CN115754047A - 一种检测甘油磷酸胆碱中甘油及氯代甘油残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药分析技术领域，具体公开了一种甘油磷酸胆碱中甘油及氯代甘油残留量的定量分离分析方法。该方法选用H型配体交换树脂为填料的特殊色谱柱，柱温为40℃～60℃，流动相为0.02M～0.05M的磷酸溶液，流速为0.3～0.5ml/min，稀释剂为纯化水；用通用型示差折光检测器RID进行检测；利用外标法计算甘油磷酸胆碱供试品中甘油及氯代甘油的残留含量。本发明提供了一种操作简便，准确度和精密度高，方法的专属性和重现性良好，便于标准化操作的高效液相色谱分析方法，能使活性药物L‑α‑甘油磷酸胆碱与甘油、氯代甘油得到分离并能准确定量，大大降低了检出成本，而且操作简单、准确度高、重现性好，非常有利于工业化生产。

Description

一种检测甘油磷酸胆碱中甘油及氯代甘油残留量的方法

技术领域

本发明涉及医药分析技术领域，具体是指一种检测甘油磷酸胆碱中甘油及氯代甘油的残留量的方法。

背景技术

L-α-甘油磷酸胆碱(L-α-Glycerophosphoryl Choline，简称L-α-GPC)为体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物以及乙酰胆碱和磷脂酰胆碱合成的胆碱源，具有重要的营养保健功能和医学应用价值。L-α-GPC能够提高脑部的认知能力，甚至可以修复早期老年失智症患者已部分损伤的认知能力，能够保护肝组织免受有毒的四氯化碳和高脂蛋白类食品所产生的脂肪酸渗透，具有抗高血脂、保护血管的作用，并且可以促进青少年身体成长，提高记忆能力，因此在医药、保健品和功能性食品方面得到广泛的应用。

L-α-GPC的化学结构式如下：

最早L-α-GPC是从牛胰脏提取纯化得到的。英国专利GB2058792和美国专利US2864848报道了利用蛋黄卵磷脂水解提取制备L-α-GPC的技术工艺。日本专利(JP61158990)也报道了以大豆卵磷脂为原料水解提取制备L-α-GPC的方法。上述从天然物质提取L-α-GPC存在以下问题：因原材料来源途径不同，差异很大，杂质成分分布不均，使得后续分离纯化工艺繁缛复杂，造成产品质量很不稳定，加之操作工艺复杂，导致工业化生产成本居高不下。

通过化学合成L-α-GPC可以避免天然物质提取方法所存在的问题，因而受到人们的广泛关注。化学合成GPC的工艺用到氯代甘油(化学名称：3-氯-1,2-丙二醇(3-chloro-1,2-propanediol)为原料，成品GPC中会残留一些氯代甘油，也会降解生成副产物甘油。当甘油残留量过多时会进一步脱水缩合为缩水甘油，而缩水甘油已经被世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构列为2A级致癌物；氯代甘油也被怀疑为可造成遗传性缺陷或可致癌的物质，必须严加控制两者的含量。而甘油和氯代甘油均为GPC成品的相关杂质，因此，必须有相关方法来测定、控制其残留量。

传统的方法中，甘油、氯代甘油通常用GC检测，但甘油和氯代甘油的沸点较高(超过200℃)，对GC条件要求比较苛刻；加上主物质GPC为粘稠液体或蜡状固体，粘度很大，直接进样很容易带来进样口、衬管污染、残留，而甘油和氯代甘油的高沸点又限制了顶空进样的可能性，导致用气相色谱法检测甘油和氯代甘油的残留困难重重。因此寻求合适的HPLC方法来检测甘油和氯代甘油的残留量就很有必要。

由于甘油磷酸胆碱(GPC)及其杂质甘油和氯代甘油都没有紫外吸收，用HPLC法来控制其杂质限度对色谱条件的要求就很高，必须达到良好的灵敏度才能使杂质得到有效控制。而且这三者的极性都很大，在一般的反相色谱中几乎不保留而导致目标杂质难于分离。因此建立专属、灵敏、稳定的高效液相色谱法来监控GPC中甘油和氯代甘油的残留量就成为当务之急。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便，准确度和精密度高，方法的专属性和重现性良好，便于标准化操作的高效液相色谱分析方法，使活性药物L-α-甘油磷酸胆碱与甘油、氯代甘油得到分离并能准确定量。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，主要包括以下步骤：

1)配置甘油、氯代甘油对照品溶液和甘油磷酸胆碱供试品溶液；

2)分别将步骤1配置好的甘油、氯代甘油对照品溶液和甘油磷酸胆碱供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中，按本发明的色谱条件进行分离、洗脱，并记录色谱图，所述色谱条件为：选用H型配体交换树脂为填料的特殊色谱柱，柱温为40℃～60℃，流动相为0.02M～0.05M的磷酸溶液，流速为0.3～0.5ml/min，稀释剂为纯化水；

3)利用外标法计算甘油磷酸胆碱供试品中甘油、氯代甘油的残留量。

即利用对照品溶液的浓度和峰面积的确定标准曲线，根据校正因子的计算公式得出校正因子的数值；用上述相同的方式获得甘油磷酸胆碱供试品溶液中甘油及氯代甘油的峰面积，用标准曲线及校正因子计算所述甘油磷酸胆碱供试品中甘油、氯代甘油的残留量。

本发明中，用通用型示差折光检测器RID进行检测，所述检测器温度为25℃～40℃。

本发明中，所述色谱柱采用规格为300mm*6.5mm，8μm的Hi-Plex H色谱柱。

本发明中，所述运行时间为20min～70min。

本发明中，优选流速为0.5ml/min；柱温为50℃,流动相为0.04M磷酸溶液，运行时间为70min。

所述检测时进样量为90ml。

本发明中，所述对照品溶液和甘油磷酸胆碱供试品溶液配制方法如下：

1)取甘油对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液a，平行制备2份，分别标记为a1、a2；

2)取氯代甘油对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液b，平行制备2份，分别标记为b1、b2；

3)分别移取上述对照品溶液a1、b1各1.0ml，加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.05mg/ml的混合对照品溶液c1；再分别移取上述对照品溶液a2、b2各1.0ml，加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.05mg/ml的混合对照品溶液c2。

4)取待检测的甘油磷酸胆碱样品，用稀释剂稀释成浓度为10.0mg/ml的甘油磷酸胆碱供试品溶液A；平行制备2份，分别标记为A1、A2；

本发明还包括HPLC系统适应性试验：取溶液a1、b1、A1各1ml，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得混合样品溶液d。

分别吸取上述溶液d、c1、c2及甘油磷酸胆碱供试品溶液A1、A2各90μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品中甘油、氯代甘油的残留量。

本发明中，所述稀释剂为纯化水。

综上所述，本发明的优点和有益效果如下：

1、本发明能良好地分离甘油、氯代甘油、甘油磷酸胆碱，专属性强、重现性良好。

2、由于甘油、氯代甘油、GPC的极性都比较大，常规的反相高效液相色谱法不适合分离三者；而现有的HPLC方法中，用Silica色谱柱、水为流动相，很容易使色谱柱发生柱流失，不仅色谱柱损耗大、检测费用高，还使重现性受到很大的限制；本发明用高选择性的配体交换柱，以稀的酸溶液为流动相，采用普通的高效液相色谱法，方法简便易行，准确度高，重现性好。

3、本发明使用等度条件洗脱，RID检测器，能有效分离GPC主峰、甘油、氯代甘油和其它一些有关物质，高效、简便、稳定，非常有利于工业化生产。

附图说明

图1为HPLC系统适应性试验中测定GPC中甘油和氯代甘油的典型HPLC图谱；

图2为用实施例中测定甘油磷酸胆碱供试品溶液中甘油和氯代甘油的HPLC图谱；

图3为线性范围试验中甘油峰面积与浓度的线性关系图；

图4为线性范围试验中氯代甘油峰面积与浓度的线性关系图；

图5为用Silica色谱柱测GPC供试品中有关物质的图谱；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例

一种检测甘油磷酸胆碱中甘油、氯代甘油残留量的方法，具体操作方法如下：

1.溶液的配制

1)取甘油对照品50mg，置50ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，得甘油对照品溶液a；平行制备2份，分别标记为a1、a2；

2)取氯代甘油对照品，置50ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，得氯代甘油对照品溶液b；平行制备2份，分别标记为b1、b2；

3)分别移取上述对照品溶液a1、b1各1.0ml，置于同一个容量为20ml的容量瓶中，加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.05mg/ml的混合对照品溶液c1；再分别移取上述对照品溶液a2、b2各1.0ml，置于另一个容量为20ml的容量瓶中，加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.05mg/ml的混合对照品溶液c2；

4)取待检测的甘油磷酸胆碱样品，用稀释剂稀释成浓度为10.0mg/ml的甘油磷酸胆碱供试品溶液A；平行制备2份，分别标记为A1、A2；

5)取溶液a1、b1、A1各1ml，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得混合样品溶液d。

6)分别吸取上述溶液d、c1、c2及甘油磷酸胆碱供试品溶液A1、A2各90μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品中甘油、氯代甘油的残留量。

所述待检测的甘油磷酸胆碱供试品来源为百灵公司研究所精制后的GPC样品。

2.选定色谱条件

本方法的采用的色谱条件如表1所示。

表1色谱系统条件

色谱柱型号及规格	Hi-Plex H，300mm*6.5mm，8μm
		检测器	示差折光检测器，检测器温度35℃
柱温(℃)	50
		进样量(μl)	90
稀释剂	纯化水
		流动相	0.04M磷酸溶液
流速(ml/min)	0.5
		运行时间(min)	70

3.HPLC系统适应性试验

(1)分别取对照品溶液a1、b1、及甘油磷酸胆碱供试品溶液A1各1μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示，以确定该3种物质的保留时间。

(2)取90μl混合样品溶液d，注入高效液相色谱仪记录色谱图，3种物质的分离度应达到要求(分离度大于1.5)，理论塔板数以甘油计应不小于2000。

4.甘油及氯代甘油校正因子的测定

取混合对照溶液c1、c2作为校正因子测定溶液，各取90μl，各进样2次，取4个校正因子的平均值。

校正因子的计算公式：F＝Cr/Ar

式中，F为校正因子，Cr为对照品浓度，Ar为对照品峰面积

测得甘油的平均校正因子为Fa＝7.9584×10-7，RSD＝0.33％

氯代甘油的平均校正因子为Fb＝8.0634×10-7，RSD＝0.51％

5.甘油磷酸胆碱供试品测定

取甘油磷酸胆碱供试品溶液A1、A2各90μl，各进样2次，按外标法以峰面积计算甘油磷酸胆碱供试品中甘油、氯代甘油的残留量：

甘油残留浓度(Ca)＝Fa*Aa

式中，Ca为甘油残留浓度，Fa为甘油的校正因子，Aa为供试品中甘油的峰面积。

氯代甘油残留浓度(Cb)＝Fb*Ab

式中，Cb为氯代甘油残留浓度，Fb为氯代甘油的校正因子，Ab为样品中氯代甘油的峰面积。

6.样品测定结果

根据图2中色谱图进行甘油残留量与氯代甘油残留量的计算。

甘油残留量计算：将供试品测定结果中的甘油色谱峰面积代入式中，按照外标法的计算方法，得供试品中甘油的残留浓度为0.08％，也就是1g甘油磷酸胆碱样品中，含有甘油杂质＝1g×0.08％＝0.0008g＝0.8mg，即甘油残留量为0.8mg/g，即800ppm，符合标准规定的“不大于0.5％”。

氯代甘油残留量计算：将供试品测定结果中的氯代甘油色谱峰面积带入式中，按照外标法的计算方法，得供试品中氯代甘油的残留浓度为“未检出”，氯代甘油的检测限为0.05％，也就是样品中含有的氯代甘油小于0.05％，符合标准规定的“不大于0.5％”。

方法学考察

为了进一步验证本方法的可行性，还进行了以下试验：

1.专属性试验

根据产品工艺路线，取甘油磷酸胆碱产品中可能存在的杂质甘油、氯代甘油对照样品(级别为分析纯)适量，分别加稀释剂溶解并定容成为浓度分别为0.5mg/ml的溶液进行HPLC定位，结果表明，在本检测方法中，上述物质均能良好分离，出峰重现性良好。试验用于测定GPC中甘油、氯代甘油的残留专属性良好。

2.检测限及定量限

储备溶液：称取甘油和氯代甘油对照品各50mg稀释至50ml，即为储备液。

定量限溶液：精密移取储备液1ml置100ml容量瓶中，加稀释剂定容至刻度，摇匀；再移取2.0ml溶液置20ml容量瓶中，加稀释剂定容至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液：精密移取定量限溶液3ml置10ml容量瓶中，加稀释剂定容至刻度，摇匀，即得。

检测限测定结果：当测试溶液浓度的信噪比S/N≈3，定为检测限；当S/N≈10时，定为定量限。检测结果如表2、表3所示。

表2甘油定量限测定结果

序号	1	2	3	4	5	6
							峰面积	2509	2774	2603	3206	3364	2470
保留时间	16.746	16.716	16.732	16.740	16.742	16.741
							S/N	11.51	15.99	13.52	13.57	15.90	12.07

其中，甘油溶液浓度为1.66μg/ml。

结论：当甘油溶液浓度为1.66μg/ml时，相当于限度浓度的3％，S/N≈10，即为该方法下甘油的定量限。

表3氯代甘油定量限测定结果

序号	1	2	3	4	5	6
							峰面积	1534	1516	1701	1539	1380	1615
保留时间	15.487	15.493	15.485	15.475	15.509	15.482
							S/N	16.6	18.34	27.55	25.6	19.86	22.34

其中，氯代甘油溶液浓度为1.55μg/ml。

结论：当氯代甘油测试溶液浓度为1.55μg/ml时，相当于限度浓度的3％，S/N≈10，即为该方法下氯代甘油的定量限。

3.线性范围试验

线性储备溶液：称取甘油与氯代甘油对照品分别为55.63mg、51.54mg，加稀释剂溶解并稀释至50ml，摇匀，即得。

配制一系列浓度水平的各溶液进样分析，其线性范围试验中甘油或氯代甘油峰面积与浓度的线性关系如图3和图4所示，其线性测试结果结果如表4所示。

表4各浓度水平线性溶液的配置

结果表明：该方法下，甘油在1.70～221.9μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度有良好的线性关系，相关系数r＝0.99999；此方法用于检测甘油杂质的范围为残留要求限度的3％～444％，能够很好地控制甘油的残留量。氯代甘油在1.50～206.2μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度有良好的线性关系，相关系数r＝0.9999；此方法用于检测氯代甘油杂质的范围为残留要求限度的3％～412％，能够很好地控制氯代甘油的残留量。

4.回收率(准确度)试验

标准溶液：取甘油、氯代甘油对照品各50mg，精密称定，加稀释剂溶解并定容至50ml，再精密移取1.0ml稀释至20ml，制成每1ml中含甘油和氯代甘油均为0.05mg的标准溶液，平行两份，每份进样2针，计算校正因子。

回收率储备液：精密称取甘油对照品215.57mg、氯代甘油251.62mg于50ml容量瓶中，再精密移取5.0ml稀释至100ml，摇匀，即得。

回收率测试溶液：取GPC供试品250mg，精密称定，置25ml容量瓶，加稀释剂溶解后至，按以下方式分别移取回收率储备溶液于各个容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，摇匀；每个浓度水平平行3份。

(1)80％对照浓度：4.0ml→50ml

(2)100％对照浓度：5.0ml→50ml

(3)120％对照浓度：6.0ml→50ml

分别取标准溶液、回收率测试溶液90μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法分别测定回收率，结果如下表所示。

表5回收率结果

结论：三个浓度下，甘油磷酸胆碱的回收率在100.3％～102.2％之间，各浓度回收率的RSD均不大于2.0％；三个浓度级别的总平均回收率为101.2％，RSD为0.58％，符合验证方案要求(回收率91.0％～106.0％，RSD≤2.0％)，证实了该方法具有良好的准确度。

5.密精度试验

取含量测定项下的供试品溶液，连续进样6次，记录甘油磷酸胆碱主成分的峰面积，精密度结果如下表。

表6精密度结果

序号	1	2	3	4	5	6	平均	RSD
									峰面积	355831	355988	355042	354803	355285	351775	354787	0.44％
保留时间	16.373	16.375	16.375	16.379	16.382	16.384	16.378	0.03％
									理论塔板数	12059	12051	12080	12120	12128	12189	/	/
拖尾因子	1.406	1.408	1.400	1.41	1.404	1.400	/	/

总结：从表中可以看出，重复进样6针供试品溶液中，GPC峰面积RSD为0.44％(标准≤2.0％)；保留时间RSD为0.03％(标准≤1.0％)；理论塔板数大于3000，拖尾因子＜1.6；由此可见，方法的精密度良好。

6.重复性试验

取同一个甘油磷酸胆碱供试品，精密称取100mg，加稀释剂溶解并定容至10ml，注入液相色谱仪，平行6份，每份溶液进样一次，按外标法计算样品中甘油与氯代甘油的残留量，检测结果的重复性见下表。

表7甘油重复性测试结果

结论：6次测定结果RSD为0.00％(标准要求≤2.0％)，重复性良好。

表8氯代甘油重复性测试结果

结论：6次测定结果的氯代甘油均为未检出，重复性良好。

对比例

本对比例采用传统的检测GPC杂质的方法，用Silica色谱柱，以水为流动相，其供试品中有关物质检测结果如图4所示，其峰表如表9所示。

表9用Silica色谱柱测GPC有关物质的峰表

图4和表9结果表明，甘油与相邻的杂质峰分离欠佳；氯代甘油与其它杂质一起出峰，不能准确测定其残留量。另外，Silica柱用水为流动相，柱子的损耗很大，不适合用于大生产中用来监控产品质量。

尝试用气相色谱法测定，发现同一个样品中，连续进样的甘油的峰面积持续增大，不能达到稳定出峰，发现原因是GPC和甘油都很粘稠，已经造成管路残留。

综上所述，本发明的分析方法能准确、简便、可靠地测定GPC中甘油、氯代甘油的残留量。用H型配体交换柱、RID检测，方法专属准确、简便易行，容易推广；该方法可用于GPC产品的产业化质量控制，克服了传统方法中的缺点。

Claims (7)

1.一种检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，其特征在于主要包括以下步骤：

1)配置甘油、氯代甘油对照品溶液和甘油磷酸胆碱供试品溶液；

2)分别将步骤1配置好的甘油、氯代甘油对照品溶液和甘油磷酸胆碱供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中，获得色谱图，其色谱条件为：选用H型配体交换树脂为填料的特殊色谱柱，柱温为40℃～60℃，流动相为0.02M～0.05M的磷酸溶液，流速为0.3～0.5ml/min，稀释剂为纯化水；

3)利用外标法计算甘油磷酸胆碱供试品中甘油、氯代甘油的残留量。

2.根据权利要求1所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，其特征在于使用通用型示差折光检测器RID进行检测，检测器温度为25℃～40℃。

3.根据权利要求1所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，所述步骤2中运行时间为20min～70min。

4.根据权利要求3所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，其特征在于所述色谱柱采用规格为300mm*6.5mm，8μm的Hi-Plex H色谱柱。

5.根据权利要求4所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，其特征在于所述流速为0.5ml/min；柱温为50℃,流动相为0.04M磷酸溶液，运行时间为70min。

6.根据权利要求1所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，其特征在于所述步骤1中对照品溶液和甘油磷酸胆碱供试品溶液配制方法如下：

1)取甘油对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液a，平行制备2份，分别标记为a1、a2；

2)取氯代甘油对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液b，平行制备2份，分别标记为b1、b2；

3)分别移取上述对照品溶液a1、b1各1.0ml，加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.05mg/ml的混合对照品溶液c1；再分别移取上述对照品溶液a2、b2各1.0ml，加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.05mg/ml的混合对照品溶液c2；

4)取待检测的甘油磷酸胆碱样品，用稀释剂稀释成浓度为10.0mg/ml的甘油磷酸胆碱供试品溶液A；平行制备2份，分别标记为A1、A2。

7.根据权利要求6所述的检测甘油磷酸胆碱中甘油和氯代甘油残留量的方法，其特征在于所述稀释剂为纯化水。

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