CN115453012B - 一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相hplc方法 - Google Patents

一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相hplc方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，解决了现有技术中存在的不足，可实现伏硫西汀与其位置异构杂质的有效分离，同时可实现对其他相关工艺杂质和降解杂质的控制，操作简便，专属性、线性、精密度均良好，且溶液稳定，灵敏度高、准确度高、方法耐用性好，满足限度0.1％的控制需求，可用于氢溴酸伏硫西汀原料药的质量控制，满足氢溴酸伏硫西汀片的质量控制需求。

Description

一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法
1、技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法。
2、背景技术
氢溴酸伏硫西汀，是一个多模式作用机制的抗抑郁剂，可以全面改善患者的抑郁症状，包括情绪、躯体及认知。对于重度抑郁障碍、抑郁合并重度焦虑障碍、广泛性焦虑障碍、使用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂或5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂药物治疗失败的患者有显著疗效，还可以降低疾病复发的风险，改善患者日常社会功能与认知功能。与传统的抗抑郁药相比较，不良事件发生率小。氢溴酸伏硫西汀由丹麦灵北制药公司首先开发并申请专利，后由日本武田制药与丹麦灵北制药共同开发，2017年11月氢溴酸伏硫西汀片在我国获得批准。目前，伏硫西汀已在美国、加拿大、澳大利亚和欧洲等70多个国家上市，批准适应症为治疗成人重性抑郁症。
氢溴酸伏硫西汀，CAS号：960203-27-4，化学名为1-[2-(2,4-二甲基苯硫基)苯基]哌嗪氢溴酸盐，结构式如下：
Figure BDA0003901179340000011
1-碘-2,4-二甲基苯，CAS号：4214-28-2，是合成氢溴酸伏硫西汀的重要起始物料，结构式如下式所示。
Figure BDA0003901179340000012
基于结构特性，其可能存在多个位置异构体，如下式所示。
Figure BDA0003901179340000013
在伏硫西汀的合成工艺过程中，上述1-碘-2,4-二甲基苯的异构体均可参与反应，最终衍生为伏硫西汀的异构体结构，依次如下式所示。
Figure BDA0003901179340000021
由于上述结构与伏硫西汀相似，性质相近，故在合成工艺过程中很难去除，从而可能影响终产品氢溴酸伏硫西汀的质量。
此类杂质在终产品中的控制限度要求为不得过0.1％。常规的反相色谱柱很难将四个异构体均分离良好。目前尚未检索到关于检测伏硫西汀四个位置异构体的反相高效液相色谱法的检测方法，专利CN202110192890.0采用苯基硅烷键合硅胶色谱柱，只满足异构体1与异构体4的分离，达不到伏硫西汀的控制需求。文献“氢溴酸沃替西汀有关物质的测定方法”(杜娟花等.氢溴酸沃替西汀有关物质的测定方法[J].安徽医药,2020,24(7):4.)提及的分析方法无法分离异构体3与伏硫西汀，亦达不到控制需求。传统的正相色谱条件，普遍存在灵敏度差的特点，即使分离了异构体杂质，也难以实现在同一色谱条件下将异构体杂质与其他相关杂质同时进行控制的目的。
此外，在伏硫西汀制备过程中会引入多种杂质，除上述难以去除的异构体外，其他相关工艺杂质和降解杂质如以下杂质1～11的分离测定同样需要进一步的研究，实现氢溴酸伏硫西汀的质量控制。
Figure BDA0003901179340000022
Figure BDA0003901179340000031
因此，建立一种稳定有效的氢溴酸伏硫西汀与其多个位置异构体的反相HPLC检测方法是非常必要的。
3、发明内容
本发明解决了现有技术中存在的不足，提供了一种反相HPLC测定方法，可实现伏硫西汀与其位置异构体的有效分离，同时可实现对其他相关工艺杂质和降解杂质的控制，操作简便，专属性、线性、精密度均良好，且溶液稳定，灵敏度高、准确度高、方法耐用性好，满足限度0.1％的控制需求，可用于氢溴酸伏硫西汀原料药的质量控制，满足氢溴酸伏硫西汀片的质量控制需求。
本发明提供了一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，所述异构体包括异构体1、异构体2、异构体3、异构体4，色谱条件包括：以六氟磷酸钾溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，以甲醇为流动相C，进行梯度洗脱。
优选的，色谱条件为：
检测器：UV检测器；
色谱柱：以纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂覆硅胶为填充剂的色谱柱；
流速：0.6ml/min；
柱温：25℃～35℃，优选30℃；
检测波长：226nm；
进样量：供试品进样量不低于2μg；
梯度洗脱程序：
Figure BDA0003901179340000041
优选的，所述的流动相A六氟磷酸钾溶液浓度为0.1mol/L～0.14mol/L，优选浓度为0.12mol/L；进一步的，所述的六氟磷酸钾溶液含0.1％(V/V)二乙胺；更进一步的，所述的六氟磷酸钾溶液用磷酸调pH值至1.8～2.2，优选pH值为2.0。
本发明进一步提供了一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，该方法能同时分离测定异构体1～异构体4和杂质1～杂质11。
本发明进一步提供了一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，该方法包括以下步骤：
(1)杂质贮备液的配制：分别取异构体1、异构体2、异构体3、异构体4、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10和/或杂质11的对照品各约2mg，分别置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各杂质贮备液。
(2)分离度溶液的配制：称取氢溴酸伏硫西汀约10mg，置25ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，加各杂质贮备液各约0.5ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)色谱实验：取分离度溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
步骤(3)中，采用反相高效液相色谱仪进行分析，色谱条件具体为：
检测器：UV检测器；
色谱柱：以纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂覆硅胶为填充剂的色谱柱，优选CHIRALCEL OJ-RH 4.6mm×150mm 5μm；
流动相：
流动相A：六氟磷酸钾溶液[浓度为0.1mol/L～0.14mol/L，优选浓度为0.12mol/L，其中，所述的六氟磷酸钾溶液含0.1％(V/V)二乙胺，所述的六氟磷酸钾溶液用磷酸调pH值至1.8～2.2，优选pH值为2.0，
流动相B：乙腈，
流动相C：甲醇；
流速：0.6ml/min；
柱温：25℃～35℃，优选30℃；
检测波长：226nm；
进样量：供试品进样量不低于2μg；
运行时间：75分钟；
梯度洗脱程序：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0 65 25 10
5 65 25 10
55 30 60 10
65 30 60 10
66 65 25 10
75 65 25 10
步骤(1)～(2)中所述溶剂为流动相A：B：C＝65︰25︰10。
本发明的有益技术效果为：
本发明采用纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂覆硅胶为填充剂的色谱柱，并使用六氟磷酸钾作为缓冲盐，使用混合有机相，通过筛选不同盐浓度以及有机相比例，可实现伏硫西汀与其四个位置异构杂质的有效分离，同时可实现对其他11种相关工艺杂质和降解杂质的控制，一个方法即可满足对伏硫西汀全部有关物质的控制。
4、附图说明
图1为实施例1中的氢溴酸伏硫西汀有关物质分离度溶液试验色谱图。
图2为实施例2中的氢溴酸伏硫西汀有关物质检查系统适用性试验图谱。
图3～7为实施例3中的氢溴酸伏硫西汀有关物质线性图。
图8为实施例6中的稳定性试验图谱。
图9为实施例7中的回收率试验图谱。
图10～12为实施例8中的不同pH值系统适应性溶液试验图谱。
图13～15为实施例8中的不同柱温系统适应性溶液试验图谱。
5、具体实施方式
下面详细描述本发明的具体实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
仪器及色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪，UV检测器；
色谱柱：CHIRALCEL OJ-RH 4.6mm×150mm 5μm；
流动相A：0.12mol/L六氟磷酸钾溶液[含0.1％(V/V)二乙胺，用磷酸调pH值至2.0)]；
流动相B：乙腈；
流动相C：甲醇；
溶剂：流动相A-流动相B-流动相C(65︰25︰10)；
流速：0.6ml/min；
柱温：30℃；
进样量：供试品进样量不低于2μg；
进样体积：10μl；
检测波长：226nm；
运行时间：75分钟；
梯度洗脱程序：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0 65 25 10
5 65 25 10
55 30 60 10
65 30 60 10
66 65 25 10
75 65 25 10
溶液配制：
各杂质贮备液的配制：分别取异构体1、异构体2、异构体3、异构体4、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10和杂质11的对照品各约2mg，分别置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各杂质贮备液。
Figure BDA0003901179340000061
Figure BDA0003901179340000071
分离度溶液的配制：称取氢溴酸伏硫西汀约10mg，置25ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，加各杂质贮备液各约0.5ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液的配制：称取氢溴酸伏硫西汀约10mg，置25ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，加杂质1、异构体3、异构体4的杂质贮备液各约0.5ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
供试品溶液的配制：取氢溴酸伏硫西汀约10mg，置25ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
实施例1分离度试验
仪器及色谱条件同上。
取各杂质储备液及分离度溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1、图1所示，分离度溶液中伏硫西汀峰与最近相邻杂质峰异构体4峰之间分离度为3.35，与主峰前异构体3峰达到基线分离，分离良好；各相邻杂质峰之间除异构体2峰与异构体3峰未达到基线分离，其余杂质间分离均大于2.0，表明方法的专属性良好。
表1峰定位及分离度试验结果
Figure BDA0003901179340000081
主峰前后相邻最近的杂质分别为异构体3峰和异构体4峰，保留最弱的杂质为杂质1，因此以此三个杂质作为系统适用性指标指示杂质。
实施例2系统适用性试验
仪器及色谱条件如上。
取系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表2、图2。
表2系统适用性试验试验结果
Figure BDA0003901179340000082
Figure BDA0003901179340000091
结果：系统适用性溶液色谱图中，氢溴酸伏硫西汀与异构体3、异构体4均分离良好。
实施例3线性试验
氢溴酸伏硫西汀贮备液：精密称取氢溴酸伏硫西汀对照品约10mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
异构体1贮备液的制备：精密称取异构体1对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
异构体3贮备液的制备：精密称取异构体3对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
异构体4贮备液的制备：精密称取异构体4对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
线性贮备液I：精密量取氢溴酸伏硫西汀贮备液、异构体1贮备液异构体3贮备液及异构体4贮备液各2ml，置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
精密量取线性贮备液I 2.5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性1溶液I。
精密量取线性贮备液I 2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分别置4个不同的50ml量瓶中用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性2～线性5溶液I。
定量限溶液I：精密量取异构体1贮备液各40μl、异构体3贮备液40μl、异构体4贮备液80μl和氢溴酸伏硫西汀贮备液50μl，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液I。
异构体2贮备液的制备：精密称取异构体2对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
线性贮备液II：精密量取异构体2贮备液2ml，置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
精密量取线性贮备液II 2.5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性1溶液II。
精密量取线性贮备液II 2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分别置4个不同的50ml量瓶中用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性2～线性5溶液II。
定量限溶液II：精密量取异构体2贮备液50μl，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液II。
精密量取上述系列溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积对浓度作曲线，用最小二乘法计算回归方程及相关系数。结果如表3及图3～图7所示，结合定量限试验结果，伏硫西汀及其四个异构体的线性均良好。
表3氢溴酸伏硫西汀有关物质线性试验结果
样品名称 浓度范围(μg/ml) 线性方程 相关系数
伏硫西汀 0.100～1.605 y＝58005x+342.33 r＝0.9999
异构体1 0.069～1.382 y＝57476x+388.08 r＝0.9999
异构体2 0.124～1.491 y＝59147x-148.28 r＝1.0000
异构体3 0.071～1.423 y＝63861x-534.01 r＝0.9999
异构体4 0.136～1.358 y＝61711x-528.18 r＝0.9999
实施例4定量限、检测限试验
取各杂质贮备液各10μl，注入液相色谱仪，至测得各样品的响应值约为噪音信号的10倍高和3倍高，即为相应样品的定量限和检测限。结果见表4-5。
表4氢溴酸伏硫西汀有关物质检测限结果表
Figure BDA0003901179340000101
Figure BDA0003901179340000111
表5氢溴酸伏硫西汀有关物质定量限结果表
Figure BDA0003901179340000112
实施例5精密度试验
精密量取供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如表6所示，6次测定结果异构体3检出量一致(均为0.01％)，异构体4检出量一致(均为0.01％)，其他最大单个杂质检出量一致(均为0.01％)，总杂质检出量一致(均为0.04％)，结果表明：精密度试验结果良好。
表6精密度试验结果
Figure BDA0003901179340000113
实施例6溶液稳定性试验
取供试品溶液，于室温自然光下放置，分别于0、2.5、5、7.5、10、24小时时，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，与0小时比较，分别计算供试品溶液色谱图中异构体3、异构体4、其他最大单个杂质及总杂质检出量的变化率，并报告有无大于报告限的新色谱峰。结果如表7，图8所示，供试品溶液在室温自然光条件下24小时内稳定。
表7稳定性试验结果
Figure BDA0003901179340000121
实施例7回收率试验
杂质贮备液A：精密量取杂质1贮备液、异构体3贮备液及异构体4贮备液各2ml，置同一100ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
回收率-定量限溶液：精密量取杂质1贮备液、异构体4贮备液各80μl及异构体3贮备液40μl，置同一100ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
回收率-0.05％溶液：精密量取杂质贮备液A 2.5ml，置50ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
回收率-0.10％溶液：精密量取杂质贮备液A 5.0ml，置50ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
回收率-0.15％溶液：精密量取杂质贮备液A 7.5ml，置50ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
精密量取回收率-定量限、回收率0.05％、回收率0.1％、回收率0.15％溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。回收率供试品溶液中杂质1、异构体3及异构体4的峰面积，扣除空白溶液本底值后，计算异构体3及异构体4的检出量，计算回收率，并计算结果的相对标准偏差。结果如表8、图9所示，在定量限、0.05％、0.10％、0.15％的四个浓度下，杂质1、异构体3及异构体4的加样回收率试验结果均良好。
表8加样回收率试验结果
Figure BDA0003901179340000122
Figure BDA0003901179340000131
实施例8耐用性试验
采用不同柱温、不同流动相pH值来测定本品的有关物质，考察方法的耐用程度。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
灵敏度试验溶液：精密量取对照溶液5ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液、灵敏度溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，在既定色谱条件的基础上，分别采用不同柱温、不同流动相pH值来测定本品的有关物质，比较测定结果，结果如表9-10，图10～15所示，采用柱温在25～35℃范围内，流动相A pH值在1.8～2.2范围内，异构体3与伏硫西汀峰的分离度及异构体4与伏硫西汀峰的分离度均大于1.5，灵敏度溶液信噪比均大于10；按加校正因子的主成分自身对照法分别计算杂质1、异构体3、异构体4、其他单个杂质和总杂质检出量，测定结果基本一致，方法的耐用性良好。
表9耐用性试验结果(系统适用性、相对保留时间)
Figure BDA0003901179340000132
Figure BDA0003901179340000141
注：*表示初始条件
表10耐用性试验结果(杂质检出量)
Figure BDA0003901179340000142
注：*表示初始条件

Claims (9)

1.一种同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，所述异构体包括异构体1、异构体2、异构体3、异构体4，其特征在于，色谱条件包括：色谱柱为CHIRALCEL OJ-RH，流动相组成为以六氟磷酸钾溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，以甲醇为流动相C，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0004158548000000011
2.根据权利要求1所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，该方法还能同时分离测定下式所示的杂质1～杂质11：
Figure FDA0004158548000000012
Figure FDA0004158548000000021
3.根据权利要求2所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)杂质贮备液配制：分别取异构体1、异构体2、异构体3、异构体4、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10和/或杂质11的对照品适量，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得各杂质贮备液；
(2)分离度溶液配制：称取氢溴酸伏硫西汀适量，加溶剂适量使溶解，加各杂质贮备液各适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得分离度溶液；
(3)色谱实验：取分离度溶液适量，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
4.根据权利要求1或2所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，色谱条件还包括：
检测器：UV检测器；
流速：0.6ml/min；
柱温：25℃～35℃；
检测波长：226nm；
进样量：供试品进样量不低于2μg。
5.根据权利要求1或2所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，所述流动相A含0.1％(V/V)二乙胺。
6.根据权利要求1或2所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，所述流动相A用磷酸调pH值为1.8～2.2。
7.根据权利要求6所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，所述流动相A的pH值为2.0。
8.根据权利要求1或2所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，所述流动相A的浓度为0.1mol/L～0.14mol/L。
9.根据权利要求4所述的同时测定氢溴酸伏硫西汀中多个位置异构体的反相HPLC方法，其特征在于，所述柱温为30℃。
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