CN117705987A - 一种乌帕替尼中间体中相关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乌帕替尼中间体中相关物质的检测方法，涉及药物分析技术领域，是采用高效液相色谱法进行检测；所述色谱检测条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：流动相A为pH＝6.0‑8.0的磷酸二氢盐溶液，流动相B为甲醇；洗脱方式：梯度洗脱；采用紫外检测，检测波长为230‑250nm。本发明通过色谱条件筛选，能够同时检测出乌帕替尼中间体合成中可能引入的3种杂质成分，分离度高，方法专属性强，为乌帕替尼中间体的质量控制、杂质研究提供了一种简便合理的检测方法，该方法适用于乌帕替尼中间体中有关物质的测定和样品检验。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种乌帕替尼中间体中相关物质的检测方法。
背景技术
乌帕替尼是一种高效、有选择性的JAK1抑制剂，用于治疗一些自身免疫性疾病如治疗特应性皮炎、风湿性关节炎、银屑病、溃疡性结肠炎等。其中，乌帕替尼中间体，N-[5-[(4-甲基苯基)磺酰基]-5H-吡咯并[2,3-B]吡嗪-2-基]氨基甲酸乙酯(CAS号：1869118-24-0，分子量：360.39，分子式：C16H16N4O4S)是制备乌帕替尼的重要起始物料。
目前，乌帕替尼中间体合成工艺如下所示：
合成过程中可能引入的副产物及杂质主要有以下所列出的杂质A(IMA)、杂质B(IMB)和杂质C(IMC)。
乌帕替尼中间体中所含杂质以及这些杂质在后续反应中的转化产物可能会带入到原料药中，从而直接影响原料药乌帕替尼的质量和安全。因此，杂质含量控制是保证药品安全可靠的一个重要质量控制指标。
目前，中国药典及国外药典未收录乌帕替尼中间体中上述有关物质测定方法，现有技术中也未有相关报道和研究。因此，有必要建立一种快速、精确检测乌帕替尼中间体中杂质A、杂质B、杂质C等杂质的方法，以实现简便、快速、精准控制乌帕替尼中间体质量的目的。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种乌帕替尼中间体中相关物质的检测方法。
本发明提出的一种乌帕替尼中间体中相关物质的检测方法，所述乌帕替尼中间体的结构式如式(Ⅰ)所示：
其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测；
所述色谱检测条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：流动相A为pH＝6.0-8.0的磷酸二氢盐溶液，流动相B为甲醇；
洗脱方式：梯度洗脱；
采用紫外检测，检测波长为230-250nm。
进一步地，所述相关物质包括：
杂质A：
杂质B：
杂质C：
进一步地，所述色谱柱选自Agilent Eclipse XDB C18；规格为5μm，250mm x4.6mm。
进一步地，所述梯度洗脱程序为：0-15min，流动相中流动相A的体积百分占比由55-65％逐步递减至25-35％；15-30min，流动相A的体积百分占比由25-35％逐步递减至5-15％；30-40min，流动相A的体积百分占比为5-15％；40-41min，流动相A的体积百分占比由5-15％递增至55-65％；41-50min，流动相A的体积百分占比为55-65％。
优选地，所述梯度洗脱程序为：0-15min，流动相中流动相A的体积百分占比由60％逐步递减至30％；15-30min，流动相A的体积百分占比由30％逐步递减至10％；30-40min，流动相A的体积百分占比为10％；40-41min，流动相A的体积百分占比由10％递增至60％；41-50min，流动相A的体积百分占比为60％。
进一步地，所述磷酸二氢盐溶液为磷酸二氢钾溶液，其浓度为10-30mmol/L，用氢氧化钾调节pH至6.0-8.0。
进一步地，所述流速为0.8-1.2mL/min，柱温为30-45℃，进样体积为10-20μL。
本发明中，流速优选1mL/min，柱温优选40℃、进样体积优选10μL。
本发明中，所述自动进样室温度为4-30℃，优选25℃。
进一步地，所述检测方法包括以下步骤：
S1、配制相关杂质对照品单标溶液：精密称取各相关杂质对照品，分别置于不同容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，配制成各相关杂质对照品单标溶液；
S2、配制乌帕替尼中间体对照品溶液：精密称取乌帕替尼中间体对照品，置于容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，得到乌帕替尼中间体对照品溶液；
S3、配制线性检测溶液：精密量取各相关杂质对照品单标溶液和乌帕替尼中间体对照品溶液，混合，加稀释剂进行稀释，配制成线性检测溶液，采用高效液相色谱法进行检测，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
S4、配制供试品溶液：将乌帕替尼中间体供试品用稀释剂溶解，配制成供试品溶液，采用高效液相色谱法进行检测，根据线性回归方程计算样品中各相关杂质的含量。
优选地，所述稀释剂为乙腈。
优选地，所述供试品溶液中乌帕替尼中间体的浓度为0.1-2.0mg/mL。
有益效果：本发明提出了一种乌帕替尼中间体中相关物质的检测方法，通过色谱条件筛选，能够同时检测出乌帕替尼中间体合成中可能引入的3种杂质成分，分离度高，方法专属性强，为乌帕替尼中间体的质量控制、杂质研究提供了一种简便合理的检测方法，该方法适用于乌帕替尼中间体中有关物质的测定和样品检验。
附图说明
图1为本发明实施例1中的供试品溶液色谱图；
图2为本发明实施例1中的乌帕替尼中间体杂质加样溶液色谱图；
图3为乌帕替尼中间体的线性回归方程；
图4为杂质A的线性回归方程；
图5为杂质B的线性回归方程；
图6为杂质C的线性回归方程。
具体实施方式
本发明中，乌帕替尼中间体(记作A3)的结构式如式(Ⅰ)所示：
乌帕替尼中间体合成过程中可能会引入以下3种杂质成分：杂质A、杂质B、杂质C；结构式如下所示：
杂质A(记作IMA)：
杂质B(记作IMB)：
杂质C(记作IMC)：
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明乌帕替尼中间体有关物质检测方法：
1.检测仪器及检测条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260Infinity；Agilent 1260DAD；
色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18(5μm，250mm x 4.6mm)；
流动相：流动相A为20mM磷酸二氢钾溶液(pH＝7.0)，流动相B为甲醇；
流速：1mL/min；
检测波长：240nm；
柱温：40℃。
洗脱梯度为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 60 | 40 |
| 15 | 30 | 70 |
| 30 | 10 | 90 |
| 40 | 10 | 90 |
| 41 | 60 | 40 |
| 50 | 60 | 40 |
2.溶液配制：
供试品溶液配制：取乌帕替尼中间体样品，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.5mg/mL的浓度；
杂质对照品母液：取杂质A、杂质B、杂质C对照品，精密称定，分别置于不同量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为125μg/mL、125μg/mL、125μg/mL的溶液，即为各杂质对照品溶液母液；
乌帕替尼中间体杂质加样溶液配制：精密量取供试品溶液和各杂质对照品溶液母液，置量瓶中混合，用供试品溶液稀释至刻度，摇匀，即得分别含乌帕替尼中间体0.5mg/ml、杂质A1μg/ml、杂质B1μg/ml、杂质C1μg/ml的溶液。
3.测定方法：
分别取供试品溶液和乌帕替尼中间体杂质加样溶液各10μL注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图，结果见图1和图2。
从图中可以看出，乌帕替尼中间体主峰保留时间约为18分钟左右，检测时间较为合适，3种已知杂质均能得到有效的检测，分离度均符合要求(大于1.5)，测定方法专属性强。计算结果见下表1。
表1乌帕替尼中间体杂质加样溶液色谱图数据
| 名称 | 保留时间/min | 相对保留时间 | 分离度 |
| 乌帕替尼中间体 | 19.111 | 1.000 | / |
| 杂质A | 26.428 | 1.383 | 31.164 |
| 杂质B | 26.712 | 1.398 | 1.853 |
| 杂质C | 27.869 | 1.458 | 5.044 |
实施例2：
1.检测仪器与色谱条件：同实施例1。
2.溶液配制：同实施例1。
3.测定方法
采用以上检测方法，对方法的线性、检测线、定量限、线性、重复性、准确度、稳定性等进行考察，具体操作及结果如下.
溶液配制：
杂质A贮备液：精密称取杂质A对照品约12.5mg置100ml量瓶中，加入乙睛溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含125μg的溶液。
杂质B贮备液：精密称取杂质B对照品约12.5mg置100ml量瓶中，加入乙睛溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含125μg的溶液。
杂质C贮备液：精密称取杂质C对照品约12.5mg置100ml量瓶中，加入乙睛溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含125μg的溶液。
混合杂质贮备液：取上述各杂质储备液1mL至同一10mL容量瓶中，加入乙腈稀释至刻度，摇匀，配制成各杂质浓度为12.5μg/ml的溶液；
乌帕替尼中间体贮备液：精密称取乌帕替尼中间体对照品约12.5mg置100ml量瓶中，加入乙睛溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含125μg的溶液。
线性贮备液(250％限度，LR0):精密量取上述各杂质贮备液及乌帕替尼中间体贮备液各1ml置50ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含杂质A、杂质B、杂质C和乌帕替尼中间体各2.5μg作为线性贮备液。
线性溶液配制：移取不同体积的线性贮备液配制而成，分别配制成各杂质浓度为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5μg/ml的系列线性溶液。
(1)检测线与定量限
利用信噪比法测定乌帕替尼中间体及杂质的检测线和定量限。取乌帕替尼中间体贮备液和各杂质贮备液混合，稀释至一定浓度并进样，得到信噪比(S/N)约为10的样品浓度为定量限，信噪比(S/N)约为3的样品浓度为检测限，结果见表2。
表2检测限和定量限数据
结论：本方法对各杂质的检测灵敏度均较高，能准确控制各杂质的含量。
(2)线性
在杂质A、杂质B和杂质C的定量限至定量限浓度的150％内选取若干个浓度点测定线性范围，具体的，分别以杂质的定量限浓度为基准(100％)，配制100％、110％、120％、130％、140％、150％定量限浓度的杂质线性溶液，进样检测。
分别进样并记录色谱图，各浓度溶液各进样1针，进样顺序由浓度低到高，每次样品检测3次；以峰面积对质量浓度按最小二乘法进行线性回归，得到乌帕替尼中间体及杂质的线性回归方程，结果见表3和图3-6。
表3线性数据
| 组分名称 | 线性方程 | 线性范围 | 线性系数r |
| 乌帕替尼中间体 | y＝30.668x+2.8242 | (1.0～1.5)μg/ml | 0.9998 |
| 杂质A | y＝25.027x+0.6264 | (1.0～1.5)μg/ml | 0.9991 |
| 杂质B | y＝9.5708x+0.138 | (1.0～1.5)μg/ml | 0.9953 |
| 杂质C | y＝31.301x+1.8147 | (1.0～1.5)μg/ml | 0.9984 |
在本发明检测方法下，乌帕替尼中间体及3个杂质在线性浓度范围内与峰面积的线性回归关系良好。
(3)校正因子
主成分与杂质回归直线斜率之比为杂质的校正因子，根据实施例2中得到的乌帕替尼及杂质的线性回归方程可得，其中相对响应因子与校正因子互为倒数关系，结果如下表4。
表4
| 编号 | 乌帕替尼中间体 | 杂质A | 杂质B | 杂质C |
| 斜率 | 30.668 | 25.027 | 9.5708 | 31.301 |
| 校正因子 | / | 1.23 | 3.20 | 0.98 |
| 相对响应因子 | / | 0.82 | 0.31 | 1.02 |
结论：杂质A和杂质B的相对响应因子均不在0.9～1.1之间，可采用加校正因子的面积归一化法计算供试品溶液中杂质的含量；杂质C的相对响应因子在0.9～1.1之间，可采用不加校正因子的面积归一化法计算供试品溶液中杂质的含量。
(4)准确度
采用加样回收率方法评价方法的准确度，杂质A、杂质B、杂质C的限度均为0.20％。
准确度溶液：取乌帕替尼中间体供试品12.5mg，精密称定，共6份，分别置25ml容量瓶中；精密量取混合杂质贮备液(12.5μg/ml)2ml、3ml，分别加入上述25ml容量瓶中，分别得到100％加杂供试品溶液和150％加杂供试品溶液，各浓度平行3份，测定各杂质含量。测得结果与实际结果之间的比值，即回收率，结果如下表5所示。
表5
结论：两个不同浓度供试品溶液下各杂质的回收率较好，本方法测定的乌帕替尼中间体中杂质的回收率相对标准偏差较小，准确度较高。
(5)重复性
精密称取乌帕替尼中间体供试品12.5mg于25ml容量瓶中，加入2.0ml混合杂质贮备液(12.5μg/ml)，用乙腈溶解并稀释至刻度线，混匀，平行配制6份(每1ml中约含杂质A、杂质B、杂质C各1.0μg及乌帕替尼中间体0.5mg的溶液)；测定，计算各杂质含量，结果见表6。
表6
| 名称 | 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 | 样品6 | RSD(％) |
| 杂质A(％) | 0.183 | 0.191 | 0.180 | 0.185 | 0.180 | 0.186 | 2.27 |
| 杂质B(％) | 0.195 | 0.224 | 0.179 | 0.195 | 0.176 | 0.192 | 8.79 |
| 杂质C(％) | 0.231 | 0.250 | 0.239 | 0.231 | 0.240 | 0.234 | 3.04 |
| 总杂质(％) | 0.61 | 0.66 | 0.60 | 0.61 | 0.60 | 0.61 | 4.11 |
| 杂质个数 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | / |
结论：采用本发明的方法，相对标准偏差小于10％，具有较好的可重复性。
(6)稳定性
将重复性试验中的测试溶液于0、2、4、6、8、10小时进行测定，记录色谱图，计算杂质含量，结果见表7。
表7
结论：供试品溶液在室温条件下分别于不同时间段进行检测，各杂质检出量无明显变化，且未检出新的杂质，说明本品在室温下放置10h，溶液稳定性良好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乌帕替尼中间体中相关物质的检测方法，所述乌帕替尼中间体的结构式如式(Ⅰ)所示：
其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测；
所述色谱检测条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：流动相A为pH＝6.0-8.0的磷酸二氢盐溶液，流动相B为甲醇；
洗脱方式：梯度洗脱；
采用紫外检测，检测波长为230-250nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相关物质包括：
杂质A：
杂质B：
杂质C：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述色谱柱选自Agilent Eclipse XDBC18；规格为5μm，250mm x 4.6mm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0-15min，流动相中流动相A的体积百分占比由55-65％逐步递减至25-35％；15-30min，流动相A的体积百分占比由25-35％逐步递减至5-15％；30-40min，流动相A的体积百分占比为5-15％；40-41min，流动相A的体积百分占比由5-15％递增至55-65％；41-50min，流动相A的体积百分占比为55-65％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0-15min，流动相中流动相A的体积百分占比由60％逐步递减至30％；15-30min，流动相A的体积百分占比由30％逐步递减至10％；30-40min，流动相A的体积百分占比为10％；40-41min，流动相A的体积百分占比由10％递增至60％；41-50min，流动相A的体积百分占比为60％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸二氢盐溶液为磷酸二氢钾溶液，其浓度为10-30mmol/L，用氢氧化钾调节pH至6.0-8.0。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述流速为0.8-1.2mL/min，柱温为30-45℃，进样体积为10-20μL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制相关杂质对照品单标溶液：精密称取各相关杂质对照品，分别置于不同容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，配制成各相关杂质对照品单标溶液；
S2、配制乌帕替尼中间体对照品溶液：精密称取乌帕替尼中间体对照品，置于容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，得到乌帕替尼中间体对照品溶液；
S3、配制线性检测溶液：精密量取各相关杂质对照品单标溶液和乌帕替尼中间体对照品溶液，混合，加稀释剂进行稀释，配制成线性检测溶液，采用高效液相色谱法进行检测，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
S4、配制供试品溶液：将乌帕替尼中间体供试品用稀释剂溶解，配制成供试品溶液，采用高效液相色谱法进行检测，根据线性回归方程计算样品中各相关杂质的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液中乌帕替尼中间体的浓度为0.1-2.0mg/mL。
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