CN116818943A - 一种磷酸胆碱含量测定的高效液相分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析技术领域，具体公开了一种磷酸胆碱含量测定的高效液相分析方法。该检测方法选用高分子包被型的阳离子交换柱为分析柱；柱温为30℃～40℃；流速为0.5ml/min～1.0ml/min；进样量为10μl～20μl；流动相为甲酸铵缓冲液‑乙腈(5～70：95～30)；稀释剂为纯水，检测器为通用型示差(RID)检测器，检测器温度为30℃～40℃，利用外标法计算供试品中磷酸胆碱含量。本发明提供一种操作简便，检测器易得、准确度和灵敏性高，方法专属性和重现性好，便于标准化操作的高效液相分析的方法，能快速准确的定量磷酸胆碱的含量。

Description

一种磷酸胆碱含量测定的高效液相分析方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种磷酸胆碱含量测定的高效液相分析方法。

背景技术

磷酸胆碱(CAS：645-84-1)，英文名为Phosphoryl choline，可参与合成磷脂，具有保护肝脏，强化肝脏，促进脂质代谢和保护脂肪肝的作用，还能加速甲基转移，供给活性甲基，促进肝脏细胞的再生；此外磷酸胆碱在体内可合成乙酰胆碱，而乙酰胆碱可活化营养神经系统；可以分解组胺，使肾胺酶活性增强，具有解毒作用。磷酸胆碱主要用作食品添加剂，用于酿造制品的品质改良剂，添加合成清酒中，可增加浓稠香气；也可稳定氨基酸及其他酒质的成分；也可用作调味料，增加菜肴鲜味。

目前查到使用高效液相色谱-质谱法检测饮料中磷酸胆碱的含量，但由于液相色谱-质谱法检测成本高；且磷酸胆碱没有显色基团，无法用型紫外检测器检测；目前没有相适应的液相色谱法对其进行准确定量，因此开发建立一种磷酸胆碱的高效液相色谱检测方法成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明克服了高效液相-质谱法检测成本高，磷含量常用磷钼酸比色法，前处理繁琐操作步骤多的缺点，且磷钼酸具有腐蚀性、显色稳定时间短的缺点；而该检测方法具有样品前处理方便，试剂试液易得，检出浓度适宜，目标峰保留时间适宜，可快速通过外标法定量磷酸胆碱的含量，具有准确性、重现性和稀释后稳定性高的优点，且检测成本大大降低。

本发明的目的在于提供一种HPLC-RID法测定磷酸胆碱含量的方法，该方法采用HPLC法(等度或梯度洗脱、通用型示差检测器)进行检测，选用高分子包被型的阳离子交换柱作为色谱柱，用甲酸铵缓冲液(用甲酸调节pH)：乙腈等度或梯度洗脱，从而实现磷酸胆碱的快速定量检测。

本发明的技术方案如下：试样经纯水或甲醇溶解经微孔滤膜后注入高效液相色谱仪，在设置仪器参数条件下采集并记录色谱图，外标法定量计算；其中设置仪器条件为选用高分子包被型的阳离子色谱柱，柱温为30℃～40℃，流动相为体积比5～70的甲酸铵缓冲液(用甲酸调节pH值)和95～30的乙腈等度或梯度洗脱，流速为0.5ml/min～1.0ml/min，进样体积为10μl～20μl，检测器为通用型示差检测器。

本发明提供了一种磷酸胆碱含量测定的高效液相分析方法，所述方法包括如下步骤：

分别配制好供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，其色谱条件为：选用高分子包被型的阳离子交换柱为分析柱，柱温为30℃～40℃，流速为0.5ml/min～1.0ml/min，流动相选择甲酸铵缓冲溶液(甲酸调节pH至3.0～4.0)为流动相A，乙腈为流动相B,以流动相A：流动相B体积比为(5～70：95～30)等度洗脱，稀释剂为纯水。

优选的，选用通用型RID检测器，检测器温度为40℃。

本发明利用外标法以峰面积计算供试品溶液中磷酸胆碱的含量。

本发明采用规格包括5μm 250×4.6mm的高分包被型阳离子色谱柱。

优选的，所述流动相A为甲酸铵缓冲液(用甲酸调节pH至3.0)，流动相B为乙腈。

本发明中优选流速为0.8ml/min，柱温为30℃，运行时间为30min。

本发明中供试品溶液、对照品溶液的配制方法如下：

(1)供试品溶液的制备：取产品适量，用水溶解并稀释制成含磷酸胆碱15mg/ml的供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备：取磷酸胆碱对照品，用水溶解并稀释制成含磷酸胆碱10mg/ml的对照品溶液。

本发明中还包括高效液相系统适用性溶液，取磷酸胆碱适量，用水溶解制成含磷酸胆碱10mg/ml的溶液，连续进样6次，为系统适用性溶液。

本发明的具体测定方法：

分别量取系统适用性溶液溶液、供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，标记磷酸胆碱的保留时间，并记录磷酸胆碱与相邻杂质的分离度，记录磷酸胆碱对照品溶液系统重复性。

精密量取磷酸胆碱对照品溶液20μl注入液相色谱仪，重复6次，记录色谱图，以峰面积计算相对标准偏差。精密量取供试品溶液，记录色谱图，用外标法以峰面积计定量磷酸胆碱的含量。

综上，本发明的效益效果如下：

1、本发明采用通用型RID检测器检测，该检测器灵敏度较高，基线稳定，检测成本低，检测器易获得，实现了产品前处理简单，快速准确定量磷酸胆碱的含量；

2、本发明还以甲酸铵缓冲液(甲酸调节pH3.0)为流动相A：以乙腈为流动相B，体积比为35：65等度洗脱，避免了以纯水为流动相，双泵高压梯度洗脱的高效液相检测，对所用色谱柱损耗小，延长色谱柱使用寿命，降低检测费用；

3、本发明分析方法具有较高的准确性、精密性和稳定性、方法试样配制简单、可实现磷酸胆碱的快速准确定量，节约检测时间和成本。

附图说明

图1是本发明空白溶剂的HPLC-RID图谱；

图2是本发明氯化胆碱对照品溶液HPLC-RID图谱；

图3是本发明对照品溶液HPLC-RID图谱；

图4是本发明供试品溶液HPLC-RID图谱；

图5是本发明延长供试品溶液HPLC-RID图谱。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1

一种磷酸胆碱含量测定的高效液相分析方法。

1、色谱条件为色谱柱：CAPCELL PAK SCX 250×4.6mm 5μm；柱温：30；流速：0.8/min；RID检测器，检测器温度40℃；进样量：20μl；选用高效液相色谱仪。

2、溶液制备

2.1流动相：

流动相A：甲酸铵缓冲液(取甲酸铵0.63g，用水溶解并稀释至1000ml，用甲酸调节pH值至3.0)

流动相B：乙腈

流动相A：流动相B＝35：65等度洗脱最优，运行时间为30min。

2.2稀释剂：纯水。

2.3供试品溶液：精密称取样品，用水溶解并稀释制成含磷酸胆碱15mg/ml的溶液，作为供试品溶液，平行制备。

2.4对照品溶液：精密称取磷酸胆碱对照品，用水溶解并稀释制成含磷酸胆碱10mg/ml的溶液，作为作为对照溶液，平行制备。

2.5系统适用性溶液：称取磷酸胆碱适量，用水溶解并稀释制成含磷酸胆碱10mg/ml的溶液，连续进样6针，记录色谱图。

3、测定方法

按照1中色谱条件，分别精密量取2中系统适应性溶液、对照品溶液、供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算磷酸胆碱的含量。

高效液相系统适应性试验：磷酸胆碱对照品溶液6次重复进样，以确定检测系统的重复性。由图1纯水空白溶剂可知稀释剂纯水不干扰磷酸胆碱的检测；由图2可知磷酸胆碱与极性相近物质氯化胆碱杂质峰完全分离，氯化胆碱及其他杂质不干扰磷酸胆碱的检测；由图3可知磷酸胆碱对照品溶液连续进样6次，相对标准偏差均≤2.0％，可知检测系统稳定，可达到检测需求；图4可知供试品溶液中酸胆碱可被检准确测出并与磷酸胆碱对照品色谱图目标峰保留时间一致；由图5可知延长供试品溶液运行时间，无新增杂质干扰磷酸胆碱含量的检测。

按外标法以峰面积计算磷酸胆碱的含量。

计算公式为

式中：

m_对：磷酸胆碱对照品的称样量，mg；

A_供：供试品测试溶液的峰面积；

V_供：供试品测试溶液的稀释体积，ml；

V_对：磷酸胆碱对照品溶液制备时稀释的体积，ml；

磷酸胆碱对照品峰面积的平均值；

W_供：供试品溶液的称样量，mg；

P_对：磷酸胆碱对照品的纯度，％

为了进一步验证本方法的可行性，还进行了以下试验：

1、专属性试验

根据磷酸胆碱物质的性质，分别取纯水、氯化胆碱供试品溶液、供试品溶液、磷酸胆碱对照品溶液分别进样。图1纯水作为稀释剂在磷酸胆碱目标物保留时间处无干扰峰；图2氯化胆碱供试品溶液在该色谱条件下，无色谱相应，氯化胆碱与其他杂质不干扰磷酸胆碱的定量检测；图3与图4中磷酸胆碱对照品溶液中目标峰与供试品溶液中目标峰保留时间一致，供试品溶液中磷酸胆碱与相邻峰最小分离度为3.5，完全分离；图5为延长供试品溶液运行时间，色谱中无新增杂质，且磷酸胆碱峰相邻处无其他杂质干扰目标物质的检测。该检测方法专属性良好。

2、线性与范围试验

线性储备溶液：称取磷酸胆碱对照品1.3g，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即为线性储备液。

配制各低浓度水平线性溶液见表1

表1低浓度水平线性溶液配比

测试结果如表2所示，线性方程Y＝162927.2X-14481.0，相关系数(r)＝1.0，斜率为162927.2，剩余标准差与100％浓度磷酸胆碱对照品峰面积的比为0.19％(标准规定≤2.0％)，所以在该色谱条件磷酸胆碱在浓度为4.664mg/ml～13.992mg/ml的范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

表2线性测试结果

浓度水平％	50％	75％	100％	125％	150％
						浓度(mg/ml)	4.664	6.996	9.328	11.660	13.992
峰面积	74835.0	1122669.0	1503207.7	1885414.0	2266793.5

3、回收率(准确度)试验

磷酸胆碱对照品储备溶液：称取磷酸胆碱对照品1.3g，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得磷酸胆碱对照品储备液。

磷酸胆碱对照品溶液：精密量取磷酸胆碱对照品储备液2.0ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为磷酸胆碱对照品溶液

供试品溶液：分别称取供试品约75mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量使溶解，精加上述磷酸胆碱对照品储备液1.0ml，置同一10ml量瓶中，加水定容，摇匀，作为加标供试品溶液，平行制备6份。

依据向一定浓度的供试品溶液中加入已知量的磷酸胆碱对照品溶液，以对照品的回收率表征方法的回收率，结果如表3所示，6份一定浓度的加标供试品溶液中，磷酸胆碱的平均回收率为98.7％，RSD＝0.5％，符合平均回收率在98.0％～1101.0％之间，回收率的RSD值≤2.0％的要求，证实该方法检测磷酸胆碱含量的准确度良好。

表3回收率试验结果

4、重复性试验

平行配制浓度为15mg/ml的供试品溶液6份，磷酸胆碱对照品浓度为10mg/ml，分别进样，外标法以峰面积计算磷酸胆碱的含量，结果如表4所示：对照品溶液连续进样6次，平均峰面积为1503207.7，平行配制的6份供试品溶液中，磷酸胆碱的平均含量为69.2％，RSD为0.4％(标准规定≤2.0％)，证实该检测方法重复性良好。

表4重复性试验结果

5、中间精密度试验

在不同日期，由不同化验员，于重复性同法，制备中间精密度供试品溶液，磷酸胆碱对照品溶液，磷酸胆碱对照品溶液连续6针，峰面积平均值为1506412.2，具体结果如表5所示，6份中间精密度的平均含量为68.6％，RSD值为1.1％(标准规定≤2.0％)，12份磷酸胆碱含量的RSD为0.9％(标准规定≤2.0％)，证实该检测方法中间精密度良好。

表5中间精密度试验

6、溶液稳定性

磷酸胆碱对照品溶液：称取磷酸胆碱对照品1.3g，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为磷酸胆碱对照品储备液，精密量取储备液2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得磷酸胆碱对照品稳定性考察溶液。

取供试品(稀释前)在室温下放置，作为供试品稳定性考察溶液一。

取供试品的稀释液(按照供试品溶液制备方式稀释后)，在室温下放置，作为供试品稳定性考察溶液二。

上述各溶液于24小时后，以临用新制的磷酸胆碱对照品溶液按照外标法以峰面积计算，对照品稳定性考察溶液的浓度、计算供试品(稀释前)稳定性考察溶液一中磷酸胆碱的含量、计算供试品(稀释后)稳定性考察溶液二中磷酸胆碱的含量；以测得的磷酸胆碱对照品的浓度相对于初始浓度的百分比表征溶液的稳定性、以测得的稀释前磷酸胆碱的含量相对于0时的百分比表征磷酸胆碱(稀释前)的稳定性、以测得的稀释后磷酸胆碱的含量相对于0时的百分比表征供试品稀释后的稳定性。计算结果见表6所示，在室温放置24小时后，磷酸胆碱对照品，供试品(稀释前)磷酸胆碱，供试品(稀释后)磷酸胆碱，相对于0时百分含量均在98.0％～101.0％之间，证实该物质在24小时内稳定性良好。

表6溶液稳定性结果

实施例2检测器的选择

其他条件同实施例1，采用蒸发光检测器(ELSD)，漂移管温度为85℃，载气流量为2.0L/min，磷酸胆碱供试品溶液浓度为15mg/ml时，该色谱条件下，基线波动大，无法将相近物质磷酸胆碱与氯化胆碱完全分离，氯化胆碱干扰磷酸胆碱的准确测量，且高浓度供试品溶液易在蒸发光检测器的条件下过载，无法实现磷酸胆碱的准确定量。

综上，相比高效液相-蒸发光检测器检测方法、高效液相-质谱检测方法、高效液相-紫外检测器检测方法，本发明应用高效液相-通用型示差检测器，高分子包被型的阳离子色谱柱，分析方法检测成本低、检测器易获得，产品前处理简单、方便，可快速定量出磷酸胆碱的含量。该检测方法可应用于含磷酸胆碱产品的产业化的质量控制，克服了现有传统方法的紫外检测器无响应、蒸发光检测器不稳定、质谱检测成本高、钼酸比色法检测磷含量繁琐前处理步骤的缺点。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种磷酸胆碱含量测定的高效液相分析方法，其特征在于，采用HPLC法进行检测，且在检测时，HPLC采用等度或梯度洗脱，选用高分子包被型的阳离子交换柱作为色谱柱，通用型示差检测器检测。

2.根据权利要求1所述高效液相分析方法，其特征在于，用甲酸铵缓冲液：乙腈等度或梯度洗脱，从而实现磷酸胆碱的快速定量检测。

3.根据权利要求1所述高效液相分析方法，其特征在于，试样经纯水或甲醇溶解经微孔滤膜过滤后注入高效液相色谱仪，在设置仪器参数条件下采集并记录色谱图，外标法定量计算；其中设置仪器条件为选用高分子包被型的阳离子色谱柱，柱温为30℃～40℃，流动相为体积比5～70的甲酸铵缓冲液和95～30的乙腈等度或梯度洗脱，流速为0.5ml/min～1.0ml/min，进样体积为10μl～20μl，检测器为通用型示差检测器。

4.根据权利要求1所述高效液相分析方法，其特征在于，所述HPLC检测采用规格为5μm250×4.6mm的高分子包被型阳离子色谱柱。

5.根据权利要求1所述高效液相分析方法，其特征在于，在进行所述检测前，配制供试品溶液、对照品溶液：

(1)供试品溶液的制备：取产品适量，用水或甲醇溶解并稀释制成含磷酸胆碱15mg/ml的供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备：取磷酸胆碱对照品，用水或甲醇溶解并稀释制成含磷酸胆碱10mg/ml的对照品溶液。

6.根据权利要求5所述高效液相分析方法，其特征在于，分别量取对照品溶液、供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，标记磷酸胆碱的保留时间，并记录磷酸胆碱与相邻杂质的分离度，记录磷酸胆碱对照品溶液系统重复性；

精密量取磷酸胆碱对照品溶液20μl注入液相色谱仪，重复6次，记录色谱图，以峰面积计算相对标准偏差；

精密量取供试品溶液，记录色谱图，用外标法以峰面积计定量磷酸胆碱的含量。