CN116879428B - 一种L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的高效液相分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析技术领域，具体公开了一种L‑α‑甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的高效液相分析方法。该检测方法选用高分子包被型的阳离子交换柱为分析柱；柱温为35℃～45℃；流速为0.6ml/min～1.5ml/min；流动相A为0.1％～0.5％的甲酸水溶液；流动相B为纯乙腈；稀释剂为超纯水，检测器选用电喷雾式(CAD)检测器，蒸发温度设置为高，进样室温度为室温；利用外标法计算L‑α‑甘磷酸胆碱供试品中磷酸胆碱的残留含量。本发明提供一种操作简便，准确度、精密度和灵敏度高，方法专属性和重现性好，便于标准化操作的高效液相分析的方法能使L‑α‑甘磷酸胆碱与磷酸胆碱得到完全的分离并能准确的定量。
Description
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及一种L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的高效液相分析方法。
背景技术
L-α-甘磷酸胆碱，英文名为L-α-glycerophosphoryl choline，简称L-α-GPC，L-α甘磷酸胆碱是机体内天然存在的磷脂代谢产物及乙酰胆碱和磷酸胆碱合成的胆碱源，具有相当重要的营养保健功能。现已作为膳食补充剂收载入美国药典USP42-NF38，L-α-甘磷酸胆碱已被证实能够改善脑部的认知功能，甚至很多报道称其可以修复早期阿尔兹海默病的退行性脑病。目前L-α-甘磷酸胆碱有两种来源，一种是天然提取，分离产物纯度低，成本较高；一种是化学合成，化学合成原料来源广泛，其纯度高，而高纯度的L-α-甘磷酸胆碱的化学结构及相关的物理特性，更有益于保护脑组织的新陈代谢。
而按照现有L-α-甘磷酸胆碱合成工艺路线，会有磷酸胆碱残留的可能，磷酸胆碱的毒理数据可查，所以在高纯的L-α-甘磷酸胆碱中需严格控制磷酸胆碱的残留量，为了更好的控制L-α-甘磷酸胆碱的质量，现将L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留量控制在不得过0.1％。
目前查到研究使用高效液相色谱-质谱法检测饮料中磷酸胆碱的含量的报道，但由于液相色谱-质谱法检测成本高；而磷酸胆碱没有显色基团，无法用紫外检测器检测到；且高纯度L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留控制限度远远小于物料本身的含量，通用型蒸发光检测器灵敏度达不到限度要求；且用高效液相-蒸发光检测器在同一色谱条件下，L-α-甘磷酸胆碱与磷酸胆碱物质的极性相近，普通的硅胶填料，十八烷基硅烷键合填料、辛烷基硅烷键合填料的色谱柱均无法实现两种物质的有效分离。因此在限值L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留时需要采用多种不同的检测手段进行控制，方法耗时长、检测成本高、且无法实现磷酸胆碱残留低限度检测。因此，开发一种L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的检测法成为亟待解决的课题。
发明内容
本发明克服了不同途径控制磷酸胆碱残留含量技术的不足，具有操作简便，试剂试液易得，分离度高，可快速通过外标法定量磷酸胆碱的含量，具有准确性、灵敏性、重现性、稳定性高的优点，检测成本大大降低。
本发明的目的在于提供一种HPLC-CAD法测定L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的检测方法，该方法采用HPLC法(等度洗脱、电喷雾式检测器)进行检测，经高分子包被型的阳离子交换柱作为分析柱，电喷雾式检测器检测，可实现L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的快速测定。
本发明的技术方案如下：试样经超纯水或甲醇溶解经微孔滤膜后注入高效液相色谱仪，在设置仪器参数条件下采集并记录色谱图，外标法定量计算；其中设置仪器条件为高分子包被型的阳离子色谱柱分离，柱温为35℃～45℃，流动相体积比为5～9的0.1％～0.5％的甲酸水溶液和5～1的乙腈等度洗脱，流速为0.6～1.5ml/min，进样体积为20μl～30μl，检测器为电喷雾式检测器。
本发明提供的一种L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱含量的高效液相分析方法，所述方法包括如下步骤：
(1)分别配制好供试品溶液和对照品溶液、灵敏度溶液、系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中，其色谱条件为：选用高分子包被型的阳离子交换柱为分析柱，柱温为35℃～45℃，流速为0.6ml/min～1.5ml/min，流动相选择0.1％～0.5％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，以流动相A：流动相B体积比为5～9:5～1等度洗脱，稀释剂为纯水。
(2)选用电喷雾式检测器，检测蒸发温度设置为高。
(3)利用外标法计算供试品溶液中磷酸胆碱的残留含量。
优选的，本发明采用规格为250×4.6mm 5μm的CAPCELL PAK SCX UG80S5色谱柱。
优选的，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。
优选的，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，运行时间为15min。
本发明中供试品溶液、对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液配制方法如下：
(1)供试品溶液的制备：取L-α-甘磷酸胆碱供试品，用纯水溶解稀释制成含L-α-甘磷酸胆碱100mg/ml的供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取磷酸胆碱对照品，用纯水溶解稀释制成含磷酸胆碱100μl/ml的对照品溶液。
(3)灵敏度溶液的制备：移取磷酸胆碱对照品储备液，用纯水稀释制成含磷酸胆碱20μl/ml的灵敏度溶液
本发明中还包括高效液相系统适用性溶液，取L-α-甘磷酸胆碱与磷酸胆碱适量，用纯水溶解制成含L-α-甘磷酸胆碱100mg/ml和含磷酸胆碱100μg/ml的混合溶液，为系统适用性溶液。
本发明所称的测定方法，优选包括：
分别量取系统适用性溶液、灵敏度溶液各30μl注入液相色谱仪，记录色谱图，标记L-α-甘磷酸胆碱和磷酸胆碱的保留时间，并记录两物质的分离度，记录灵敏度溶液中磷酸胆碱峰的信噪比。
精密量取对照品溶液30μl注入液相色谱仪，重复6次，记录色谱图，以峰面积计算相对标准偏差。精密量取供试品溶液，记录色谱图，以峰面积计用外标法定量磷酸胆碱的残留含量。
有益效果：
1、本发明采用电喷雾式检测器检测，该检测器灵敏度高，成本低，易获得，实现了高纯度L-α-甘磷酸胆碱中低限量磷酸胆碱的有效控制；
2、本发明以流动相A：流动相B＝6:4为流动相等度洗脱，避免了现有以水为流动相，双泵高压梯度洗脱的液相检测，对色谱柱损耗小，检测费用降低；
3、本发明具有非常高的准确性、精密性、稳定性，操作简单、方便，可实现L-α-甘磷酸胆碱中微量磷酸胆碱的快速定量，大大节约检测时间和成本。
附图说明
图1是本发明溶剂的HPLC-CAD图谱；
图2是本发明系统适用性溶液HPLC-CAD图谱；
图3是本发明灵敏度溶液HPLC-CAD图谱；
图4是本发明对照品溶液HPLC-CAD图谱；
图5是本发明供试品溶液HPLC-CAD图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
一种L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的高效液相分析方法。
1、色谱条件为色谱柱：CAPCELL PAK SCX UG80 S5 250×4.6mm 5μm；柱温：40；流速：1.0/min；电喷雾式检测器，蒸发温度设置为高；进样量：30μl。选用高效液相色谱仪。
2、溶液制备
2.1流动相：流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：乙腈
流动相A：流动相B＝6:4等度洗脱，运行时间为15min。
2.2稀释剂：超纯水。
2.3供试品溶液：精密称取L-α-甘磷酸胆碱，用纯水溶解并稀释制成含L-α甘磷酸胆碱100mg/ml的溶液，作为供试品溶液，平行制备。
2.4对照品溶液：精密称取磷酸胆碱对照品，用纯水溶解并稀释制成含磷酸胆碱100μg/ml的溶液，作为作为对照溶液，平行制备。
2.5灵敏度溶液：精密量取磷酸胆碱对照品储备溶液，用纯水稀释制成20μg/ml的溶液，作为灵敏度溶液。
2.6系统适用性溶液：称取L-α-甘磷酸胆碱与磷酸胆碱各适量，用纯水溶解并稀释制成含L-α-甘磷酸胆碱100mg/ml，磷酸胆碱100μg/ml的混合溶液，作为系统适用性溶液。
3、测定方法
按照1中色谱条件，分别精密量取2中系统适应性溶液、对照品溶液、灵敏度溶液、供试品溶液各30μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算磷酸胆碱的含量。
高效液相系统适应性试验：磷酸胆碱对照品溶液6次重复进样，以确定检测系统的重复性；1次灵敏度溶液检测，以确定电喷雾式检测器的灵敏程度；1次系统性溶液进样，以确定L-α-甘磷酸胆碱与磷酸胆碱的分离效果。由图1纯水空白溶剂可知不干扰磷酸胆碱的检测，由图2可知磷酸胆碱与相邻杂质峰完全分离，其他物质不干扰磷酸胆碱的检测；由图3可知电喷雾式检测器灵敏度信噪比S/N＝131可达到检测灵敏度的要求；图4对照品溶液连续进样6次，相对标准偏差＝3.4％可知检测系统稳定，可达到检测需求；图5可知L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱可被检测出并能被准确定量。
按外标法以峰面积计算磷酸胆碱的残留含量。
计算公式为
式中：
āSTD1：6针对照品溶液1磷酸胆碱杂质峰面积的平均值；
ASap：供试品溶液中磷酸胆碱杂质峰面积；
CSTD1：磷酸胆碱对照品溶液1浓度，μg/ml；
CSap：供试品溶液浓度，mg/ml；
P：磷酸胆碱对照品纯度，％
为了进一步验证本方法的可行性，还进行了以下试验：
(1)专属性试验
根据物质性质，分别取纯水、L-α-甘磷酸胆碱供试品溶液、L-α-甘磷酸胆碱与磷酸胆碱混合溶液、磷酸胆碱对照品溶液分别进样。纯水作为稀释剂在磷酸胆碱目标物保留时间位置处无干扰峰；L-α-甘磷酸胆碱与磷酸胆碱混合溶液中，L-α-甘磷酸胆碱供试品溶液中与磷酸胆碱对照品溶液中目标杂质峰的保留时间一致，且目标杂质峰磷酸胆碱与相邻杂质峰的分离度均≥1.5，分离度良好。
(2)检测限及定量限
储备溶液：称取磷酸胆碱对照品25.14mg，置5ml量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即为储备液。
定量限溶液：精密移取磷酸胆碱对照品储备液20μl，置5ml量瓶中，加纯水稀释定容至刻度，即得。
检测限溶液：精密移取磷酸胆碱对照品储备液10μl，置5ml量瓶中，加纯水稀释定容至刻度，即得。
检测限测定结果：检测溶液浓度为9.9554μg/ml(相当于供试品中的含量99.6ppm)，连续进样3针信噪比S/N均≥3
定量限测定结果：定量限浓度为19.9109μg/ml(相当于供试品中的含量199.1ppm)，检测结果见表1：测试溶液浓度为19.9109μg/ml时，重复进样6针，S/N均大于10，能被准确定量。
表1定量限测定结果
(3)线性与范围试验
线性储备溶液：称取磷酸胆碱对照品25.14mg，置5ml量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即为储备液。
配制各浓度水平线性溶液如表2所示。
表2水平线性溶液配制
| 水平(％) | 稀释过程 |
| 20％(定量限) | 移取线性储备液20μl→5ml，加水定容 |
| 50％ | 移取线性储备液50μl→5ml，加水定容 |
| 100％ | 移取线性储备液100μl→5ml，加水定容 |
| 150％ | 移取线性储备液150μl→5ml，加水定容 |
| 200％ | 移取线性储备液200μl→5ml，加水定容 |
测试结果如表3所示：线性方程Y＝0.0263X+0.5226，相关系数(r)＝0.997。磷酸胆碱在浓度19.9109μg/ml～199.1088μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度有良好的线性关系。
表3线性测试结果
(4)回收率(准确度)试验
供试品溶液：分别取L-α-甘磷酸胆碱约500.93mg，501.98mg，精密称定，置5ml量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，即得本底供试品溶液。
磷酸胆碱储备溶液：称取磷酸胆碱对照品25.14mg，置5ml量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即为磷酸胆碱对照品储备液。
加标回收率溶液：分别称取L-α-甘磷酸胆碱样品约500mg，9份，分别配制低浓度、中浓度、高浓度加标供试品混合溶液，即得到80％、100％、120％的回收率加标供试品溶液，每个浓度级别各配制3份，按照的检测方法分别测定回收率，结果如表4所示：三个浓度下，低限量磷酸胆碱的回收率在80％～120％之间，各浓度回收率的RSD值≤10.0％，证实该方法磷酸胆碱低浓度限量检测准确度良好。
表4加标回收率测试结果
(5)重复性试验
取6份中浓度水平的加标供试品溶液作为重复性溶液，结果如表5所示：重复进样6次加标供试品溶液中，磷酸胆碱相对于供试品含量RSD值为0.7％，可见该方法重复性良好。
表5重复性试验结果
(6)中间精密度试验
在不同日期，由不同化验员，与重复性溶液同法制备中间精密度溶液，结果如表6所示：6次中间精密度RSD值为1.7％(标准规定≤10.0)，中间精密度良好。
表6中间精密度试验结果
(7)溶液稳定性
磷酸胆碱对照品溶液：称取磷酸胆碱对照品25.14mg，置5ml量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为磷酸胆碱对照品储备液，精密量取储备液100μl，置5ml量瓶中，加纯水稀释至刻度，即得。
中浓度加标供试品溶液：称取L-α-甘磷酸胆碱500.49mg，精密称定，加水适量使溶解，量取磷酸胆碱对照品储备液100μl，置同一量瓶中，加水稀释至刻度，即得。
在室温下放置，分别在0时，4时，8时，12时进样，计算目标杂质峰的变化，见表7：各时间点磷酸胆碱杂质峰面积相对于0时磷酸胆碱杂质峰面积比在80％～120％之间，证实L-α-甘磷酸胆碱溶液中磷酸胆碱在12小时内稳定性良好。
表7溶液稳定性结果
(8)方法的耐用性试验
在本方法规定的色谱条件，尝试了对柱温、流速进行微调，样品中磷酸胆碱残留含量计算结果均在验证方案要求范围内，改变柱温、流速的情况下，系统适应性均符合要求，不同耐用性条件下残留磷酸胆碱含量RSD＝3.7％(规定≤10.0％)，证实该发明方法耐用性良好。
实施例2
等度洗脱时流动相中成分配比的选择
其他条件同实施例1，采用流动相A相0.1％甲酸水溶液和流动相B相乙腈，双泵等度洗脱、电喷雾式检测器；洗脱运行时间15分钟，流动相比例为：流动相A：流动相B＝7:3；该色谱条件下供试品溶液中L-α-甘磷酸胆碱的色谱峰严重拖尾，干扰目标杂质磷酸胆碱的低限量检测。无法进行准确检测检测。
实施例3
检测器的选择
其他条件同实施例1，采用蒸发光检测器，漂移管温度为85℃，载气流量为2.0L/min，L-α-甘磷酸胆碱供试品溶液浓度为100mg/ml时，残留磷酸胆碱的无法检测到供试品溶液含量的0.1％的限度，蒸发光检测器灵敏度无法实现磷酸胆碱0.1％的检测。
由此可见，相比高效液相-蒸发光检测器检测方法、高效液相-质谱检测方法，本发明的分析方法灵敏度非常高，检测成本低、检测器易获得，可方便、快速的定量出L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱杂质残留含量，且可应用于L-α-甘磷酸胆碱产品产业化的质量控制，克服了现有传统方法的磷酸胆碱无显色基团无法应用紫外检测器、蒸发光检测器灵敏度低、质谱检测成本高的缺点。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的高效液相分析方法，其特征在于，包括以下步骤：采用HPLC法对L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量进行检测，且在检测时，HPLC采用等度洗脱，经高分子包被型的阳离子交换柱作为分析柱，电喷雾式检测器检测；
将样品利用超纯水或甲醇溶解后，经微孔滤膜过滤后注入高效液相色谱仪，在设置仪器参数条件下采集并记录色谱图，外标法定量计算；其中设置仪器条件为高分子包被型的阳离子色谱柱分离，柱温为35℃～45℃；
选择0.1%~0.5%甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速0.6~1.5ml/min，稀释剂为超纯水；
其中流动相A和流动相B的体积比=6:4；
选用的色谱柱采用规格为5μm， 250mm×4.6mm CAPCELL PAK SCX色谱柱。
2.根据权利要求1所述高效液相分析方法，其特征在于，在进行所述检测前，配制磷酸胆碱对照品溶液、磷酸胆碱灵敏度溶液、系统适应性溶液、L-α-甘磷酸胆碱供试品溶液；
（1）L-α-甘磷酸胆碱供试品溶液的制备：
取L-α-甘磷酸胆碱，用稀释剂溶解成浓度为100mg/ml的L-α-甘磷酸胆碱供试品溶液，平行制备2份；
（2）磷酸胆碱对照品溶液的制备：
取磷酸胆碱对照品，用稀释剂溶解成浓度为100μg/ml的对照品溶液，平行制备2份；
（3）磷酸胆碱灵敏度溶液的制备：
移取磷酸胆碱对照品溶液，用稀释剂稀释成浓度为含磷酸胆碱20μg/ml的灵敏度溶液；
（4）系统适用性溶液的制备：
取L-α-甘磷酸胆碱，精密称定，加适量稀释剂溶解，精密量取磷酸胆碱对照品储备液，置同一量瓶中，用稀释剂配制成含L-α-甘磷酸胆碱100mg/ml，磷酸胆碱100μg/ml的混合溶液，作为系统适用性溶液。
3.根据权利要求1所述高效液相分析方法，其特征在于，选用电喷雾式检测器进行检测，检测蒸发温度为高，滤波器10.0。
4.根据权利要求2所述高效液相分析方法，其特征在于，分别量取系统适用性溶液、磷酸胆碱灵敏度溶液各20μl~30μl注入液相色谱仪，记录色谱图，标记L-α-甘磷酸胆碱和磷酸胆碱的保留时间，并记录两物质的分离度，记录灵敏度溶液中磷酸胆碱峰的信噪比；
精密量取磷酸胆碱对照品溶液20μl~30μl注入液相色谱仪，重复6次，记录色谱图，以峰面积计算相对标准偏差；
精密量取L-α-甘磷酸胆碱供试品溶液，记录色谱图，以峰面积计用外标法定量磷酸胆碱的残留含量。
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