CN110824059A - 一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法。该方法以ZORBAX SB‑CN为色谱柱，采用HPLC检测方法对非布司他中甲酰基杂质2‑[3‑甲酰基‑4‑(2‑甲基丙氧基)苯基]‑4‑甲基‑5‑噻唑甲酸进行定性和定量，并进行了方法学验证，经实验证明，该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点。本发明首次建立了非布司他中甲酰基非布司他的定性和定量方法，便于对非布司他的质量进行控制，从而提高了非布司他的用药安全性。

Description

一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法
技术领域
本发明涉及一种非布司他中甲酰基杂质(2-[3-甲酰基-4-(2-甲基丙氧基)苯基]-4-甲基-5-噻唑甲酸)的检测方法，属于医药技术领域。
背景技术
非布司他(Febuxostat Tablets)2008年首先在欧洲上市，2009年在美国上市，2013年开始在国内上市。非布司他是新上市的临床用于治疗痛风降酸药物，是选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂，可抑制尿酸生成，是近40年来FDA批准的第一个用于治疗通风的药物。欧美标准已将非布司他设为一线痛风降酸药物，其具有强效、安全、轻中度肾功能不全者不需要调整剂量等优势。作为新药，非布司他确实具有和其他传统痛风降酸药物所不具有的优势，和别嘌醇一样，非布司他也是一种抑制尿酸生成的痛风降酸药物，但其分子结构与别嘌醇和嘌呤不同，能通过非竞争机制与黄嘌呤氧化酶结合，抑制黄嘌呤氧化酶活性，从而达到抑制尿酸生成的目的。非布司他是特异性的黄嘌呤氧化酶抑制药，不但抑制还原型，还抑制氧化型的黄嘌呤氧化酶。因此，较小剂量就能发挥更大的黄嘌呤氧化酶抑制作用。非布司他可以作为一线的痛风治疗药物，具有广阔的市场前景。
甲酰基非布司他(简称：甲酰基杂质)是非布司他的工艺杂质，还是基因毒性杂质，因此应制定甲酰基非布司他在非布司他中的检测方法，对非布司他的质量进行控制。但经检索，目前尚无关于甲酰基非布司他在非布司他中的含量检测方法的报道。
甲酰基非布司他结构式如下所示：
Figure BDA0002288942290000011
发明内容
针对上述问题，本发明首次提供了一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法。该方法采用HPLC检测方法对非布司他中甲酰基杂质进行定性、定量，并进行了方法学验证。经实验证明，该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点，能够可靠地对非布司他中甲酰基非布司他进行定性定量分析。
本发明的技术方案是：一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法，其特征是，将非布司他样品溶解后采用HPLC检测方法对非布司他中甲酰基杂质进行定性和定量。
其中，色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX SB-CN，4.6×250mm，5μm；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
检测波长：320nm；
流动相A：0.01mol/l醋酸钠水溶液(用高氯酸调pH至3.3)-乙腈(65:35)
流动相B：水-乙腈(20:80)
梯度洗脱如下所示。
优选的，采用水-乙腈(10:90)对非布司他样品进行溶解。
优选的，采用标准曲线法对甲酰基非布司他进行定量，优选的标准曲线为：y＝1549426x-6412，r＝0.9994。
本发明的优势是：
1、甲酰基非布司他是非布司他的工艺杂质，还是基因毒性杂质。本发明首次建立了非布司他中甲酰基非布司他的检测方法，便于对非布司他的质量进行控制，从而提高了非布司他的用药安全性。
2、分离效果好
在高效液相色谱仪中使用C18、C8柱均不能对非布司他和甲酰基非布司他进行很好的分离检测，常用的磷酸、醋酸均不能使甲酰基非布司他的理论塔板数达到要求。本发明使用ZORBAX SB-CN色谱柱检测方法，并对方法流动相中酸进行了优化，使这两种成分能够得到很好的分离，甲酰基非布司他的理论塔板数达到要求。从图2～3可以看出：甲酰基非布司他RT为25.447min，理论塔板数为5806；非布司他峰RT为28.883min，二者分离效果好，理论塔板数大于2000。
3、方法的专属性强、快速、灵敏、准确
经实验证明，该方法具有专属性强(专门针对非布司他中甲酰基非布司他)、快速、灵敏(检出限为0.0276μg/ml，定量限为0.0552μg/ml)、准确(102.1-107.3％)等优点，能够可靠地对非布司他中甲酰基非布司他的含量进行定量分析。
附图说明
图1为甲酰基非布司他标准曲线；
图2为甲酰基非布司他的图谱(RT：25.447min)；
图3为样品(含甲酰基非布司他的非布司他)的图谱，其中非布司他RT：28.883min，甲酰基非布司他RT：25.357min。
具体实施方式
实施例1
1仪器与材料
1.1仪器：Agilent高效液相色谱仪(美国)；
1.2试剂：乙腈为色谱级，高氯酸(分析纯)，醋酸钠(分析纯)，水为超纯水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-CN，4.6×250mm，5μm；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
检测波长：320nm；
流动相A：0.01mol/l醋酸钠水溶液(用高氯酸调pH至3.3)-乙腈(65:35)；
流动相B：水-乙腈(20:80)；
梯度洗脱如上表1所示。
表1梯度洗脱
Figure BDA0002288942290000031
2.2溶液的制备
2.21对照品溶液的制备
稀释液：水-乙腈(10﹕90)；
精密称取甲酰基非布司他对照品(甲酰基非布司他含量91.8％)12.02mg，置200ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，得浓度为0.5517μg/ml的对照品溶液。系列改变对照品溶液用量，得到浓度分别为0.0552μg/ml、0.1379μg/ml、0.2759μg/ml、0.4138μg/ml、0.5517μg/ml、0.6896μg/ml的系列对照品溶液。
2.22样品溶液的制备
对照品溶液：取甲酰基非布司他对照品约6mg(含纯甲酰基非布司他为6mg)，置100ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，得到6μg/ml的对照品溶液。
系统适用性溶液：精密量取对照品溶液1ml，置入已加入非布司他对照品6mg的10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
样品溶液的配制：称取非布司他样品15mg共六份，分别置25ml量瓶中，加入上述对照品溶液0.25ml，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，用于计算方法的重复性。不同日期对同一样品进行测定，计算方法的中间精密度。
配制取非布司他样品15mg加不同浓度甲酰基非布司他对照品溶液的供试品溶液，计算方法的准确度。
3分析方法的验证
3.1线性关系
取对照品溶液进行HPLC测定，所得结果以甲酰基非布司他的浓度为横坐标，面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。线性方程为y＝1549426x-6412，r＝0.9994(权重：1/x2)(见图1)。取浓度为0.5517μg/ml的对照品溶液连续进样六次，得到的峰面积RSD＝0.94％，保留时间RSD＝0.07％。甲酰基非布司他图谱见图2。
3.2重复性与中间精密度
取同一非布司他样品配置的六份溶液进行重复性实验，结果见表2，图谱见图3。
表2重复性结果
Figure BDA0002288942290000041
不同日期取重复试验的同一非布司他样品配置的六份溶液进行重复性实验，结果见表3。
表3中间精密度结果
Figure BDA0002288942290000051
3.3准确度与耐用性
配制样品加不同浓度甲酰基非布司他对照品溶液的供试品溶液，计算方法的准确度。结果见表4。
表4准确度结果
Figure BDA0002288942290000052
3.4耐用性：取对照品溶液，供试品溶液，在58小时内，重复进样，峰面积RSD分别是2.15％、5.70％。
3.5检出限：方法的检出限(LOD)为取信噪比S/N＝3倍时的甲酰基非布司他的进样浓度，通过计算为0.0276μg/ml。
3.6定量限：方法的定量限(LOQ)为取信噪比S/N＝10倍时的甲酰基非布司他的进样浓度，通过计算为0.0552μg/ml。
4讨论
在高效液相色谱仪中使用普通的C18、C8柱均不能对非布司他和甲酰基非布司他进行很好的分离检测，普通的磷酸、醋酸均不能使甲酰基非布司他的理论塔板数达到要求。本发明使用ZORBAX SB-CN色谱柱检测方法，并对方法流动相中酸进行了优化，使这两种成分能够得到很好的分离，甲酰基非布司他的理论塔板数达到要求。经实验证明，该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点，能够可靠地对非布司他中甲酰基非布司他的含量进行定性定量分析。
甲酰基非布司他含有基因毒性警示结构，也未查到具体的毒性数据，按照ICHQ3A中未知杂质的要求，我们将控制限度订为≤0.10％。
实施例2：实际样品的检测
1)取非布司他样品，用稀释剂(按体积比，水-乙腈＝10﹕90)溶解或者定容，配制成1ml中含有0.6mg的溶液，作为供试品溶液；
2)取步骤1)制备的供试品溶液，采用与实施例1完全相同的仪器和试剂，按照步骤1)2.1所示的色谱进行HPLC检测。
3)根据实施例1得出的标准曲线，查出供试品溶液中甲酰基非布司他的含量，进一步计算出非布司他中的甲酰基非布司他含量。
采用上述的方法检测三批样品，结果如下表5：
表5检测样品中的甲酰基非布司他含量
样品批号 160901 160902 160903
甲酰基非布司他含量％ 0.011 0.010 0.011
。

Claims (5)

1.一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法，所述甲酰基杂质为2-[3-甲酰基-4-(2-甲基丙氧基)苯基]-4-甲基-5-噻唑甲酸，其特征是，将非布司他样品溶解后以ZORBAX SB-CN为色谱柱，采用HPLC检测方法对非布司他中甲酰基杂质进行定性和定量。
2.如权利要求1所述的一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法，其特征是，
其中，色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX SB-CN；
检测波长：320nm；
流动相A：0.01mol/l醋酸钠水溶液与乙腈体积比为65:35；其中0.01mol/l醋酸钠水溶液用高氯酸调pH至3.3；
流动相B：水与乙腈体积比20:80。
3.如权利要求2所述的一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法，其特征是，所述梯度洗脱条件为：
Figure FDA0002288942280000011
4.如权利要求1所述的一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法，其特征是，其色谱柱，色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。
5.如权利要求1-4中任一项所述的一种非布司他中甲酰基杂质的检测方法，其特征是，采用体积比10﹕90的水-乙腈对非布司他样品进行溶解。
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