CN114113405B - 一种甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药分析技术领域，具体公开了一种甘油磷酸胆碱及其同分异构体杂质的分离分析方法。该方法选用包被特殊薄膜并键PC基团的硅胶为填料的特殊色谱柱，柱温为30℃～45℃，选择乙腈为流动相A相，用甲酸调节pH至3～5的水为流动相B相，以流动相A:流动相B＝4:1等度洗脱，流速为0.3～0.5ml/min，稀释剂为60％～75％的乙腈；用通用型示差折光检测器RID检测器进行检测；利用外标法计算供试样品中甘油磷酸胆碱及其异构体的含量。本发明选用通用型示差折光检测器RID，大大降低了检出成本，而且操作简单、准确度高、重现性好，非常有利于工业化生产。

Description

一种甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明涉及医药分析技术领域，具体是指一种甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法。

背景技术

同分异构体是一类分子式相同而原子排列不同的化合物，即相同的分子式，但具有不同的结构。同分异构体的分子结构不同，导致其物理性质和化学性质也不相同，同分异构现象是有机化合物种类繁多数量巨大的原因之一。

L-α-甘油磷酸胆碱(L-α-Glycerophosphoryl Choline，简称L-α-GPC)为体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物以及乙酰胆碱和磷脂酰胆碱合成的胆碱源，具有重要的营养保健功能和医学应用价值。L-α-GPC能够提高脑部的认知能力，甚至可以修复早期老年失智症患者已部分损伤的认知能力，能够保护肝组织免受有毒的四氯化碳和高脂蛋白类食品所产生的脂肪酸渗透，具有抗高血脂、保护血管的作用，并且可以促进青少年身体成长，提高记忆能力，因此在医药、保健品和功能性食品方面得到广泛的应用。

L-α-GPC的化学结构式如下：

最早L-α-GPC是从牛胰脏提取纯化得到的。英国专利GB2058792和美国专利US2864848报道了利用蛋黄卵磷脂水解提取制备L-α-GPC的技术工艺。日本专利(JP61158990)也报道了以大豆卵磷脂为原料水解提取制备L-α-GPC的方法。上述从天然物质提取L-α-GPC存在以下问题：因原材料来源途径不同，差异很大，杂质成分分布不均，使得后续分离纯化工艺繁缛复杂，造成产品质量很不稳定，加之操作工艺复杂，导致工业化生产成本居高不下。

通过化学合成L-α-GPC可以避免天然物质提取方法所存在的问题，因而受到人们的广泛关注。化学合成的L-α-GPC受反应体系的影响，也会生成副产物L-β-GPC，两者互为同分异构体，其生物活性的研究还不够深入，目前尚未发现该互为异构体的两种物质分离测定方法。

由于甘油磷酸胆碱(GPC)及其合成的起始物料、杂质都没有紫外吸收，用HPLC法来控制其杂质限度对色谱条件的要求就很高，必须达到良好的灵敏度才能使杂质得到有效控制。而且GPC的极性非常大，在一般的反相色谱中几乎不保留而导致目标杂质难于分离。因此建立专属、灵敏、稳定的高效液相色谱法来监控杂质含量就成为当务之急。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便，准确度和精密度高，方法的专属性和重现性良好，便于标准化操作，使活性药物L-α-甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)与其同分异构体L-β-GPC分离良好的高效液相色谱分析方法。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，主要包括以下步骤：

1)分别将配置好的供试品溶液和对照品溶液注入超高效液相色谱仪中，其色谱条件为：选用包被特殊薄膜并键合PC基团的硅胶为填料的特殊色谱柱，柱温为30℃～45℃，选择乙腈为流动相A相，选择用甲酸调节pH至3～5的水为流动相B相，流速为0.3～0.8ml/min，稀释剂为60％～75％的乙腈，以流动相A:流动相B＝4:1(体积比)等度洗脱；

2)用通用型示差折光检测器RID检测器进行检测，检测器温度为25℃～40℃；

3)利用外标法计算供试样品中甘油磷酸胆碱及其异构体的含量。

即利用对照品溶液的浓度和峰面积的确定标准曲线，根据校正因子的计算公式得出校正因子的数值；用上述相同的方式获得一个供试样品的峰面积，用标准曲线及校正因子计算所述供试样品中甘油磷酸胆碱及其异构体的含量。

本发明中，所述色谱柱采用规格为2.7μm,100mm×4.6mm的CAPCELL CORE色谱柱。

所述，流动相A相采用75％的乙腈并用甲酸调节pH为5.0；

本发明中，优选流速为0.5ml/min；柱温为40℃,运行时间为25min。

本发明中，供试品溶液和对照品溶液配制方法如下：

(1)取甘油磷酸胆碱对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液a；平行制备2份，分别标记为a1、a2；

(2)取甘油对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液b；

(3)取氯化胆碱对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液c；

(4)分别移取上述对照品溶液a1、b、c加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.1mg/ml的混合对照品溶液d；

(5)取甘油磷酸胆碱样品，用稀释剂稀释成浓度为5.0mg/ml的溶液，标记为有关物质样品溶液A；平行制备2份，分别标记为A1、A2；

(6)精密移取溶液A1、A2用稀释剂分别稀释成浓度为1.0mg/ml的溶液作为供试品溶液，标记为B1、B2。

本发明中，甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，还包括HPLC系统适应性试验测定：

1)分别取对照品溶液a1、b、c各20μl，注入高效液相色谱仪记录色谱图，以确定该3种物质的保留时间。

2)取20μl混合对照品溶液d，注入高效液相色谱仪记录色谱图，记录3种物质的分离度及理论塔板数。

综上所述，本发明的有益效果：

本发明的优点和有益效果如下：

1、本发明能良好地分离甘油磷酸胆碱及其同分异构体杂质，同时还能测定GPC中的常见杂质，如甘油等。

2、现有的HPLC方法中，用Silica色谱柱、水为流动相，很容易使色谱柱发生柱流失，不仅色谱柱损耗大、检测费用高，还使重现性受到很大的限制；本发明用普通高效液相色谱法，方法简便易行，准确度高，重现性好。

3、本发明以流动相A:流动相B＝4:1为流动相等度洗脱，避免了双泵高压梯度的液相检测，选用通用型示差折光检测器RID，能分离多个有关物质，高效、简便、稳定，非常有利于工业化生产。

附图说明

图1甘油磷酸胆碱对照溶液的HPLC图谱；

图2甘油磷酸胆碱样品供试溶液的HPLC图谱；

图3为用本方法测定GPC有关物质的HPLC图谱；

图4为线性范围试验中GPC峰面积与浓度的线性关系图；

图5为用Silica色谱柱测GPC有关物质的图谱-A；

图6为用Silica色谱柱测GPC有关物质的图谱-B；

图7为传统方法测GPC有关物质的图谱比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例

一种甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，具体操作方法如下：

1.溶液的配制

1)取甘油磷酸胆碱对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液a；平行制备2份，分别标记为a1、a2；

2)取甘油对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液b；

3)取氯化胆碱对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液c；

4)分别移取上述对照品溶液a1、b、c各1.0ml，置于同一个容量为10ml的容量瓶中，加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.1mg/ml的混合对照品溶液d；

5)取甘油磷酸胆碱样品25.13mg，用稀释剂稀释成浓度为5.0mg/ml的溶液，标记为有关物质样品溶液A；平行制备2份，分别标记为A1、A2；

6)精密移取上述溶液A1、A2各2.0ml，分别置10ml容量瓶中，用稀释剂稀释成浓度为1.0mg/ml的甘油磷酸胆碱溶液作为供试溶液，标记为B1、B2；

所述稀释剂为75％的乙腈。

2.选定色谱条件

本方法的采用的色谱条件如表1所示。

表1色谱系统条件

3.甘油磷酸胆碱含量测定

1)校正因子的测定

取甘油磷酸胆碱对照溶液a1、a2各20μl作为校正因子测定，各进样2次，注入高效液相色谱仪记录色谱图，如图1所示。并计算出校正因子的平均值。

校正因子的计算公式：F＝Cr/Ar

式中，F为校正因子，Cr为对照品浓度，Ar为对照品峰面积；

由上述公式计算得甘油磷酸胆碱的平均校正因子为F＝6.5966×10^-6。

2)甘油磷酸胆碱供试样品测定

取供试溶液B1、B2各20μl，各进样2次，注入高效液相色谱仪记录色谱图，如图2所示。

按外标法以峰面积计算甘油磷酸胆碱的含量。

样品浓度计算公式：Cx＝F×Ax

式中，Cx为样品浓度，F为校正因子，Ax为样品的峰面积。

将样品的色谱峰面积代入式中，按照外标法的计算方法，得待测样品中甘油磷酸胆碱的浓度为0.9986mg/ml，通过公式：m＝CV＝0.9986mg/ml×25ml(25.13mg样品先放入5ml的容量瓶中配置成5mg/ml的有关物质样品溶液A，再取2ml配置成浓度为1mg/ml的供试溶液B，相当于将样品加入到25ml的容量瓶中加入稀释剂制得了浓度为1mg/ml的供试溶液)，得到m＝24.97mg，其中m为甘油磷酸胆碱的重量。

甘油磷酸胆碱的含量

3)有关物质样品测定

取有关物质样品溶液A1、A2各90μl，注入液相色谱仪，采集数据60min，如图3所示。

按面积归一化法分别计算甘油、氯化胆碱、GPC同分异构体的含量。

通过HPLC自带软件，按面积归一法计算，得甘油的残留量为0.232％；氯化胆碱未检出残留；GPC异构体的残留量为0.387％。

结果表明，本方法能将GPC中的常见杂质(如甘油、异构体等)有效分离并准确定量。

HPLC系统适应性试验

1)分别取对照品溶液a1、b、c各20μl，注入高效液相色谱仪记录色谱图，以确定该3种物质的保留时间。

由图3可知，甘油磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱同分异构体、甘油保留时间分别为：20.03mim、17.04mim、4.46mim。

2)取20μl混合对照品溶液d，注入高效液相色谱仪记录色谱图。测得3种物质的分离度大于1.5，理论塔板数以甘油磷酸胆碱计不小于2000。

为了进一步验证本方法的可行性，还进行了以下试验：

1.专属性试验

根据产品工艺路线，取甘油磷酸胆碱产品中可能存在的杂质对照样品(级别为分析纯)适量，分别加稀释剂溶解并定容成为浓度分别为1.0mg/ml的溶液进行HPLC定位，杂质包括氯化胆碱、氯代甘油、甘油、甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)、甘油磷酸胆碱异构体(L-β-GPC)。结果表明，在本检测方法中，上述物质均能良好分离，出峰重现性良好。试验用于测定GPC及其异构体的专属性良好。

2.检测限及定量限

储备溶液：称取GPC对照品50mg稀释至50ml，即为储备液。

定量限溶液：精密移取储备液1ml置100ml容量瓶中，加稀释剂定容至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液：精密移取储备液1ml置100ml容量瓶中，加稀释剂定容至刻度，再移取3ml置10ml容量瓶中，定容摇匀后即得。

检测限测定结果：测试溶液浓度为3μg/ml时，S/N≈3，定为检测限，检测结果如表2所示。

表2定量限测定结果

结论：测试溶液浓度为0.00988mg/ml时，重复进样6针，S/N在11～15之间，即定量限为0.01mg/ml。

3.线性范围试验

线性储备溶液：精密称取GPC对照品200mg，置20ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，混匀，配制各浓度及方法如表3所示。

表3各浓度水平线性溶液的配置

水平(％)	稀释过程
		定量限	移线性储备液1ml-10ml，再移1ml-100ml
2％	移线性储备液1ml-50ml，再移1ml-10ml
		5％	移线性储备液1ml-20ml，再移1ml-10ml
20％	移线性储备液1ml-50ml
		50％	移线性储备液1ml-20ml
100％	移线性储备液1ml-10ml
		200％	移线性储备液2ml-10ml
300％	移线性储备液3ml-10ml

测试结果如图4所示：线性方程为Y＝3.404×10⁵X+1299.1，相关系数(R)：0.99998，Y轴截距绝对值与100％线性浓度水平响应值比值为0.38％(标准≤2.0％)。

结论：该方法下，GPC在0.0099mg/ml～2.9593mg/ml浓度范围内，峰面积与浓度有良好的线性关系。

4.回收率(准确度)试验

对照溶液：精密称定GPC对照品50mg，置50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，混匀，即得。平行配制2份，各进两针，计算校正因子。

回收率溶液：分别精密称取甘油磷酸胆碱对照品和样品约20mg和20mg、25mg和25mg、30mg和30mg，分别置于50ml、50ml、50ml的容量瓶中，加稀释剂适量，使溶解，再加稀释剂定容至刻度摇匀，即得浓度为80％、100％、120％的回收率样品溶液，每个浓度级别各配置3份，按本发明的方法分别测定回收率，结果如下表所示。

表4回收率结果

结论：三个浓度下，甘油磷酸胆碱的回收率在95.5％～100.5％之间，各浓度回收率的RSD均不大于2.0％；三个浓度级别的总平均回收率为98.3％，RSD为1.71％，符合验证方案要求(回收率98.0％～102.0％，RSD≤2.0％)，证实了该方法具有良好的准确度。

5.密精度试验

取含量测定项下的样品溶液，连续进样6次，记录甘油磷酸胆碱主成分的峰面积，精密度结果如下表。

表5精密度结果

序号	1	2	3	4	5	6	平均	RSD
									峰面积	355831	355988	355042	354803	355285	351775	354787	0.44％
保留时间	16.373	16.375	16.375	16.379	16.382	16.384	16.378	0.03％
									理论塔板数	12059	12051	12080	12120	12128	12189	/	/
拖尾因子	1.406	1.408	1.400	1.41	1.404	1.400	/	/

总结：从表中可以看出，重复进样6针样品溶液中，GPC峰面积RSD为0.44％(标准≤2.0％)；保留时间RSD为0.03％(标准≤1.0％)；理论塔板数大于3000，拖尾因子＜1.6；由此可见，方法的精密度良好。

6.重复性试验

取同一个甘油磷酸胆碱样品，按含量测定项下的方法配制样品，平行配制6份，按外标法计算样品含量，检测结果的重复性见下表。

表6重复性测试结果

结论：6次测定结果RSD为0.36％(标准要求≤2.0％)，重复性良好。

7.溶液稳定性考察

取含量测定项下的样品溶液，分别于0、2、4、8、12、16、24、36、48小时进样，记录主成分峰面积的变化，结果见下表。

表7主成分峰面积的变化

结论：48小时内，甘油磷酸胆碱含量测定溶液峰面积响应值的RSD为0.16％，证实样品的稳定性良好。

8.方法耐用性考察

在本方法规定的色谱条件下，尝试了对流速、柱温、流动相pH值、乙腈比例的微调(按《中国药典》2020版的要求)，以及用不同批号相同类型的色谱柱进行试验，样品含量测定的结果均在验证方案要求的范围内(相对偏差≤0.5％)，证实本方法耐用性符合要求。

对比例

本对比例采用传统的检测GPC杂质的方法，用Silica色谱柱，以水为流动相，其有关物质检测结果如图5和图6所示。

根据图5和图6测出的GPC有关物质的图谱可知，该方法没有重现性，同一个样品两次检测的结果差别很大。杂质挤在5分钟前出峰，杂质之间未能良好分离，不能准确测定杂质含量。

其比较图谱见图7，深浅两色图谱分别是两次实验、用同一种方法(传统的检测GPC杂质的方法)测定同一批GPC样品的结果，可以看出，两次的杂质个数和大小都不一样，说明传统方法的重现性不好。另外，Silica柱用水为流动相，柱子的损耗很大，不适合用于大生产中用来监控产品质量。

由此可见，相比于传统的检测方法，本发明的分析方法能准确、简便、可靠地测定GPC及其杂质的含量，用于GPC产品的产业化质量控制，克服了传统方法中的缺点。

Claims (5)

1.一种甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别将配置好的对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，其色谱条件为：选用包被特殊薄膜并键PC基团的硅胶为填料的特殊色谱柱，柱温为30℃～45℃，选择乙腈为流动相A相，甲酸调节pH至3～5的水为流动相B相，流速为0.3～0.5ml/min，稀释剂为60％～75％的乙腈；

洗脱方式为等度洗脱，其中流动相A和流动相B的体积比＝4:1；

所述色谱柱采用规格为2.7μm,100mm×4.6mm的CAPCELL CORE色谱柱；

2)用通用型示差折光检测器RID检测器进行检测，检测器温度为25℃～40℃；

3)利用外标法计算供试样品中甘油磷酸胆碱及其异构体的含量；

所述异构体为L-β-甘油磷酸胆碱。

2.根据权利要求1所述的甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述流动相A相采用75％的乙腈并用甲酸调节pH为5.0。

3.根据权利要求1所述的甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述流速为0.5ml/min；柱温为40℃,运行时间为25min。

4.根据权利要求1所述的甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，其特征在于，供试品溶液和对照品溶液配制方法如下：

(1)取甘油磷酸胆碱对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液a；平行制备2份，分别标记为a1、a2；

(2)取甘油对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液b；

(3)取氯化胆碱对照品，用稀释剂溶解成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液c；

(4)分别移取对照品溶液a1、b、c加稀释剂稀释成含各对照品分别为0.1mg/ml的混合对照品溶液d；

(5)取甘油磷酸胆碱样品，用稀释剂稀释成浓度为5.0mg/ml的溶液，标记为有关物质样品溶液A；平行制备2份，分别标记为A1、A2；

(6)精密移取溶液A1、A2用稀释剂分别稀释成浓度为1.0mg/ml的溶液作为供试品溶液，标记为B1、B2。

5.根据权利要求4所述的甘油磷酸胆碱及其异构体的高效液相色谱分析方法，其特征在于，还包括系统适应性测定：

1)分别取对照品溶液a1、b、c各20μl，注入高效液相色谱仪记录色谱图，以确定3种物质的保留时间；

2)取20μl混合对照品溶液d，注入高效液相色谱仪记录色谱图，记录3种物质的分离度及理论塔板数。

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