CN115453014B - 一种丁苯酞及其有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种丁苯酞及其有关物质的检测方法。本发明的检测方法采用高效液相色谱法，采用5‑氟苯基丙基键合硅胶为填充剂，采用紫外检测器，检测波长210nm～280nm，以酸性盐溶液为流动相A，异丙醇、甲醇和乙腈的混合溶液为流动相B，按梯度洗脱。本发明提供的检测方法稳定、专属性好、灵敏度和准确度高，适合用于丁苯酞及其有关物质的药品注册质量研究。

Description

一种丁苯酞及其有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种丁苯酞及其有关物质的检测方法。

背景技术

丁苯酞化学名为3-丁基-l(H)-异苯并呋喃酮，为消旋-3-正丁基苯酞，又名芹菜甲素，最早从芹菜籽中被提取发现，其性状为无色或淡黄色的澄清油状液体，有特异香气，在光照和高温条件下容易发生降解。丁苯酞的结构如下：

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丁苯酞的常见合成工艺主要为如专利CN101962374A所公开的路线：

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根据丁苯酞的结构性质和主要合成工艺，丁苯酞的有关物质主要分为丁苯酞类似物、降解产物和工艺杂质，其中丁苯酞类似物包括烯基苯酞和烷基苯酞，如烯基苯酞包括甲烯苯酞、乙烯苯酞、丙烯苯酞、丁烯苯酞、戊烯苯酞，烷基苯酞包括苯酞、甲苯酞、乙苯酞、丙苯酞、戊苯酞；降解产物包括羟基丁苯酞、邻戊烯苯甲酸；而工艺杂质包括反应中间体邻戊酰基苯甲酸，以及开环中间体发生副反应的产物，如邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、1,2-二戊酰基苯等。丁苯酞的类似物大部分能够依靠工艺技术除去，而降解杂质和工艺杂质则成为产品质量控制的重点，尤其丁苯酞的主要降解杂质羟基丁苯酞和合成中间体邻戊酰基苯甲酸。目前的现有技术还没有报道有效的具备同时检测上述杂质的检测方法。因此，本领域急需有效检测丁苯酞及其各类杂质的检测方法，以实现产品质量的精准控制。

丁苯酞的国家药品标准（WS1-(X-124）-2005Z）记载了一种高效液相色谱法检测有关物质和含量，以甲醇-水(65：35)为流动相，检测波长280nm；但该方法无法有效检测降解杂质。专利CN110108818A的实施例1公开了一种高效液相色谱法同时检测羟基丁苯酞、丁烯苯酞和丙苯酞等多种杂质，但不适合检测工艺杂质如1,2-二戊酰基苯等。文章名称为《反相高效液相色谱法检测丁苯酞原料药中的杂质》（doi：10.16155/j.0254-1793.2020.07.16）中记载了一种反相高效液相色谱法，能同时检测羟基丁苯酞和丙苯酞等杂质，但无法检测烯基苯酞类杂质如丁烯苯酞。

因此，开发可靠的同时兼顾检测降解杂质、丁苯酞类似物杂质以及工艺杂质的有关物质检测方法，提高丁苯酞产品的质量研究准确性，提升产品安全可靠性，意义重大。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供一种丁苯酞及其有关物质的检测方法。该方法采用液相色谱法，能够同时方便又科学地检测丁苯酞及其降解杂质、丁苯酞类似物杂质和工艺杂质。

本发明提供的丁苯酞及其有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，以5-氟苯基丙基键合硅胶为填充剂，采用紫外检测器，检测波长210nm～280nm，以酸性pH值的盐溶液为流动相A，异丙醇、甲醇和乙腈的混合溶液为流动相B，按梯度洗脱。

进一步地，上述有关物质包含但不限于羟基丁苯酞、丁烯苯酞、邻戊烯苯甲酸、丙苯酞、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸单丁酯、邻戊酰基苯甲酸、邻苯二甲酸二丁酯、1,2-二戊酰基苯中的一种或多种。

进一步地，本发明所涉丁苯酞的有关物质代码和结构等信息如下：

。

进一步地，上述盐溶液的盐包含磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、醋酸铵、醋酸钠或醋酸钾。

进一步地，上述盐溶液的pH值为1.0～5.0，优选2.0～4.0。

进一步地，上述盐溶液的pH调节剂包含磷酸、盐酸或乙酸。

进一步地，上述盐溶液的浓度为1～50mmol/L；优选1～30mmol/L。

进一步地，上述检测波长为230±10nm，优选为230±3nm。

进一步地，上述流动相B中异丙醇、甲醇和乙腈的体积比为1～10：30～60：60～120。

进一步地，上述梯度洗脱包含如下程序：

。

优选地，上述梯度洗脱包含如下程序：

。

进一步地，上述色谱条件的柱温为1～40℃，优选20～40℃。

进一步地，上述色谱条件的流速为0.5～1.5ml/min，优选1.0ml/min。

进一步地，上述色谱条件的进样量为5～50μl，优选10～20μl。

进一步地，上述方法包括如下步骤：

（1）精密称取丁苯酞或任选地丁苯酞有关物质适量，用溶剂稀释制成供试品溶液或混合溶液；

（2）将供试品溶液或混合溶液注入液相色谱仪中，按照色谱条件检测。

进一步地，上述溶剂包含甲醇、乙醇、30～60%乙腈水溶液或流动相A与乙腈的体积比为70～40：30～60混合溶液；优选30～60%乙腈水溶液或流动相A与乙腈的体积比为70～40：30～60混合溶液。其中，流动相A的范围同上述色谱条件中流动相A的定义；乙腈水溶液的百分数“%”为体积百分比。

进一步地，上述供试品的每1ml中含有丁苯酞0.1～10mg；优选0.2～2mg；更优选1mg。

进一步地，上述混合溶液中，每1ml中含有羟基丁苯酞5～20μg，其它有关物质0.1～10μg；优选每1ml中含有羟基丁苯酞10μg，其它有关物质1μg；

有益效果：本发明的丁苯酞及其有关物质的检测方法专属性好、灵敏度高，各峰峰型好，杂质峰与主峰以及杂质峰与杂质峰之间的分离度均大于1.5；方法准确度高，重复性和重现性好，精密度高，符合质量分析检测要求，适合用于本品的含量和有关物质的质量研究。

附图说明

图1：条件1的系统适用性溶液色谱图。

图2：条件2的系统适用性溶液色谱图。

图3：条件3的系统适用性溶液色谱图。

具体实施方式

下面将结合试验例和实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的各例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。各例中未注明的具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用样品、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为通过市购获得的本领域常规产品。

试验例1：丁苯酞有关物质检测方法的方法学考察

⒈溶液及其配制和计算方法

供试品溶液：取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每lml中约含1.0mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，加溶剂稀释制成每lml中约含1.0μg的溶液。

对照品溶液：取杂质Z1、Z2、Z3、Z6、M2、M3、M5、M6及M7对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每lml中约含杂质Z2、Z3、Z6、M2、M3、M5、M6、M7各1.0μg、Z1杂质10μg的溶液。

系统适用性溶液：取杂质Z1、Z2、Z3、Z6、M2、M3、M5、M6及M7对照品及供试品各适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每lml中约含杂质Z2、Z3、Z6、M2、M3、M5、M6及M7各1.0μg、Z1 杂质10μg、本品1.0mg的溶液。

说明：上述溶液配制所用溶剂为10mmol/l磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至2.0）-乙腈（50:50）。可以理解，本发明方法溶剂还包括其它能溶解上述物质的溶剂，包括但不限于甲醇、乙醇、30～60%乙腈水溶液或流动相A与乙腈的体积比为70～40：30～60的混合溶液，其中，所述流动相A为酸性pH值的盐溶液，所述盐溶液包括磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、醋酸铵、醋酸钠或醋酸钾，所述pH值为1.0～5.0，所述pH调节剂包含磷酸、盐酸或乙酸。但值得注意的是，本申请发明人经过试验摸索发现，当待检测物质中含有M2邻苯二甲酸等带羧酸基团化合物时，所述溶剂优选流动相A与乙腈的体积比为70～40：30～60的混合溶液时，杂质M2峰不会出现分叉或肩峰，且M5峰保留时间稳定，不会出现较大飘移。

测定法：精密量取各溶液，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。

计算方法：按外标法以峰面积计算。

⒉色谱条件筛选

参考丁苯酞国家药品标准中有关物质检测方法，通过对方法的优化，最终确定本品有关物质的检测方法，其中较为典型的色谱条件如下：

条件1：丁苯酞国家药品标准中有关物质方法

色谱条件：采用高效液相色谱法，紫外检测器，检测波长280nm，以SveaTM C184.6mm×250mm 5µm为色谱柱，甲醇-水（63:35）为流动相，进样体积20μl，流速1.0ml/min，柱温35℃。

试验结果及评价：条件1的系统适用性溶液色谱图见图1（仅Z系列杂质的混合溶液），所有杂质响应均较低；杂质Z1、Z6完全重合，不能分离；杂质Z3峰形差。

条件2：专利CN110108818A中实施例1方法

色谱条件：关键参数如检测波长227nm，色谱柱为Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl，4 .6mm×250mm，5μm；流动相A为0 .1％乙酸水溶液(体积比)；流动相B为乙腈-甲醇(1：1，体积比)；其它参数见专利CN110108818A中实施例1。

试验结果及评价：条件2的系统适用性溶液色谱图见附图2，所有杂质响应均较低；杂质M2出现肩峰，峰型差；杂质M6和M7分离度为1.2，分离度差；整体杂质出峰晚，且杂质M7峰位于倒峰位置。

条件3：

色谱条件：采用高效液相色谱法，紫外检测器，检测波长230nm，色谱柱以5-氟苯基丙基键合硅胶为填充剂（SHMADZU Shim-pack Velox，4.6×250mm，5μm），10mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，异丙醇：甲醇：乙腈（5:45:100，体积比）为流动相B，按下表梯度洗脱，进样体积10μl，流速1.0ml/min，柱温35℃。

试验结果及评价：条件3的系统适用性溶液色谱图见附图3，溶剂不干扰供试品中各杂质检测；各峰峰型好，各杂质与主峰、杂质与杂质间分离度均符合规定。此外，流动相中异丙醇的加入可以有效平衡主峰与其前后杂质峰的分离度，尤其能显著改善主峰后杂质峰的分离度。

综上研究结果，为了同时满足检测灵敏度、分离度和峰型，拟定色谱条件3作为有关物质检测条件，并对方法进行验证。

试验例2：有关物质方法验证

本试验下所用溶液及其配制同试验例1，色谱条件为试验例1中条件3。

⒈专属性

取已知杂质Z1 、Z2 、Z3、Z6、M2、M3、M5、M6及M7，空白溶剂、系统适用性溶液、供试品溶液适量，按拟定的色谱条件进样测定。结果见表2-1，色谱图见附图3。

试验结果表明：在拟定的色谱条件下，空白溶剂不干扰各待测组分及主峰的检测，各已知杂质及主成分与其相邻峰之间的分离度均大于1.5，在系统适用性溶液中，主峰及各已知杂质的纯度均符合规定，表明拟定的色谱条件专属性良好，各峰拖尾因子均小于1.2，各峰峰型好。在该条件下各组分出峰顺序为M2、M5、M3、Z1 ，Z6 ，Z3-1，丁苯酞主成分，Z3-2，Z2、M7、M6，其中Z3-1和Z3-2为Z3的顺反异构体，在以下的方法验证中两个峰合起来计算Z3。

⒉强制降解实验

为了考察丁苯酞（简称“本品”）可能的降解途径及拟定色谱条件对降解产物的分离检测能力，进行强制降解试验。样品制备方法：称取本品(批号：000820)适量，经强力破坏后用乙腈溶解并稀释制成每1ml约含丁苯酞1.0mg的溶液，即得。试验条件见表2-2。

照拟定的色谱条件，取上述溶液测定，各杂质含量均按面积归一化法计算。结果见表2-3。

在本色谱系统条件下，空白溶剂均不干扰各破坏样品中的杂质检测，各降解杂质与主峰之间及各已知杂质峰之间均能有效分离，主峰纯度参数均符合规定，各破坏样品物料平衡均在95%~105%之间。表明，在拟定的色谱条件能够有效的检出可能降解的杂质。

⒊检测限、定量限

取丁苯酞对照品及各已知杂质对照品适量，精密称定，分别用溶剂溶解并逐级稀释制成一定浓度的对照品溶液，当信噪比约为10时，确定为该物质的定量限，当信噪比约为3时，确定为该物质的检测限。结果见表2-4。

试验结果表明：本品有关物质检查拟定的进样浓度为1.0mg/ml，进样量10µl，绝对进样量为10000ng。绝对进样量大于杂质M2 、M5 、M3、M7、M6、Z1、Z2、Z3、Z6检测限的10000倍，表明拟定的进样浓度能够保证本品杂质的有效检出。

⒋线性及范围

取杂质MZ2 、MZ3 、MZ5、 MZ6、MZ7对照品各适量，精密称定，用溶剂稀释制成定量限浓度、限度浓度的50%、80%、100%、120%、150%、200%的对照品溶液，精密量取上述各溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进样线性分析，结果见表2-5。

备注：Z3线性采用Z3-峰1与Z3-峰2峰面积之和与浓度进行线性分析。

由试验结果可知，M2浓度在0.0204μg/ml～2.0360μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；M5浓度在0.0505μg/ml～2.2440μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；M3浓度在0.0453μg/ml～2.0120μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；M7浓度在0.0462μg/ml～2.0540μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；M6浓度在0.0503μg/ml～2.2360μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；Z1浓度在0.0847μg/ml~22.4200μg/ml（LOQ~200%限度浓度）之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；Z2浓度在0.0304μg/ml~2.0260μg/ml（LOQ~200%限度浓度）之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；Z3浓度在0.0424μg/ml~2.1200μg/ml（LOQ~200%限度浓度）之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；Z6浓度在0.12000μg/ml~2.4000μg/ml（LOQ~200%限度浓度）浓度范围之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

⒌进样精密度

将本品系统适用性溶液连续进样6次，记录色谱图，计算各杂质峰面积及保留时间的RSD。

试验结果显示，系统适用性溶液中各杂质及主成分的各峰面积RSD约0.2~0.5%，保留时间的RSD约0.01~0.04%，均小于2.0%，满足液相色谱测定的精密度要求。

⒍重复性

为了考察本品有关物质测定方法的精密度，制备6份供试品溶液，按拟定方法进行检测。试验结果见表2-6。

由以上结果表明，该方法测定本品的杂质，6份样品的测定结果无显著差异，重复性良好。

⒎准确度

为了考察拟定的检测方法对本品中已知杂质M2、M5、M3、M7、M6、Z1、Z2、Z3、Z6的检测结果与真实值之间的接近程度，采用加样回收的方式对准确度进行验证。取已知各杂质含量的供试品适量，按拟定方法制备供试品溶液，在供试品溶液中分别加入限度浓度50%、100%、150%的已知杂质后进样测定，计算回收率。

试验结果显示：M2回收率在98.04%~102.67%之间，平均回收率为100.9%，回收率RSD为0.9%；M5回收率在98.53%~100.89%之间，平均回收率为100.0%，回收率RSD为0.9%；M3回收率在98.84%~102.56%之间，平均回收率为100.5%，回收率RSD为0.3%；M7回收率在95.25%~99.15%之间，平均回收率为96.8%，回收率RSD为0.5%；M6回收率在99.13%~102.91%之间，平均回收率为101.2%，回收率RSD为0.6%；Z1回收率在98.45%~100.26%之间，平均回收率为99.4%，回收率RSD为0.6%；Z2回收率在98.59%~100.40%之间，平均回收率为99.2%，回收率RSD为0.5%；Z3回收率在92.92%~97.84%之间，平均回收率为95.6%，回收率RSD为2.0%；Z6回收率在100.69%~109.10%之间，平均回收率为103.4%，回收率RSD为2.7%；且所有杂质9份样品回收率RSD均小于3.0%，说明拟定的检测方法准确度高。

⒏耐用性

为了验证在拟定的色谱条件发生微小变动时，测定结果的准确性不受影响的程度，对拟定色谱条件的耐用性进行了考察。取各溶液，按拟定条件进行测定。

试验结果表明，当检测波长、流速、柱温、色谱柱、流动相发生微小变动时，如检测波长变化±3nm、流速变化±0.5ml/min、柱温变化±5℃、变换不同型号色谱柱（填料不变）、流动相A的pH变化±1，在各条件下，溶剂均不干扰供试品中各杂质检测，各供试品溶液和系统适用性溶液的色谱图中丁苯酞的有关物质测定结果无显著差异，各杂质及主峰与其相邻峰分离度均大于1.5，符合要求。

实施例1：

色谱条件：梯度程序见下表3-1，其他条件同试验例2。

测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。

实施例2：

色谱条件：梯度程序见下表3-2，其他条件同试验例2。

测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。

实施例3：

色谱条件：流动相A为50mmol/L磷酸二氢钾溶液（用乙酸调节pH至5.0）为流动相A，甲醇-乙腈-异丙醇（30：120：10，v/v/v）为流动相B，其他条件同试验例2。

测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。

实施例4：

色谱条件：流动相A为1mmol/L磷酸二氢钾溶液（用盐酸调节pH至1.0）为流动相A，甲醇-乙腈-异丙醇（60：60：1，v/v/v）为流动相B，其他条件同试验例2。

测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。

实施例5：

色谱条件：流动相A为10mmol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH至3.0）为流动相A，甲醇-乙腈-异丙醇（40：100：5，v/v/v）为流动相B，其他条件同试验例2。

测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。

数据统计和总结：汇总试验例2“专属性项下”和上述实施例1～5的色谱图，统计峰面积、保留时间和分离度，结果显示：各对照品溶液色谱图中：各杂质和主药及其相邻峰的分离度均在1.5以上，符合分离度要求，各峰纯度指数符合要求，各方法专属性好，符合质量分析要求；且各杂质、主峰峰面积基本一致，证明各方法准确度高。

Claims (7)

1.一种丁苯酞及其有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，其特征在于，所述方法采用5-氟苯基丙基键合硅胶为填充剂，采用紫外检测器，检测波长210～280nm，以酸性pH值的盐溶液为流动相A，异丙醇、甲醇和乙腈的混合溶液为流动相B，按梯度洗脱；

所述有关物质为羟基丁苯酞、丁烯苯酞、邻戊烯苯甲酸、丙苯酞、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸单丁酯、邻戊酰基苯甲酸、邻苯二甲酸二丁酯、1,2-二戊酰基苯；

所述流动相B中异丙醇、甲醇和乙腈的体积比为1～10：30～60：60～120；

所述梯度洗脱包含如下程序：

；

所述盐溶液的盐包含磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、醋酸铵、醋酸钠或醋酸钾。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐溶液的浓度为1～50mmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐溶液的pH值为1.0～5.0；所述盐溶液的pH调节剂包含磷酸、盐酸或乙酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长为230±10nm。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测波长为230±3nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）精密称取丁苯酞或任选地丁苯酞有关物质适量，用溶剂稀释制成供试品溶液或混合溶液；

（2）将供试品溶液或混合溶液注入液相色谱仪中，按照色谱条件检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶剂为流动相A与乙腈的体积比为70～40：30～60混合溶液。