CN117630202B - 盐酸丁螺环酮中间体杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了盐酸丁螺环酮的中间体3，3‑四亚甲基戊二酰亚胺中杂质的检测方法，在对杂质iv‑1、杂质iv‑3、杂质iv‑6进行检测的同时，排除杂质iv‑2、杂质iv和其他未知杂质对检测的干扰。能够有助于3,3‑四亚甲基戊二酰亚胺以及盐酸丁螺环酮的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及盐酸丁螺环酮的合成中间体3，3-四亚甲基戊二酰亚胺中杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的检测方法。
背景技术
盐酸丁螺环酮用于治疗各种焦虑症和抑郁状态，适应不良行为以及强迫症的辅助治疗。该药物最早是在美国上市的新一代非二氮杂卓类抗焦虑药。与传统药物相比，盐酸丁螺环酮具有选择性高、疗效确切、无依赖性、不产生镇静作用和不良反应少等优点，因此是迄今为止较为理想的抗焦虑药物之一。
3,3-四亚甲基戊二酰亚胺为合成盐酸丁螺环酮的中间体，其质量控制关系到盐酸丁螺环酮的质量，应进行严格的控制。
根据3,3-四亚甲基戊二酰亚胺的合成工艺，其杂质谱如表1所示。
表1 3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质谱列表
杂质来源：
杂质iv和杂质iv-1制备3,3-四亚甲基戊二酰亚胺反应不完全的起始物料。
杂质iv-3为生产3,3-四亚甲基戊二酰亚胺过程中产生的工艺副产物，在后续制备丁螺环酮的工艺中可能与起始物料嘧啶并哌嗪季铵盐反应生成丁螺环酮中的杂质H。反应式如下：
杂质iv-6为制备3,3-四亚甲基戊二酰亚胺过程中可能产生的工艺副产物，由杂质iv-3在硫酸作用下生成的杂质iv-5(在反应液中不能稳定存在)发生氨解反应而来，反应式如下：
杂质iv-2为生产3,3-四亚甲基戊二酰亚胺过程中产生的工艺副产物。
以上杂质均可能残留到3,3-四亚甲基戊二酰亚胺中，需要对其残留情况进行研究，提高中间体的质量要求，保证盐酸丁螺环酮成品质量。
上述杂质对紫外的响应差异较大。杂质iv几乎无紫外吸收，沸点约为130℃，适宜采用气相色谱法进行检测。杂质iv-2和其他未知杂质在液相色谱仪上的紫外响应值较大，采用较小的供试品浓度(0.3mg/ml)进行高效液相色谱法研究即可，但是相同浓度下，杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6紫外响应较小，方法的检测灵敏度达不到准确定量的要求，需采用较高的供试品浓度(10mg/ml)。这导致采用适宜杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6高效液相色谱法研究的供试品浓度时，存在iv-2和其他未知杂质的干扰。
此外，杂质iv-1具有极性较小，保留弱的特点；杂质iv-3、杂质iv-6具有结构相似，极性相近较难分离的特点。现有技术下缺少杂质iv-3和杂质iv-6的检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种盐酸丁螺环酮的合成中间体3,3-四亚甲基戊二酰亚胺中杂质的检测方法，有效排除杂质iv-2和其他未知杂质干扰杂质iv-1、杂质iv-3、杂质iv-6检测的快速、灵敏和准确的高效液相分析方法。
本发明具体技术方案如下：
一种盐酸丁螺环酮中间体3,3-四亚甲基戊二酰亚胺中杂质的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱柱采用十八烷基键合硅胶柱为填充剂，流动相为磷酸二氢铵溶液-乙腈，二者体积比为25:(9～10)，等度洗脱，检测波长为210nm，所述杂质结构如下：
本发明所述的检测方法：
供试品溶液取3,3-四亚甲基戊二酰亚胺约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液取杂质iv-1对照品、杂质iv-3对照品和杂质iv-6对照品各适量，加流动相溶解并定量稀释成每1ml中分别约含杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6各约20μg的溶液。
精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6含量均不超过0.2％视为合格。
优选色谱柱Shim-Pack VP-ODS(4.6mm×250mm，5μm)或Waters C18，(4.6mm×250mm，5μm)或者效能相当的色谱柱。
本发明所述的检测方法，优选进样体积20μl，流速为每分钟0.9～1.1ml；等度洗脱时间不低于30分钟。
本发明所述的检测方法，优选磷酸二氢铵溶液的浓度为0.025mol/L。
本发明所述的检测方法，优选磷酸二氢铵溶液的pH值为2.4～2.5，更优选pH值为2.5。
本发明所述的检测方法，优选磷酸二氢铵溶液与乙腈的体积比为25:10。
优选柱温为50～60℃，更优选柱温为55℃。
本发明所述的检测方法，优选进样体积20μl，流速为每分钟0.9～1.1ml(更优选每分钟1.0ml)；等度洗脱时间不低于30分钟。
本发明所述的检测方法，优选供试品溶液浓度为10mg/ml。
本发明有益效果：本发明通过对色谱柱、柱温、流动相种类、缓冲盐的pH和浓度的筛选，提高了杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6在色谱柱的保留，同时避免了未知杂质、杂质iv和杂质iv-2对杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6检测的干扰，建立了杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的检测方法。本方法采用等度条件，分析速度快，灵敏度和准确度高，能够很好的检测3,3-四亚甲基戊二酰亚胺中iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的含量。
附图说明
图1为实施例1采用ShimNex Cs-C18色谱柱对3,3-四亚甲基戊二酰亚胺中杂质的分离结果色谱图。图1中自下而上分别是流动相、杂质iv溶液、杂质iv-1溶液、杂质iv-2溶液、杂质iv-3溶液、杂质iv-6溶液、混合溶液。
图2为实施例1采用agilent Infinitylab proshell 120EC-C18色谱柱对3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质的分离结果色谱图。
图3为实施例1采用Waters C18色谱柱对3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质的分离结果色谱图。
图4为实施例2采用Waters C18色谱柱，柱温30℃下对3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质的分离结果色谱图。
图5为实施例2采用Waters C18色谱柱，柱温40℃下对3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质的分离结果色谱图。
图6为实施例2采用Waters C18色谱柱，柱温55℃下对3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质的分离结果色谱图。
图7为实施例3流动相采用不同有机相对3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质的分离结果色谱图。
图8为实施例4采用Waters C18色谱柱供试品检验色图谱，色谱图中自上而下为对照溶液、Y220606352供试品溶液和空白溶液。
图9为实施例4采用Shim-pack VP-ODS色谱柱供试品检验色图谱(，色谱图中自上而下为对照溶液、对照溶液、Y220606352供试品溶液和空白溶液。
图10为实施例5杂质iv-1线性关系曲线图。
图11为实施例5杂质iv-3线性关系曲线图。
图12为实施例5杂质iv-6线性关系曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1不同色谱柱对盐酸丁螺环酮中间体3,3-四亚甲基戊二酰亚胺杂质的检测
溶剂：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-乙腈(85:15)
杂质iv溶液：精密量取杂质iv 20μl，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6溶液：取杂质iv-6约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-1溶液：精密量取杂质iv-1 20μl，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-2溶液：取杂质iv-2约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3溶液：取杂质iv-3约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
混合溶液：取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取杂质iv溶液、杂质iv-1溶液、杂质iv-2溶液、杂质iv-3溶液、杂质iv-6溶液各1.0ml置同一10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取3,3-四亚甲基戊二酰亚胺约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
色谱柱1：ShimNex Cs-C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱柱2：Agilent Infinitylab proshell 120EC-C18(4.6mm×250mm,4μm)。
色谱条件：
仪器：HPLC
流动相：0.025mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(25:15)；
流速：每分钟1.0ml检测波长：210nm进样量：20μl柱温：35℃。
采用ShimNex Cs-C18色谱柱分析：分别精密量取流动相、杂质iv、杂质iv-1、杂质iv-2、杂质iv-3、杂质iv-6的对照品溶液以及混合溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图。结果见图1。
采用Agilent Infinitylab proshell 120EC-C18色谱柱分析：分别精密量取流动相、杂质iv、杂质iv-6的溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图。结果见图2。
上述色谱分离结果显示采用ShimNex Cs-C18色谱柱或agilent Infinitylabproshell 120EC-C18色谱柱，杂质iv在杂质iv-6出峰位置出峰，干扰杂质iv-6的检测，并且供试品中有杂质峰干扰杂质iv-6和杂质iv-3的检测。
色谱柱3：Waters C18(4.6mm×250mm,5μm)；
色谱条件：
仪器：HPLC
流动相：0.025mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(1250:500)；
溶剂：流动相。
流速：每分钟1.0ml检测波长：210nm进样量：20μl柱温：35℃
分别精密量取杂质iv溶液、杂质iv-1溶液、杂质iv-2溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液及混合溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。分析结果见图3。
色谱分析结果显示，采用极性更小的流动相和Waters C18色谱柱杂质iv-3与杂质iv-6出峰时间较ShimNex Cs-C18色谱柱靠后，但杂质iv-1与杂质iv-6未达到基线分离，分离度为1.4；杂质iv-3附近的杂质峰跑到杂质iv-3前面完全分离，主峰与杂质iv-3的分离度为1.4，杂质iv未出峰，因此以Waters C18色谱柱对色谱条件进行后续优化。
实施例2改变柱温对盐酸丁螺环酮中间体3,3-四亚甲基戊二酰亚胺中各杂质分离的影响
色谱条件：
仪器：HPLC
色谱柱：Waters C18(4.6mm×250mm,5μm)；
流动相：0.025mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(1250:500)；
流速：每分钟1.0ml；
检测波长210nm；
进样量：20μl；
分别采用柱温：30℃、40℃、和55℃等度洗脱。
精密量取实施例1中的混合溶液20μl，注入色谱仪，记录色谱图。分析结果见图4～6。
以上试验各杂质的分离度和信噪比见表2、3。
表2改变柱温各杂质分离度
| 分离度 | 杂质iv-1和杂质iv-6 | 杂质iv-3 |
| 柱温30℃ | 1.1 | 1.4 |
| 柱温35℃(方法2) | 1.4 | 1.3 |
| 柱温40℃ | 1.7 | 1.8 |
| 柱温55℃ | 2.0 | 3.4 |
表3改变柱温各杂质峰高的信噪比
| 信噪比 | 杂质iv-1 | 杂质iv-6 | 杂质iv-3 | 杂质iv-2 |
| 柱温30℃ | 997 | 568 | 223 | 12721 |
| 柱温40℃ | 1069 | 725 | 213 | 12218 |
| 柱温55℃ | 1857 | 1278 | 368 | 22876 |
结果显示：
柱温为30℃时，杂质iv-1与杂质iv-6分离度为1.1，杂质iv-3与主峰的分离度为1.4。
柱温为40℃时，杂质iv-1与杂质iv-6分离度为1.7，杂质iv-3与主峰的分离度为1.8，升高柱温有利于改善分离度。但是空白对杂质iv-3有干扰。
柱温为55℃时，杂质iv-1与杂质iv-6分离度为2.0，杂质iv-2与主峰的分离度为3.4，空白溶剂峰不干扰杂质iv-3的检测。杂质iv-1、杂质iv-3、杂质iv-6与相邻峰之间的分离度和峰高的信噪比均满足检测的要求并且空白不干扰检测。
实施例3流动相采用不同有机相种类对比
色谱柱3：Waters C18(4.6mm×250mm,5μm)；
色谱条件：
仪器：HPLC
流动相：0.025mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-甲醇(1250:750)；
溶剂：流动相。
流速：每分钟1.0ml检测波长：210nm进样量：20μl柱温：35℃
分别精密量取iv溶液、iv-1溶iv-1液、iv-2溶液、iv-3溶液和iv-6溶液及混合溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。分析结果见图7。
色谱图结果显示：采用磷酸二氢铵溶液-甲醇体系做流动相，杂质iv-1和杂质iv-6未完全分离，该体系较磷酸二氢铵溶液-乙腈体系分离效果差。
实施例4供试品检验
供试品溶液：取本品(批号：Y220606352)约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取杂质iv-1对照品、杂质iv-3对照品和杂质iv-6对照品各适量，加流动相溶解并定量稀释成每1ml中分别约含杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6各约20μg的溶液。
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(WatersC18(4.6mm×250mm,5μm)或Shim-Pack VP-ODS(4.6mm×250mm，5μm)；以0.025mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(v/v，25:9)为流动相，等度洗脱30分钟；流速为每分钟1.0ml；检测波长为210nm；柱温为55℃；进样体积20μl。
测定法：精密量取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
限度：供试品溶液色谱图中，如有与杂质iv-1峰、杂质iv-3峰和杂质iv-6峰保留时间一致的色谱峰，分别按外标法以峰面积计算，含杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6均不得过0.2％。
供试品检验结果如图8、图9和表4所示。样品检验结果显示WatersC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱和Shim-Pack VP-ODS，(4.6 mm×250mm，5μm)均可以用于本品中杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6检测。
表4样品杂质检验结果
实施例5方法学验证过程
1.系统适用性和专属性试验
溶液配制：
溶剂：流动相
杂质iv定位溶液：取杂质iv对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-1定位溶液：取杂质iv-1对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-2定位溶液：取杂质iv-2对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3定位溶液：取杂质iv-3对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6定位溶液：取杂质iv-6对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取杂质iv-1定位溶液、杂质iv-3定位溶液和杂质iv-6定位溶液各0.4ml，置同一10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
混合溶液：取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，再精密量取杂质iv定位溶液、杂质定位iv-1溶液、杂质iv-2定位溶液、杂质iv-3定位溶液和杂质iv-6定位溶液各0.4ml，置同一10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密量取溶剂、对照品溶液、各杂质定位溶液、供试品溶液与混合溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表5～表6。
表5专属性结果
表6系统适用性试验结果
结论：在此条件下，杂质iv无响应；杂质iv-3在210nm处有最大吸收；3,3-四亚甲基戊二酰亚胺及其他各杂质均是末端吸收，因此将检测波长定为210nm。
专属性：空白溶剂峰、杂质iv、杂质iv-2及主峰均不干扰杂质iv-1、iv-3、iv-6的检测；混合溶液中，杂质iv-1、iv-3、iv-6与相邻峰的分离度均不小于1.5。
对照品溶液连续进5针，杂质iv-1、杂质iv-3、杂质iv-6色谱峰的理论板数均大于5000，各峰拖尾因子均不大于1.2，峰高的S/N均大于100；各峰面积的RSD均小于5.0％，保留时间RSD均小于1.0％。
以上结果表明，方法的系统适用性和专属性良好。
2.定量限与检测限试验
溶液配制：
溶剂：流动相
杂质iv-1溶液：取杂质iv-1对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3溶液：取杂质iv-3对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6溶液：取杂质iv-6对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
定量限(LOQ)溶液：精密量取杂质iv-1定位溶液、杂质iv-3定位溶液各0.2ml和杂质iv-6定位溶液0.1ml，置同一5ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取0.2ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。平行制备六份。
检测限(LOD)溶液：精密量取定量限溶液3.3ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取检测限溶液和定量限溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表7～表9。
表7检测限试验结果
表8定量限试验结果
表9定量限重复性试验结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD(％) |
| 杂质iv-1 | 637 | 594 | 635 | 585 | 526 | 677 | 609 | 8.7 |
| 杂质iv-3 | 378 | 381 | 375 | 459 | 438 | 364 | 399 | 9.9 |
| 杂质iv-6 | 580 | 571 | 602 | 547 | 570 | 676 | 591 | 7.7 |
结论：杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的最低检测浓度分别0.28μg/ml、0.28μg/ml、0.13μg/ml，分别相当于供试品浓度的0.0028％、0.0028％、0.0013％，相当于限度浓度的1.40％、1.40％、0.65％。
杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的最低定量浓度分别0.84μg/ml、0.85μg/ml、0.41μg/ml，分别相当于供试品浓度的0.0084％、0.0085％、0.0041％，相当于限度浓度的4.20％、4.25％、2.05％，均低于限度浓度的10％，信噪比分别为19.3、12.0、18.5，方法的灵敏度较高；6份定量限溶液中，杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6峰面积的RSD均小于10.0％，定量限重复性较好。
3.线性与范围试验
溶液配制：
溶剂：流动相
杂质iv-1溶液：取杂质iv-1对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3溶液：取杂质iv-3对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6溶液：取杂质iv-6对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
200％线性溶液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各2.0ml，置同一个50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
20％线性溶液：精密量取200％线性溶液1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
50％线性溶液：精密量取200％线性溶液2.5ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
80％线性溶液：精密量取200％线性溶液4.0ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
100％线性溶液：精密量取200％线性溶液5.0ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
120％线性溶液：精密量取200％线性溶液6.0ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
150％线性溶液：精密量取200％线性溶液7.5ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取各线性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。以各杂质的浓度C(μg/ml)为横坐标，以各杂质的峰面积A为纵坐标进行线性回归(LOQ峰面积取用②项下表10中定量限重复性中的平均峰面积)。试验结果见表10～表12。杂质iv-1、iv-3和iv-6线性关系曲线图如图10-12所示。
表10杂质iv-1线性与范围试验结果
表11杂质iv-3线性与范围试验结果
表12杂质iv-6线性与范围试验结果
结论：杂质iv-1在0.84μg/ml～31.38μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积线性关系良好，线性方程相关系数r为0.9999，残差平方和为37682，Y轴截距绝对值相当于100％响应值的9.8％；杂质iv-3在0.85μg/ml～33.26μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积线性关系良好，线性方程相关系数r为0.9993，残差平方和为584723，Y轴截距绝对值相当于100％响应值的15.4％；杂质iv-6在0.41μg/ml～31.78μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积线性关系良好，线性方程相关系数r为0.9997，残差平方和为1007186，Y轴截距绝对值相当于100％响应值的19.6％。
4.溶液稳定性试验
溶液配制：
溶剂：流动相
杂质iv-1溶液：取杂质iv-1对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3溶液：取杂质iv-3对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6溶液：取杂质iv-6对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各0.2ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
2倍限度的对照品贮备液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各2.0ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取本品约100mg，精密称定，再精密量取2倍限度浓度的对照品贮备液5.0ml，置同一10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
取溶剂、对照品溶液、供试品溶液及加标供试品溶液于下表中的不同时间，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表13～表15。
表13对照品溶液稳定性试验
表14供试品溶液稳定性试验
表15加标供试品溶液稳定性试验
结论：(1)对照品溶液中，杂质iv-1在不同时间点的峰面积与0小时峰面积的比值在99.9％～101.6％之间；iv-3在不同时间点的峰面积与0小时峰面积的比值在99.9％～103.2％之间；iv-6在不同时间点的峰面积与0小时峰面积的比值在99.9％～101.7％之间，对照品溶液在室温条件下放置24小时内良好；
(2)供试品溶液中，24h内均未检出杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6，也未降解产生影响杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6检测的其他杂质，供试品溶液在24h内稳定性良好。加标供试品溶液中，不同时间点杂质iv-1、杂质iv-3杂质iv-6含量与0小时含量相比，比值分别在99.5％～101.8％、98.4％～101.6％和100.0％～101.0％之间，也未降解产生影响杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6检测的其他杂质，加标供试品溶液在室温条件下24h内稳定性良好。
5.准确度与重复性试验
溶液配制：
溶剂：流动相
杂质iv-1溶液：取杂质iv-1对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3溶液：取杂质iv-3对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6溶液：取杂质iv-6对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各0.2ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备2份。
2倍限度浓度的对照品贮备液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各4.0ml，置同一个100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
40％准确度溶液：取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取2倍限度浓度的对照品贮备液2.0ml，置同一10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。
100％准确度溶液：称取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取2倍限度浓度的对照品贮备液5.0ml，置同一10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备6份，前三份溶液考察准确度。
120％准确度溶液：取本品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取2倍限度浓度的对照品贮备液6.0ml，置同一10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。
精密量取溶剂、对照品溶液、供试品溶液和3个浓度的准确度溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的测得量并计算回收率。试验结果见表16～表19。
表16重复性试验结果
表17杂质iv-1回收率试验结果
表18杂质iv-3回收率试验结果
表19杂质iv-6回收率试验结果
结论：6份加标供试品溶液中，杂质iv-1含量的RSD为0，杂质iv-3含量的RSD为2.1％，杂质iv-6含量的RSD为2.0％，均小于3.0％，符合规定，方法精密度良好。
三个不同浓度共9份准确度溶液中，杂质iv-1回收率在100.16％～102.39％之间，平均值为101.6％；杂质iv-3回收率在91.78％～96.58％之间，平均值为94.6％；杂质iv-6回收率在98.50％～99.75％之间，平均值为98.8％，方法的准确度较高。
6.中间精密度试验
溶液配制：
溶剂：流动相
杂质iv-1溶液：取杂质iv-1对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3溶液：取杂质iv-3对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6溶液：取杂质iv-6对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各0.2ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
2倍限度浓度的对照品贮备液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各4.0ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取本品约100mg，精密称定，精密量取2倍限度浓度的对照品贮备液5.0ml，置同一10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备6份。
于不同日期，换分析员B，在不同的仪器上同法测定6份加标供试品溶液，联合重复性试验的6个结果，共计12个测定结果进行分析。试验结果见表20。
表20中间精密度试验
结论：由不同试验人员，在不同日期，不同仪器上测定的12份加标供试品溶液中，杂质iv-1含量的RSD为4.8％，杂质iv-3含量的RSD为2.3％，杂质iv-6含量的RSD为1.4％，均小于6％，均符合规定，方法的中间精密度良好。
7.耐用性试验
溶液配制：
溶剂：流动相
杂质iv-1溶液：取杂质iv-1对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-3溶液：取杂质iv-3对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质iv-6溶液：取杂质iv-6对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各0.2ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
2倍限度浓度的对照品贮备液：精密量取杂质iv-1溶液、杂质iv-3溶液和杂质iv-6溶液各4.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取本品约100mg，精密称定，精密量取2倍限度浓度的对照品贮备液5.0ml，同置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
在表21和表22中的各考察条件下，分别精密量取对照品溶液和加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的测得量并计算回收率。考察色谱条件发生微小变化时对系统适用性试验结果及样品测定结果的影响。试验结果见表23～表25。
表21耐用性考察项目汇总表
表22耐用性所采用色谱柱信息
表23耐用性试验不同条件下对照品溶液考察结果
注：/代表不适用。
表24耐用性试验不同条件下系统重复性试验考察结果
注：/代表不适用。
表25耐用性试验不同条件下加标供试品溶液考察结果
注：/代表不适用。
结论：对照品溶液中，在磷酸盐缓冲液-乙腈比例(25:10.4)和磷酸二氢铵浓度(0.02mol/L)条件下，杂质iv-1和杂质iv-6未能达到分离，不符合要求。因此，流动相中乙腈比例不能高于10，磷酸二氢铵浓度不能低于0.025mol/L。其他各条件下，杂质iv-1、杂质iv-3、杂质iv-6与相邻杂质的分离度均大于1.5，各杂质峰的理论板数均大于2000，拖尾因子均小于1.2，各杂质峰峰高的信噪比S/N均大于100；系统重复性试验，各杂质峰峰面积的RSD均小于5.0％，保留时间RSD均小于1.0％，系统重复性良好。
加标供试品溶液中：
更换色谱柱，杂质iv-1、杂质iv-3、杂质iv-6的含量与标准条件下各杂质含量的比值在95.2％-100.0％之间，符合耐用性要求。
改变流速，杂质iv-1、杂质iv-3、杂质iv-6的含量与标准条件下各杂质含量的比值在95.0％-100.0％之间，符合耐用性要求。
改变柱温，杂质iv-1、杂质iv-3、杂质iv-6的含量与标准条件下各杂质含量的比值在95.0％-100.0％之间，符合耐用性要求。
改变有机相比例，在磷酸盐缓冲液-乙腈(25:9)的比例下，杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的含量与标准条件下各杂质含量的比值在95.2％-105.0％之间，符合耐用性要求。在磷酸盐缓冲液-乙腈(25:10.4)的比例下，杂质iv-1和杂质iv-6未达到分离，杂质iv-3与相邻的未知杂质未能达到分离，无法准确计算杂质iv-1、杂质iv-6和杂质iv-3的含量，所以磷酸盐缓冲液-乙腈比例优选的为25:9～25:10。
改变缓冲盐pH值，在pH2.4的条件下，杂质iv-1、杂质iv-3和杂质iv-6的含量与标准条件下各杂质含量的比值在95.2％-105.0％之间，符合耐用性要求。在pH2.6的条件下，杂质iv-3与相邻的未知杂质未能达到分离，所以缓冲盐pH为2.4～2.5。
改变磷酸二氢铵浓度，在当磷酸二氢铵浓度在0.02mol/L条件下，杂质iv-1和杂质iv-6未达到分离。当磷酸二氢铵浓度在0.03mol/L条件下杂质iv-3与主峰未达到分离，因此磷酸二氢铵浓度优选的为0.025mol/L。
该方法在色谱柱温度(50℃～60℃)、流速(0.9ml/min～1.1ml/min)、流动相中磷酸盐缓冲液-乙腈比例(25:9～25:10)、流动相的磷酸盐缓冲液浓度(0.025mol/L)、流动相的磷酸盐缓冲液pH(2.4～2.5)及更换不同品牌的色谱柱条件范围内变动时，对系统适用性和检测结果无影响，方法的耐用性良好。
Claims (8)
1.一种盐酸丁螺环酮中间体3，3-四亚甲基戊二酰亚胺中杂质的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，为Shim-Pack VP-ODS，4.6 mm×250mm，5μm或Waters XBridge®C18，4.6 mm×250mm，5μm，流动相为磷酸二氢铵溶液-乙腈，体积比为25:（9~10），等度洗脱，检测波长为210nm，所述杂质结构如下：
、和。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进样体积20µl，流速为每分钟0.9~1.1ml；等度洗脱时间不低于30分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于磷酸二氢铵溶液的浓度为0.025mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于磷酸二氢铵溶液的pH值为2.4~2.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于柱温为50~60℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于检测波长210nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于精密量取供试品溶液与杂质对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各杂质含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于供试品溶液浓度为10mg/ml。
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