留的中间体、工艺杂质或者物料储存过程中产生的降解杂质。
作为优选，所述C18柱填料粒径为3.5-5μm，更优选为5μm；内径为3.0-4.6mm，更优选为4.6mm；柱长为100-250mm，更优选为250mm。
作为优选，所述所述磷酸盐缓冲溶液通过如下方法配制：称取磷酸二氢钾置于水中，用85％磷酸溶液调pH至所需值。
作为优选，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为1.7-1.9，最优选1.8。
作为优选，检测时，柱温为25-35℃，优选为30℃。
作为优选，检测波长为210-230nm，优选波长为220nm。
作为优选，进样量为10μL。
作为优选，流动相流速为1.0mL/min。
作为特别优选，检测时，柱温为30℃，检测波长为220nm，进样量为10μL，流动相流速为1.0mL/min。
作为优选，所述的S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质用甲醇水溶液(更优选30％甲醇水溶液)进行溶解以得到所需浓度的待测溶液。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1、本发明能有效分离S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及其杂质，其中S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐与杂质A、杂质B、杂质C以及杂质D，各组分之间的分离度可达4.0以上。
2、本发明所述分析方法，各组分均能有效分离，专属性、灵敏度、线性、准确度、精确度等符合药典验证要求，方法耐用性强。
3、S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质分析方法的建立，能够更好地实现对原料S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐和成品氯吡格雷的质量控制，为产品的研发和生产提供了简单、准确以及高效的分析方法，提高最终产品的质量，保证其临床用药的安全有效。
附图说明
图1为实施例一空白溶液的液相色谱图；
图2为实施例一系统适应性溶液的液相色谱图；
图3为实施例一供试品溶液的液相色谱图；
图4为实施例一供试品加样溶液的液相色谱图；
图5为实施例二灵敏度溶液的液相色谱图；
图6为实施例三S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐的线性曲线图；
图7为实施例三杂质A的线性曲线图；
图8为实施例三杂质B的线性曲线图；
图9为实施例三杂质C的线性曲线图；
图10为实施例三杂质D的线性曲线图；
图11为对比例1的液相色谱图；
图12为对比例2的液相色谱图；
图13、14为对比例3的液相色谱图；
图15、16为对比例4的液相色谱图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质检测方法进行相关内容的描述：
本发明实施例使用的S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐对照品纯度为98.0％；杂质A对照品纯度为96.1％，杂质B对照品纯度为98.5％，杂质C对照品纯度为99.6％，杂质D对照品纯度为99.6％，邻氯苯甲醛对照品93.9％(该组分在本方法中只用于专属性，灵敏度考察)。
S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品中含有杂质，其中杂质组成和含量不明。
实施例一：专属性考察
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：甲醇；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.8；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
Figure BDA0003451958360000041
Figure BDA0003451958360000051
2、溶液制备
空白溶液：稀释剂；
系统适应性溶液：精密称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐对照品30mg，称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、邻氯苯甲醛各约10mg置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，移取该溶液1.0mL置于100mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。
杂质A储备液：称取杂质A对照品约25mg置50mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度；
杂质B储备液：称取杂质B对照品约50mg置50mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度；
杂质C储备液：称取杂质C对照品约10mg置100mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度；
杂质D储备液：称取杂质D对照品约15mg置50mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度；
邻氯苯甲醛储备液：称取邻氯苯甲醛对照品约10mg置100mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度；
供试品溶液：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容。
供试品加样溶液：称取供试品50mg置50mL容量瓶中，并分别移取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D及邻氯苯甲醛储备液各0.5mL于该容量瓶，用稀释剂溶解并定容。
3、检验方法
(1)精密量取空白溶液、系统适用性试验溶液、供试品溶液、供试品加样溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。图1、图2、图3、图4依次为空白溶液、系统适应性溶液、供试品溶液、供试品加样溶液的液相色谱图；
(2)如图2所示，系统适用性溶液出峰顺序依次为杂质A、杂质B、S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质C、杂质D、邻氯苯甲醛；要求S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐的拖尾因子≤1.5，杂质C与杂质D的分离度≥1.5。
(3)按面积百分比法乘以校正因子法报告各杂质的测试结果，其中杂质A的校正因子为0.96，杂质B的校正因子为0.98，杂质C的校正因子为0.87，杂质D的校正因子为0.58，未知杂质的校正因子为1.0。
4、实验结果
(1)系统适用性测试结果见图2，结果见表1：
表1-系统适用性测试结果
S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐拖尾因子 杂质C与杂质D分离度
0.92 4.84
系统适应性溶液中S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐的拖尾因子小于1.5，杂质C与杂质D的分离度大于1.5，各已知组分的分离度好。
(2)供试品溶液、供试品加样溶液的液相色谱图分别如图3和图4所示。结果见表2；
表2-加样溶液测试结果
Figure BDA0003451958360000061
Figure BDA0003451958360000071
加样溶液中各已知组分与样品中各未知组分均能有效分离，且分离度均大于4.0，说明本方法的专属性结果良好。
实施例二：灵敏度考察
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：甲醇；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.8；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
时间(min) A％ B％
0 10 90
3 10 90
23 26 74
48 85 15
60 85 15
61 10 90
70 10 90
2、溶液制备
灵敏度溶液(0.02％)：称取杂质A对照品约50mg、杂质B对照品约50mg、杂质C对照品50mg、杂质D对照品50mg、邻氯苯甲醛对照品50mg，S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐对照品50mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，移取该溶液1.0mL置100mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，移取该溶液1.0mL至50mL容量瓶中，用稀释剂稀释并定容。
3、检验方法
精密量取灵敏度溶液10μL，注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
灵敏度测试结果见表3：
表3-灵敏度溶液测试结果
Figure BDA0003451958360000081
各组分相对于实施例1的供试品浓度为0.02％时，S/N值均大于10，说明本方法的灵敏度结果良好。
实施例三：线性考察
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：甲醇；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.8；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
时间(min) A％ B％
0 10 90
3 10 90
23 26 74
48 85 15
60 85 15
61 10 90
70 10 90
2、溶液制备
将各组分经精密稀释，加入样品中，制备一系列各浓度点溶液进行测定，浓度范围至少需要包含范围上下限和100％限度浓度三个点，需制备至少5个不同浓度的线性溶液，具体配制过程如下：
线性储备液①：精密称取杂质A对照品50mg，杂质B对照品100mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
线性储备液②：精密称取杂质C对照品25mg，杂质D对照品75mg置25mL容量中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
线性稀释液：移取线性储备液①5.0mL，线性储备液②1.0mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀释。
L1～L6为杂质各浓度线性溶液：
L0溶液：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容。
L1溶液(4％)：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入0.2mL线性稀释液于该容量瓶中，用稀释剂稀释并定容。
L2溶液(20％)：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入1.0mL线性稀释液于该容量瓶中，用稀释剂稀释并定容。
L3溶液(40％)：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入2.0mL线性稀释液于该容量瓶中，用稀释剂稀释并定容。
L4溶液(80％)：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入4.0mL线性稀释液于该容量瓶中，用稀释剂稀释并定容。
L5溶液(100％)：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入5.0mL线性稀释液于该容量瓶中，用稀释剂稀释并定容。
L6溶液(120％)：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入6.0mL线性稀释液于该容量瓶中，用稀释剂稀释并定容。
S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐储备液：精密称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐对照品50mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
L7溶液：移取L11溶液1.0mL于50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
L8溶液：移取L11溶液1.0mL于20mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
L9溶液：移取L11溶液1.0mL于10mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
L10溶液：移取L11溶液5.0mL于10mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
L11溶液：移取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐储备液1.0mL于100mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
L12溶液：移取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐线性储备液1.5mL于100mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
3、检验方法
精密量取L0溶液、L1～L12溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
各组分线性方程及相对于主成分的校正因子见图6～10，结果见表4：
表4-线性方程以及校正因子
Figure BDA0003451958360000111
各组分的相关系数r均大于0.999，说明本方法的线性结果良好。
实施例四：准确度考察
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：甲醇；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.8；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
Figure BDA0003451958360000112
Figure BDA0003451958360000121
2、溶液制备
S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐储备液：精密称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
取已知量杂质加入S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐储备液中，得到各杂质的不同加样溶液。
3、检测方法
精密量取各杂质的不同加样溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。每一个溶液重复侧三次。
4、结果
准确度系指用所建立方法测定值与真实值接近的程度，一般用回收率(％)表示；其中真实值是指溶液中杂质质量占S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐质量的百分比，测定值是按检测结果计算得出的百分比；根据线性项下各浓度点测试结果计算回收率。各组分加样回收率结果见表5～表8。
表5-杂质A加样的回收率
Figure BDA0003451958360000122
Figure BDA0003451958360000131
表6-杂质B加样的回收率
Figure BDA0003451958360000132
表7-杂质C加样的回收率
Figure BDA0003451958360000133
Figure BDA0003451958360000141
表8-杂质D加样的回收率
Figure BDA0003451958360000142
各组分的回收率在90％～110％之间，相应浓度的回收率结果RSD小于5％，说明本方法的准确度结果良好。
实施例五：精密度考察
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：甲醇；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.8；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
时间(min) A％ B％
0 10 90
3 10 90
23 26 74
48 85 15
60 85 15
61 10 90
70 10 90
2、溶液制备
两人在不同天不同实验室，根据杂质100％限度浓度，取已知量杂质加入到样品中进行测定，对两人测定结果进行比对，具体配制过程如下：
精密度储备液①：精密称取杂质A对照品50mg，杂质B对照品100mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
精密度储备液②：精密称取杂质C对照品25mg，杂质D对照品75mg置25mL容量中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
精密度稀释液：移取储备液①5.0mL，储备液②1.0mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀释。
加样溶液：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入5.0mL精密度稀释液于该容量瓶中，用稀释剂溶解并定容。第一人跟第二人平行配制6份进行比对。
3、检测方法
精密量取加样溶液10μL，分别注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
精密度测试的结果见表9。
表9-精密度测试结果
Figure BDA0003451958360000161
精密度下各组分相对标准偏差小于2％，说明本方法的精密度结果良好。
实施例六：耐用性考察
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：甲醇；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.8；稀释剂：30％甲醇水溶液。
耐用性① 流动相pH值变为1.7，其余条件不变；
耐用性② 流动相pH值变为1.9，其余条件不变；
耐用性③ 更换同类型不同批次色谱柱，其余条件不变；
2、溶液制备
精密度储备液①：精密称取杂质A对照品50mg，杂质B对照品100mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
精密度储备液②：精密称取杂质C对照品25mg，杂质D对照品75mg置25mL容量中，用甲醇溶解并稀释至刻度。
精密度稀释液：移取储备液①5.0mL，储备液②1.0mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀释。
加样溶液：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，加入5.0mL精密度稀释液于该容量瓶中，用稀释剂溶解并定容。第一人跟第二人平行配制6份进行比对。
3、检测方法
精密量取系统适用性溶液，加样溶液10μL，分别注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
耐用性的测试的结果见表10～表11。
表10-系统适用性测试结果
Figure BDA0003451958360000171
Figure BDA0003451958360000181
表11-加样溶液测试结果
Figure BDA0003451958360000182
改变流动相pH值，使用同类型不同批次的色谱柱，与正常条件对比，测试结果相对偏差均小于5％，说明本方法的耐用性结果良好。
实施例七：供试品检测
通过上述的实施例1-6，实验结果均符合要求，证明该分析方法可以用于S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的检测，选择3批不同批次的样品，进行测试。
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：甲醇；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.8；稀释剂：30％甲醇水溶液。
2、溶液制备
供试品溶液：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置50mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容。
3、检测方法
精密量取供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
供试品测试的结果见表12。
表12-供试品测试结果
Figure BDA0003451958360000191
对比例1：
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：乙腈；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至2.5；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
Figure BDA0003451958360000192
Figure BDA0003451958360000201
2、溶液制备
供试品溶液：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置于50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。
3、检验方法
精密量取配制的溶液10μL，注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
色谱图见图11，已知杂质A(3.830min)与样品中未知杂质(3.751min)无法有效分离，因此该技术方案在前期被淘汰。
对比例2：
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：乙腈；流动相B：称取1.0g庚烷磺酸钠置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至2.5；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
Figure BDA0003451958360000202
Figure BDA0003451958360000211
2、溶液制备
供试品溶液：称取S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品50mg置于50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。
3、检验方法
精密量取配制的溶液10μL，注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
色谱图见图12，杂质A峰形不好，因此需要进一步优化。
对比例3：
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：2μL；流动相A：乙腈；流动相B：称取2.72g磷酸二氢钾，0.5g无水戊烷磺酸钠置1L水中，调pH至6.0；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
时间(min) A％ B％
0 5 95
5 5 95
40 20 80
50 45 55
60 55 45
80 80 20
81 5 95
90 5 95
2、溶液制备
杂质C定位溶液：称取杂质C对照品约30mg置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
杂质D定位溶液：称取杂质D对照品约30mg置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
3、检验方法
精密量取配制的溶液2μL，注入液相色谱仪，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。
4、结果
杂质C液相图谱见13，杂质D液相图谱见14，杂质C与杂质D无法分离。
对比例4：
1、色谱条件
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 220nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：乙腈；流动相B①：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至1.6；流动相B②：称取2.72g磷酸二氢钾置1L水中，用85％磷酸溶液调pH至2.0；稀释剂：30％甲醇水溶液。
梯度程序：
时间(min) A％ B％
0 10 90
3 10 90
23 26 74
48 85 15
60 85 15
61 10 90
70 10 90
2、溶液制备
供试品溶液：称取邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品约50mg置于50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。
3、检验方法
精密量取配制的溶液10μL，注入液相色谱仪，按照色谱条件分别使用pH值为1.6，2.0的流动相进行检测，记录色谱图。
4、结果
pH为1.6的供试品溶液色谱图见图15，pH为2.0的供试品溶液的色谱图见16，pH为2.0下，未知杂质之间无法有效分离(22.296分钟)，pH为1.6时，各组分可以有效分离，考虑pH值太低，可能会影响色谱柱的使用寿命，最终pH值定为1.8。
以上试验可以看出，本方法实现了邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及其4个杂质的分离，方法专属性，线性，准确度，精密度均能符合验证要求，适用于邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐的有关物质检测。
以上实施例对本发明作了详细的描述，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行修改或改进，这些修改和改进也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法，其特征在于：所述分析方法采用高效液相色谱-UV检测器进行检测，所述高效液相色谱的色谱柱为C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为pH=1.6-1.9的磷酸盐缓冲溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述C18柱填料粒径为3.5-5μm；内径为3.0-4.6mm；柱长为100-250mm。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述C18柱填料粒径为5μm；内径为4.6mm；柱长为250mm。
4.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：所述所述磷酸盐缓冲溶液通过如下方法配制：称取磷酸二氢钾置于水中，用85%磷酸溶液调pH至所需值。
5.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液的pH为1.7-1.9，最优选1.8。
6.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：检测时，柱温为25-35℃，优选为30℃。
7.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：检测波长为210-230nm，优选为220nm。
8.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：进样量为10 μL。
9.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：检测时，流动相流速为1.0mL/min。
10.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：检测时，柱温为30℃，检测波长为220nm，进样量为10 μL，流动相流速为1.0mL/min。
11.如权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于：所述的S-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质用甲醇水溶液进行溶解以得到所需浓度的待测溶液。
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