CN114200067B - 一种6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及杂质的高效液相色谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种6‑溴‑3‑羟基吡嗪‑2‑甲酰胺及杂质的高效液相色谱分析方法，在高效液相色谱仪上，测定6‑溴‑3‑羟基吡嗪‑2‑甲酰胺的纯度和多个杂质的含量，主要由以下步骤组成：(1)取6‑溴‑3‑羟基吡嗪‑2‑甲酰胺原料，配制成适量浓度的样品溶液；同时稀释成浓度为1％的自身对照溶液；(2)分别取适量的样品溶液和自身对照溶液注入液相色谱仪；(3)采用反相色谱柱，以酸水溶液和有机溶剂为流动相进行梯度洗脱。本发明解决了未知杂质对6‑溴‑3‑羟基吡嗪‑2‑甲酰胺的干扰以及面积百分比法计算杂质含量不准确的缺点，具有操作简单、灵敏度高、重复性好、快速准确的优点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及杂质的高效液相色谱分析方法。
背景技术
6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺(6-Bromo-3-hydroxypyrazine-2-carboxamide)是常用的化工原料，其CAS号为：259793-88-9，分子式为C5H4BrN3O2，分子量为：218.01，化学结构为：
6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺作为一种常用的化工原料或医药中间体，广泛应用于化学原料药的制备与合成，可用来合成制备法匹拉韦原料药。法匹拉韦(Favipiravir)，化学名为6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺，由富山化学工业株式会社开发的核苷类抗病毒药物，于2014年3月在日本批准上市，用于治疗成人新型或复发型流行性感冒。法匹拉韦的合成方法有多种，其中多以6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺或其前体作为起始物料。
为了保证合成的法匹拉韦的质量，需要建立一个比较完善的方法检测6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度和其杂质含量。目前未见公开的关于6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度及杂质含量的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及杂质的高效液相色谱分析方法，高效、快速、准确地检测6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度及杂质含量，解决未知杂质对6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的干扰，以及面积百分比法计算杂质含量不准确的缺点。
具体技术方案如下：
一种6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及杂质的高效液相色谱分析方法，在高效液相色谱仪上，采用反相色谱柱，以酸水溶液为流动相A，有机溶剂为流动相B进行梯度洗脱，测定6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度和多个杂质的含量，其中，6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及杂质结构如下：
6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺：
杂质1：
杂质2：
为了增加6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺和已知杂质的保留，所述的反相色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶或苯基硅烷键合硅胶为填充剂，优选为以苯基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱。
进一步，所述的反相色谱柱填料粒径为3μm～5μm，色谱柱长为150mm～250mm，色谱柱直径为2.0mm～4.6mm；优选填料粒径为5.0μm，柱长为250mm，直径为4.6mm的色谱柱。
为了改善峰型，更好地分离主峰和杂质峰，所述流动相A为三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、磷酸水溶液中的一种；优选为磷酸水溶液，更优选的是0.05％的磷酸水溶液。
进一步，所述流动相B为甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃中的一种或多种；优选为甲醇和乙腈的混合溶液，乙腈：甲醇＝1:1～78:22(V/V)；更优选的是乙腈：甲醇＝78:22(V/V)的溶液。
进一步，所述的梯度洗脱程序为：
| 洗脱时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90～100 | 0～10 |
| 5 | 90～100 | 0～10 |
| 25 | 15～25 | 75～85 |
优选的洗脱程序为：
| 洗脱时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 5 | 95 | 5 |
| 25 | 20 | 80 |
进一步，采用紫外检测器，检测波长为220nm～240nm，优选230nm；
进一步，色谱柱柱温为25～35℃，优选30℃；
进一步，流动相流速为0.8ml/min～1.2ml/min，优选1.0ml/min；
进样体积：5μl。
所述的6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的高效液相色谱分析方法，主要由以下步骤组成：
(1)取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺原料，配制成适量浓度的样品溶液；同时稀释成浓度为1％的自身对照溶液；
(2)分别取样品溶液和自身对照溶液注入液相色谱仪；
(3)采用反相色谱柱，以酸水溶液和有机溶剂为流动相进行梯度洗脱；
(4)计算6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度，以及6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的杂质含量。
为了提高检测方法灵敏度，同时保证色谱柱的耐受性，优选样品配制成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约0.5mg/ml的供试品溶液，同时定量稀释成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约5μg/ml的自身对照溶液，量取5μl注入液相色谱仪。
采用的稀释剂为水和乙腈的混合溶液，水:乙腈＝95:5(V/V)。
有益效果：
1、通过本发明的方法，可以同时分析6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度及已知杂质含量，解决未知杂质对6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的干扰以及面积百分比法计算杂质含量不准确的缺点。
2、本发明操作简单、灵敏度高、重复性好，为6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度及杂质含量的测定提供了一种高效、快速、准确的分析方法。
附图说明
图1为实施例1待测杂质与样品的混合色谱图。
图2为实施例2待测杂质与样品的混合色谱图。
图3为实施例3待测杂质与样品的混合色谱图。
图4为实施例3色谱条件的空白色谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细描述，但本发明的实施方式并不限于此。除非另有说明，否则以下实施例中所用的试剂、材料及仪器均可通过常规商业手段获得。
实施例1
高效液相色谱仪：岛津LC-2010CHT，UV检测器
色谱柱：C18，4.6×150mm，3μm
流动相：A相：0.1％磷酸水
B相：乙腈:甲醇(1:1V/V)
洗脱梯度：
| 洗脱时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 10 | 10 | 90 |
| 13 | 10 | 90 |
检测波长：230nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。
供试品溶液和自身对照溶液配制：6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺原料适量，加初始流动相溶液溶解，配制成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约0.5mg/ml的供试品溶液，同时定量稀释成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约5μg/ml的自身对照溶液。检测结果：结果参见附图1，在本实施例中RT＝2.511min为杂质1的峰，RT＝5.331min为杂质2的峰；RT＝5.963min为6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的峰，其它均为未知杂质峰，各已知峰的保留较弱，主峰与其相邻的未知杂质峰的分离度为1.42，不符合分离度>1.5的要求。
实施例2
高效液相色谱仪：岛津LC-2010CHT，UV检测器
色谱柱：C18，4.6×150mm，3μm
流动相：A相：0.05％磷酸水
B相：乙腈:甲醇(2:1V/V)
洗脱梯度：
| 洗脱时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 5 | 95 | 5 |
| 25 | 20 | 80 |
| 28 | 20 | 80 |
检测波长：230nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。
供试品溶液和自身对照溶液配制：6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺原料适量，加初始流动相溶液溶解，配制成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约0.5mg/ml的供试品溶液，同时定量稀释成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约5μg/ml的自身对照溶液。检测结果：结果参见附图2，在本实施例中RT＝2.458min为杂质1的峰，RT＝7.947min为杂质2的峰，RT＝9.074min为6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的峰，其它均为未知杂质峰，杂质1保留较弱，主峰与其相邻的未知杂质峰的分离度为1.48，不符合分离度>1.5的要求。
实施例3
高效液相色谱仪：Agilent 1260，UV检测器
色谱柱：XDB-phenyl，4.6×250mm，5μm
流动相：A相：0.05％磷酸水
B相：乙腈:甲醇(78:22V/V)
洗脱梯度：
| 洗脱时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 5 | 95 | 5 |
| 25 | 20 | 80 |
| 28 | 20 | 80 |
检测波长：230nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。
供试品溶液和自身对照溶液配制：6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺原料适量，加初始流动相溶液溶解，配制成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约0.5mg/ml的供试品溶液，同时定量稀释成含6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺约5μg/ml的自身对照溶液。检测结果：结果参见附图3和附图4，在本实施例中RT＝3.488min为杂质1的峰，RT＝10.927min为杂质2的峰，RT＝12.954min为6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的峰，其它均为未知杂质峰。
专属性试验
稀释剂(空白溶液)：水:乙腈＝95:5(V/V)。
杂质定位溶液配制：分别取杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，分别加稀释剂溶解并稀释，制成每1ml中杂质1和杂质2的含量分别为约10μg和2.5μg的溶液，分别作为杂质1定位溶液、杂质2定位溶液。
系统适用性溶液配制：分别取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释，制成每1ml中6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2的含量分别为0.5mg、10μg和2.5μg的溶液，作为系统适用性溶液。
按实施例3的色谱条件，分别量取空白溶液、各杂质定位溶液、系统适用性溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。各化合物保留时间及分离度情况见表1。
表1 专属性试验结果
| 名称 | 保留时间(min) | 最小分离度 |
| 杂质1 | 3.488 | 30.71 |
| 杂质2 | 10.927 | 4.95 |
| 6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺 | 12.954 | 3.15 |
结论：在该色谱条件下，空白溶剂对主峰及杂质检测无干扰，各已知杂质之间、主峰与其相邻的未知杂质峰的分离度远大于1.5，本方法专属性好。
检测限与定量限试验
分别取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，加稀释剂逐级稀释，按实施例3的色谱条件分别进样，信噪比3:1时的样品浓度为检测限浓度，信噪比10:1时的样品浓度为定量限浓度。
结论：杂质1的检测限浓度为0.011μg/ml，相对含量0.0022％，定量限浓度为0.037μg/ml，相对含量0.0074％；杂质2的检测限浓度为0.043μg/ml，相对含量0.0086％，定量限浓度为0.14μg/ml，相对含量0.028％；6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的检测限浓度为0.025μg/ml，相对含量0.0049％，定量限浓度为0.082μg/ml，相对含量0.016％。实验结果显示，本方法灵敏度高。
线性试验
分别取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释，分别制成相对限度浓度的20％、50％、100％、150％、200％的线性溶液(L2～L6)。按实施例3的色谱条件分别进样，记录色谱图。以定量限浓度作为L1溶液，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性曲线。结果见表2～表4。
表2 杂质1线性试验结果
表3 杂质2线性试验结果
表4 6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺线性试验结果
结论：由上表可知，6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及各杂质在线性范围内，相关系数r不低于0.990，截距偏差低于2％，本方法线性关系良好。
校正因子计算
根据以上线性方程的斜率计算各杂质的校正因子，杂质1的校正因子为0.64，杂质2的校正因子为1.16。
精密度试验
重复性测试溶液配制：分别取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释，制成每1ml中6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2的含量分别为0.5mg、10μg和2.5μg的溶液，作为重复性测试溶液。
分别量取实施例3的供试品溶液、1％自身对照溶液、上述的重复性测试溶液，按实施例3的色谱条件分别进样，记录色谱图，计算回收率及重复性RSD。
结论：考察重复性及重现性试验结果可知，进样精密度RSD在1％以内；重复性测试溶液重复测定6次，6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺纯度及其杂质回收率测得结果的RSD在1％以内，不同实验室的重现性测得结果的RSD在3％以内。实验结果显示，本方法重复性好、精密度高。
准确度试验
80％回收率溶液配制：分别取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释，制成每1ml中6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2的含量分别为0.5mg、8μg和2μg的溶液，作为80％回收率溶液。
100％回收率溶液配制：分别取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释，制成每1ml中6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2的含量分别为0.5mg、10μg和2.5μg的溶液，作为100％回收率溶液。
120％回收率溶液配制：分别取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释，制成每1ml中6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺、杂质1和杂质2的含量分别为0.5mg、12μg和3μg的溶液，作为120％回收率溶液。
按实施例3的色谱条件，分别进样，记录色谱图，按加校正因子的自身对照法计算各杂质的回收率，结果见表5。
表5 6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺各杂质回收率结果
结论：本方法测得本品中各杂质的高中低3个浓度(限度浓度的80％、100％、120％的溶液)共9份样品，杂质1回收率结果在95％～105％之间，杂质2回收率结果在85％～108％范围内。结果符合方法学验证要求，本方法准确度良好。
溶液稳定性试验
按实施例3中的色谱条件，分别量取供试品溶液、自身对照溶液、系统适用性溶液，在24小时内，于室温放置0h、4h、8h、12h、18h、24h进样分析，各考察时间点测得的6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及各杂质峰面积均无明显变化，且没有新杂质产生。实验结果显示，溶液稳定性良好。
耐用性试验
在实施例3中的色谱条件的基础上，分别改变柱温25℃～35℃、流速0.9ml/min～1.1ml/min、流动相B的初始体积分数0％～10％、更换不同批次色谱柱，量取上述系统适用性溶液、供试品溶液和自身对照溶液进样分析，样品的测定结果均无明显变化；系统适用性溶液中各已知杂质之间、主峰与其相邻的未知杂质峰之间的分离度均大于1.5。实验结果显示，色谱条件有微小变化不会影响6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度及杂质的测定，本方法耐用性良好。
Claims (7)
1.一种6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及杂质的高效液相色谱分析方法，其特征在于：在高效液相色谱仪上，采用反相色谱柱，以磷酸水溶液或三氟乙酸水溶液为流动相A，体积比为78:22的乙腈和甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，所述的6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺及多个杂质结构如下：
6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺：
杂质1：
杂质2：
所述反相色谱柱参数为：XDB-苯基，4.6×250mm，5μm；色谱分析条件为：25℃～35℃的柱温、0.8mL/min～1.2mL/min的流动相流速、5μL的进样体积；220nm～240nm的检测波长；梯度洗脱程序如下：
。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的流动相A为磷酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述流动相A为0.05％磷酸水。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪为紫外检测器。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述检测波长为230nm。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，梯度洗脱程序如下：
柱温为30℃，流动相的流速为1.0ml/min。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)取6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺原料，用稀释剂溶解并配制成适量浓度的样品溶液；同时稀释成浓度为1％的自身对照溶液；其中所述稀释剂为水和乙腈的混合溶液；
(2)分别取样品溶液和自身对照溶液注入液相色谱仪；
(3)采用反相色谱柱，以酸水溶液和有机溶剂为流动相进行梯度洗脱；
(4)计算6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的纯度，以及6-溴-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺的杂质含量。
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