CN114354788B - 一种Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法，属于液相色谱检测技术领域。本发明采用反相液相色谱法，能有效分离工艺过程中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M。本发明具有灵敏度高、精密度高、含量测定结果准确、专属性和线性关系良好等优势，可用于Molnupiravir原料及制剂样品的质量控制。

Description

一种Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法。

背景技术

Molnupiravir，又称为EIDD-2801/MK4482，是一种核糖核苷类似物，可抑制多种RNA病毒的复制，包括SARS-CoV-2。EIDD-2801是抗病毒化合物EIDD-1931的口服形式；它可以作为药丸服用，并能被适当吸收，然后进入肺部。Molnupiravir化学名为((2R，3S，4R，5R)-3,4-二羟基-5-(4-(羟胺基)-2-氧嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)异丁酸甲酯，其CAS号为：2349386-89-4，分子式为C₁₃H₁₉N₃O₇，分子量为：329.31，化学结构为：

Molnupiravir是核糖核苷类似物EIDD-1931的口服生物可利用的异丙酯前药。Molnupiravir显示出广泛的抗流感病毒和冠状病毒的活性，如SARS-CoV-2，MERS-CoV，SARS-CoV。Molnupiravir有用于COVID-19和季节性，流行性流感的潜力。美国最近获得了170万剂可能有助于治疗COVID-19患者的Molnupiravir。在初步研究中，Molnupiravir减少了SARS-CoV-2冠状病毒的传播。利用Molnupiravir治疗COVID-19的临床试验目前正在进行。Molnupiravir是另一种抗病毒候选药物，最初是为了治疗流感而开发的。根据初步临床试验，该化合物有望对SARS-CoV-2高度有效。通过两种不同冠状病毒(SARS-CoV1和MERS)的动物研究，证明Molnupiravir可以改善肺功能、减少体重减轻并减少肺中的病毒量。除了针对冠状病毒的活性外，在实验室研究中，Molnupiravir还显示出针对季节性流感、呼吸道合胞病毒、基孔肯雅病毒、埃博拉病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和东部马脑炎病毒的活性。

为了确保Molnupiravir药品的安全有效，须对原料药和制剂的有关物质进行研究和控制。通过分析本品原料药的合成工艺路线，对杂质谱进行梳理，本品涉及的工艺副产物和降解产物等杂质主要有以下13种杂质。

以上杂质带入到原料药或制剂中，直接影响其质量、安全性、有效性。因此，如果能够检测或控制其中的杂质，将会更有利于Molnupiravir原料药及制剂的制备和质量控制。目前，尚无上述有关物质的检测方法。

发明内容

发明目的：为解决上述技术问题本发明提供了一种测定Molnupiravir有关物质的方法，使用该方法能够有效的分离多个杂质，且各杂质检测灵敏度高、线性范围宽、准确度良好。

技术方案：本发明提供了一种测定Molnupiravir原料和制剂中有关物质的方法，通过高效液相色谱法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相A为0.08％磷酸溶液～0.12％磷酸溶液(V/V)，流动相B为甲醇，以梯度进行洗脱；流动相流速为0.6ml/min～1.0ml/min。检测器为紫外吸收检测器，检测波长为270nm～280nm，柱温为20℃～30℃。

其中所述有关物质选自结构式如式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)、式(F)、式(G)、式(H)、式(I)、式(J)、式(K)、式(L)、式(M)所示的化合物，结构如下，

在一些实施方案中，所用的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为WatersAtlantis^TM T3柱，规格为4.6mm×150mm，填料粒径为3μm。

在一些实施方案中，流动相A磷酸溶液浓度为0.1％(V/V)。

在一些实施方案中，流动相的流速为0.8ml/min。

在一些实施方案中，紫外吸收检测器检测波长为275nm。

在一些实施方案中，色谱柱柱温为25℃。

在一些实施方案中，梯度洗脱程序如下，

洗脱时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0.0	100.0	0.0
5.0	90.0	10.0
			10.0	60.0	40.0
18.0	45.0	55.0
			28.0	20.0	80.0
30.0	20.0	80.0
			30.1	100.0	0.0
40.0	100.0	0.0

本发明提供的Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法，包括如下步骤：

(1)配制供试品溶液、对照溶液、分离度溶液、系统适用性溶液；

(2)设置高效液相检测条件：色谱柱为Waters Atlantis^TM T3柱，规格为4.6mm×150mm，填料粒径为3μm，以0.1％磷酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速为0.8ml/min，进行梯度洗脱，检测器检测波长为275nm，色谱柱柱温为25℃；

(3)分别吸取供试品溶液、对照溶液、分离度溶液、系统适用性溶液，注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析。

其中，所述的供试品溶液的配制方法为：精密称定Molnupiravir原料或制剂样品适量，加稀释剂溶解稀释成含Molnupiravir 1mg/ml的溶液；

所述的对照溶液的配制方法为：精密量取供试品溶液1ml，用稀释剂稀释制成Molnupiravir含量为1μg/ml的溶液；

所述的分离度溶液的配制方法为：

(S1)分别称取结构式如式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)、式(F)、式(G)、式(H)、式(I)、式(J)、式(K)、式(L)、式(M)所示的化合物，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml含各杂质对照品500μg的杂质对照品贮备溶液；

(S2)精密称定Molnupiravir，加稀释剂溶解，另取上述杂质对照品贮备溶液，制成每1ml含各对照品1μg、Molnupiravir 1mg的混合溶液，得到分离度溶液。

所述的系统适用性溶液的配制方法为：取Molnupiravir对照品适量，精密称定，加稀释剂5％乙腈(V/V)超声使溶解，另取步骤(S1)中式(A)对照品贮备液、式(B)所示结构化合物对照品贮备液、式(C)所示结构化合物对照品贮备液、式(D)所示结构化合物对照品贮备液、式(E)所示结构化合物对照品贮备液适量，制成每1ml约含各杂质1μg、Molnupiravir1mg的混合溶液。

配置供试品溶液、对照溶液、分离度溶液、系统适用性溶液的稀释剂为5％乙腈(V/V)。

步骤(2)所述梯度洗脱程序如下：

有益效果：

本发明公开了一种Molnupiravir原料及其制剂中有关物质检测方法，该方法灵敏度高，精密度高，含量测定结果准确，专属性和线性关系良好，可用于Molnupiravir原料及制剂的质量控制。本发明，选用亲水性Waters Atlantis^TM T3柱极大的改善了极性差异大物质在反相色谱系统中保留能力弱的缺点，实现对Molnupiravir原料及其制剂中杂质的高灵敏、高准确地定性定量研究，为Molnupiravir原料及其制剂的质量评估奠定基础。

附图说明

图1为实施例1中分离度考察中空白溶液的色谱图；

图2为实施例1中分离度考察中分离度溶液的色谱图；

图3为实施例1中分离度考察中供试品溶液的色谱图；

图4为实施例2中分离度考察中供试品溶液的色谱图。

具体实施方式

附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制。

以下通过实施例形式，对本发明涉及的Molnupiravir有关物质检测方法作进一步的详细说明。

实施例1：Molnupiravir原料有关物质的测定

(1)高效液相色谱条件

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Waters Atlantis^TM T3柱(4.6mm×150mm，3μm)，以0.1％磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，按照下表1进行梯度洗脱，流速为每分钟0.8ml；检测波长为275nm；柱温为25℃。

表1梯度洗脱

(2)溶液配制

供试品溶液：取Molnupiravir适量，精密称定，加稀释剂5％乙腈(V/V)超声使溶解并稀释制成每1ml约含Molnupiravir 1mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml，用稀释剂5％乙腈(V/V)稀释制成每1ml约含Molnupiravir1μg的溶液。

杂质对照品贮备液：分别杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品、杂质L对照品、杂质M对照品适量，分别加稀释剂5％乙腈(V/V)溶解并稀释制成每1ml约含各杂质500μg的溶液。

分离度溶液：取Molnupiravir对照品适量，精密称定，加稀释剂5％乙腈(V/V)超声使溶解，另取上述各杂质对照品贮备液适量，制成每1ml约含各杂质1μg、Molnupiravir 1mg的混合溶液。

系统适用性溶液：取Molnupiravir对照品适量，精密称定，加稀释剂5％乙腈(V/V)超声使溶解，另取上述杂质A对照品贮备液、杂质B对照品贮备液、杂质C对照品贮备液、杂质D对照品贮备液、杂质E对照品贮备液适量，制成每1ml约含各杂质1μg、Molnupiravir 1mg的混合溶液。

空白溶液：稀释剂5％乙腈(V/V)；

精密取供试品溶液、对照溶液及分离度溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，按加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.3倍(0.03％)的峰忽略不计。

(3)分离度考察

参照实施例中前述方法配制空白溶液、分离度溶液、供试品溶液以及对照溶液进行测定。图谱见图1、图2、图3。结果表明，采用本发明的色谱条件，空白溶液无干扰，主成分与杂质之间以及各杂质之间均能有效分离，表明本方法系统适用性良好。

(4)强制降解试验考察

取Molnupiravir适量，分别放置于酸、碱、氧化、高温、高湿和光照条件下进行强制降解，制成适当的溶液并同比例配制空白破坏溶液进样，按建立的方法进行分离分析，采用DAD检测器，对各条件下样品中杂质进行测定并考察主峰峰纯度，检测波长范围在190nm～400nm。具体溶液配制过程见表2。分别精密量取上述溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3、表4。空白溶液均无干扰；在未破坏条件及各降解条件下各已知杂质峰及主成分峰与相邻峰之间分离度均大于1.5，各降解条件下主峰纯度因子均大于990，各降解条件下物料平衡均在90％～110％之间，均符合要求。结合(3)分离度考察中各已知杂质分离度考察结果，表明本方法专属性良好。

表2 Molnupiravir强制降解试验(破坏试验)

表3强制降解实验结果-1

表4强制降解实验结果-2

(5)灵敏度考察

参照实施例中方法配制主成分(Molnupiravir)对照品和杂质对照品贮备液，分别精密量取各杂质对照品贮备液适量，用稀释剂逐步稀释测定，将信噪比约为10:1时作为定量限，考察各杂质检测灵敏度。结果见表2。结果表明本方法灵敏度良好。

表2灵敏度考察结果

杂质名称	浓度(μg/ml)	信噪比	相当于供试品浓度百分比
				Molnupiravir	0.1030	16.1	0.010％
杂质A	0.0946	24.6	0.009％
				杂质B	0.0938	31.9	0.009％
杂质C	0.1057	17.6	0.010％
				杂质D	0.1201	13.9	0.012％
杂质E	0.0935	17.6	0.009％

(6)线性考察

参照实施例中方法配制主成分(Molnupiravir)对照品和杂质对照品贮备液，分别精密量取各杂质对照品贮备液适量，用稀释剂稀释制成一系列浓度，作为各成分的线性溶液。检测结果见下表3。结果表明，采用本发明的色谱条件，各待测成分线性关系良好。

表3线性考察结果

/>

(7)校正因子

采用标准曲线法测定校正因子。取上述线性结果测得的校正因子，结果见表4。

表4校正因子

/>

(8)溶液稳定性考察

分别于不同时间取系统适用性溶液、对照溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表5、表6。结果表明，系统适用性溶液和对照溶液在低温(5℃)条件下放置30小时，各杂质峰面积及主峰峰面积与0小时比较，比值均在90.0％～110.0％之间，均符合要求，表明在低温(5℃)条件下，系统适用性溶液和对照溶液至少放置30小时内稳定。

表5有关物质溶液稳定性试验-系统适用性溶液

表6有关物质溶液稳定性试验-对照溶液

(9)准确度考察

精密称取Molnupiravir样品9份，分别加入杂质限度50％、100％、150％的杂质对照品溶液，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。分别精密量取各供试品溶液稀释1000倍，作为对照溶液。分别精密量取上述供试品溶液和对照溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以各杂质[(测的量-本地量)/加入量]计算回收率，结果见表7。结果表明，各杂质回收率均在80％～120％之间，RSD小于10.0％，表明本方法准确度良好，适用于本品有关物质检测。

表7准确度计算表

杂质名称	回收率范围	平均回收率	RSD
				杂质A	97.39％～107.77％	100.6％	3.7％
杂质B	101.70％-106.35％	104.2％	1.7％
				杂质C	101.51％～105.29％	103.3％	1.2％
杂质D	103.21％-107.42％	105.7％	2.1％
				杂质E	100.12％～107.12％	103.5％	2.0％

实施例2：Molnupiravir胶囊有关物质的测定

(1)高效液相色谱条件

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Waters Atlantis^TM T3柱(4.6mm×150mm，3μm)，以0.1％磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，按照下表8进行梯度洗脱，流速为每分钟0.8ml；检测波长为275nm；柱温为25℃。

表8梯度洗脱

(2)溶液配制

供试品溶液：取Molnupiravir胶囊内容物适量，精密称定，加稀释剂5％乙腈(V/V)超声使溶解并稀释制成每1ml约含Molnupiravir 1mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml，用稀释剂5％乙腈(V/V)稀释制成每1ml约含Molnupiravir 1μg的溶液。

杂质对照品贮备液：分别称取式(A)对照品、式(B)对照品、式(C)对照品、式(D)对照品、式(E)对照品适量，分别加稀释剂5％乙腈(V/V)溶解并稀释制成每1ml约含各杂质500μg的溶液。

系统适用性溶液：取Molnupiravir对照品适量，精密称定，加稀释剂5％乙腈(V/V)超声使溶解，另取上述各杂质对照品贮备液适量，制成每1ml约含各杂质1μg、Molnupiravir1mg的混合溶液。

空白溶液：稀释剂5％乙腈(V/V)；

精密取供试品溶液、对照溶液及系统适用性溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，按加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.3倍(0.03％)的峰忽略不计。

(3)分离度考察

参照实施例中方法配制空白溶液、系统测试溶液、供试品溶液以及对照溶液进行测定。图谱见图4。结果表明，采用本发明的色谱条件，空白溶液无干扰，主成分与杂质之间以及各杂质之间均能有效分离，表明本方法系统适用性良好。

(4)专属性考察

取Molnupiravir胶囊内容物适量，分别放置于酸、碱、氧化、高温、高湿和光照条件下进行强制降解，制成适当的溶液并同比例配制空白破坏溶液进样，按建立的方法进行分离分析，采用DAD检测器，对各条件下样品中杂质进行测定并考察主峰峰纯度，检测波长范围在190nm～400nm。具体溶液配制过程见表9。分别精密量取上述溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表10、表11。空白溶液均无干扰；在未破坏条件及各降解条件下各已知杂质峰及主成分峰与相邻峰之间分离度均大于1.5，各降解条件下主峰纯度因子均大于990，各降解条件下物料平衡均在90％～110％之间，均符合要求。结合(3)分离度考察中各已知杂质分离度考察结果，表明本方法专属性良好。

表9 Molnupiravir胶囊强制降解试验(破坏试验)

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表10强制降解实验结果-1

表11强制降解实验结果-2

综上所述，本发明方法测定Molnupiravir原料和胶囊中的有关物质，专属性强、灵敏度高、线性关系良好、准确度高。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法，其特征在于，所述Molnupiravir，其化学名为((2R，3S，4R，5R)-3,4-二羟基-5-(4-(羟胺基)-2-氧嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)异丁酸甲酯；

其结构式如式(I)所示：

利用高效液相色谱法检测，检测器为紫外吸收检测器，检测波长为270nm～280nm，柱温为20℃～30℃，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为Waters Atlantis^TMT3柱，规格为4.6mm×150mm，填料粒径为3μm；流动相A为体积分数为0.08％～0.12％磷酸溶液，流动相B为甲醇，流动相流速为0.6ml/min～1.0ml/min，采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序如下：

洗脱时间，分钟 流动相A，％ 流动相B，％ 0.0 100.0 0.0 5.0 90.0 10.0 10.0 60.0 40.0 18.0 45.0 55.0 28.0 20.0 80.0 30.0 20.0 80.0 30.1 100.0 0.0 40.0 100.0 0.0

；

所述有关物质包括为结构式如式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)、式(F)、式(G)、式(H)、式(I)、式(J)、式(K)、式(L)、式(M)所示的化合物：

2.根据权利要求1所述的Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法，其特征在于：所述流动相A为体积分数为0.1％磷酸水溶液浓度，流动相流速为0.8ml/min。

3.根据权利要求1所述的Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法，其特征在于：紫外检测器检测波长为275nm，色谱柱柱温为25℃。

4.根据权利要求1所述的Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配制供试品溶液、对照溶液、分离度溶液；

(2)设置高效液相检测条件：色谱柱为Waters Atlantis^TMT3柱，规格为4.6mm×150mm，填料粒径为3μm，以0.1％磷酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速为0.8ml/min，进行梯度洗脱，检测器检测波长为275nm，色谱柱柱温为25℃；

(3)分别吸取供试品溶液、对照溶液、分离度溶液，注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析。

5.根据权利要求4所述的Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法，其特征在于，所述的供试品溶液的配制方法为：精密称定Molnupiravir原料或制剂样品，加体积分数为5％乙腈溶解稀释成含Molnupiravir 1mg/ml的溶液；

所述的对照溶液的配制方法为：精密量取供试品溶液1ml，用体积分数为5％乙腈溶液稀释制成Molnupiravir含量为1μg/ml的溶液；

所述的分离度溶液的配制方法为：

(S1)分别称取结构式如权利要求1所示式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)、式(F)、式(G)、式(H)、式(I)、式(J)、式(K)、式(L)、式(M)的化合物，加体积分数为5％乙腈溶液溶解并稀释制成每1ml含各杂质对照品500μg的杂质对照品贮备溶液；

(S2)精密称定Molnupiravir，加体积分数为5％乙腈溶液溶解，另取上述杂质对照品贮备溶液，制成每1ml含各对照品1μg、Molnupiravir 1mg的混合溶液，得到分离度溶液。