CN117288868B - 一种n-乙酰基-l-亮氨酸有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析技术领域,提供了一种N‑乙酰基‑L‑亮氨酸有关物质的检测方法,该方法专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性以及耐用性均良好,可有效同时检测N‑乙酰基‑L‑亮氨酸中含有的多种杂质,以实现对阿普米司特的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域,具体涉及一种高效分离并检测N-乙酰基-L-亮氨酸中有关物质的高效液相色谱法。
背景技术
N-乙酰基-L-亮氨酸为重要的精细有机化工中间体,广泛应用于医药、农药、化学工业等领域。
阿普米司特是一种免疫调节剂,用于治疗成人活动性银屑病关节炎患者;用于适宜采用光疗法或系统疗法治疗的中重度斑块状银屑病患者。
N-乙酰基-L-亮氨酸为制备阿普米司特原料药的关键物料,作为拆分剂使用,因杂质含量高,影响反应的投料量确认,从而影响拆分效果及反应收率。另外,N-乙酰基-L-亮氨酸中的杂质可能持续传递,最终影响原料药质量,对药品的安全性和有效性产生风险。
N-乙酰基-L-亮氨酸CAS号:1188-21-2,结构式如下:
依据N-乙酰基-L-亮氨酸的化学结构及制备工艺,对其可能含有的物质分析如下:
。
N-乙酰基-L-亮氨酸中杂质含量高,尤其是上述杂质2、3、4,检出量高达4%,杂质总量接近10%,影响拆分效果,并可残留至终产品阿普米司特原料药中,进而对制剂药品安全性、有效性产生风险。
N-乙酰基-L-亮氨酸为氨基酸类化合物,在紫外检测器上吸收弱。国内外文献主要采用TLC法,灵敏度较差,专属性不强,无法准确定量,不适合作为有关物质方法。
故需建立一种适用于N-乙酰基-L-亮氨酸的专属性强、准确度高的有关物质方法,实现杂质定量检测,为生产工艺提供指导,并有效控制物料质量,以保障原料药质量。
发明内容
本发明解决了现有技术的不足,提供了一种N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质的检测方法,可有效检测N-乙酰基-L-亮氨酸中含有的杂质,该方法专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性以及耐用性均良好。
本发明提供了一种N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质的检测方法,包括以下步骤:
(1)供试品溶液:取N-乙酰基-L-亮氨酸适量,加溶剂溶解并稀释制成供试品溶液;
(2)杂质定位溶液:分别取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4各适量,分别加溶剂溶解并稀释制成N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4对应的定位溶液;
(3)色谱试验:取供试品溶液和杂质定位溶液各适量,注入液相色谱仪,记录色谱图。
其中,步骤(1)~(2)中的溶剂为乙腈-水(30∶70);
步骤(3)中的色谱条件具体为:
检测器:紫外检测器;
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,优选SHIMADZU Shim-packScepter HD-C18-80,4.6mm×250mm,5μm;
流动相:流动相A:0.2%(ml/ml)磷酸溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱,梯度洗脱程序为:
;
优选梯度程序为:
;
流速:1.0ml/min;
柱温:40~50℃,优选45℃;
检测波长:206nm;
进样体积:10μl;
运行时间:50分钟。
本发明进一步提供了一种N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质的检测方法,包括以下步骤:
(1)供试品溶液:取N-乙酰基-L-亮氨酸适量,加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含2mg的溶液;
(2)杂质定位溶液:分别取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4各适量,分别加溶剂溶解并稀释至每1ml中分别约含27μg、40μg、35μg的溶液,作为各杂质对应的定位溶液;
(3)色谱试验:取供试品溶液和杂质定位溶液各适量,注入液相色谱仪,记录色谱图。
其中,步骤(1)~(2)中的溶剂为乙腈-水(30∶70);
步骤(3)中的色谱条件具体为:
检测器:紫外检测器;
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,优选SHIMADZU Shim-packScepter HD-C18-80,4.6mm×250mm,5μm;
流动相:流动相A:0.2%(ml/ml)磷酸溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱,梯度洗脱程序为:
;
优选梯度程序为:
;
流速:1.0ml/min;
柱温:40~50℃,优选45℃;
检测波长:206nm;
进样体积:10μl;
运行时间:50分钟。
本发明的有益技术效果为:
(1)本发明提供了N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质的检测方法采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,优选SHIMADZU Shim-pack Scepter HD-C18-80,4.6mm×250mm,5μm,实现了N-乙酰基-L-亮氨酸与相关杂质的良好保留,可有效分离N-乙酰基-L-亮氨酸中含有的杂质,主要检出杂质与相邻杂质间分离度均大于2.0,专属性强。
(2)本发明采用紫外检测器,在206nm波长下以磷酸溶液、乙腈混合溶液作为流动相进行梯度洗脱,基线噪音小,杂峰少,检测灵敏度高,定量限可达0.466μg/ml,约为供试品溶液浓度的0.025%。
(3)本发明可对N-乙酰基-L-亮氨酸中所含杂质进行准确定量,线性范围宽,可满足杂质含量分别为定量限浓度至供试品溶液浓度3.0%~15.0%范围内的定量需求,方法精密度、准确度高。
附图说明
图1为实施例1中条件(1)的供试品溶液叠加图。
图2为实施例1中条件(2)的供试品溶液色谱图。
图3为实施例1中条件(3)的供试品溶液色谱图。
图4为实施例1中条件(4)的供试品溶液叠加图。
图5为实施例1中条件(5)的供试品溶液叠加图。
图6为实施例2中的空白溶剂干扰试验色谱图。
图7为实施例3中的分离度溶液色谱图。
图8为实施例4中的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4线性图。
图9为实施例4中N-乙酰基-L-亮氨酸线性图。
图10为实施例4中N-乙酰基-L-亮氨酸2、N-乙酰基-L-亮氨酸3线性图。
图11为实施例5中N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4定量限溶液色谱图。
图12为实施例5中N-乙酰基-L-亮氨酸、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3定量限溶液、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4检测限溶液色谱图。
图13为实施例5中N-乙酰基-L-亮氨酸、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3检测限溶液色谱图。
图14为实施例6中精密度试验重叠图。
图15为实施例7中供试品溶液稳定性试验重叠图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的具体实施例,需要说明的是下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
仪器与试剂
仪器:高效液相色谱仪;紫外检测器;
溶液:溶剂:乙腈-水(30∶70)。
实施例1 色谱条件筛选
N-乙酰基-L-亮氨酸及其杂质多为异构体,分离较难,故选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,优选SHIMADZU Shim-pack Scepter HD-C18-80,4.6mm×250mm,5μm色谱柱,其为有机杂化硅胶填料系列色谱柱,具有高惰性、高耐受、高稳定性、高柱效的特点,具有较好的立体选择性,对同分异构体或同系物分离度更佳,碳载量高(含碳量26%),保留强,使用此款色谱柱,N-乙酰基-L-亮氨酸及其杂质均得到了良好的分离及保留。
N-乙酰基-L-亮氨酸及其杂质在紫外检测器上均为末端吸收,吸收弱,选择低波长206nm波长进行,使用此波长,在磷酸溶液-乙腈混合溶液体系下,基线噪音小,杂峰少,供试品溶液浓度为2mg/ml时,N-乙酰基-L-亮氨酸及其杂质均可达到灵敏度要求。
(1)流动相选择
供试品溶液A的配制:称取N-乙酰基-L-亮氨酸约10mg,置10ml量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。
取供试品溶液A 10µl,分别于不同流动相A条件下,注入液相色谱仪,记录色谱图。
流动相A1:0.1%(ml/ml)磷酸溶液;
流动相A2:10mmol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0);
流动相A3:10mmol/L磷酸二氢钾溶液;
流动相B:乙腈;
流速:1.0ml/min;柱温:35℃;进样体积:10μl;
梯度洗脱程序:
。
结果:如图1所示,流动相A3条件下,主峰理论板数633,峰形差,pH值不合适;流动相A1与流动相A2条件下,杂质出峰情况基本一致,但流动相A1条件下N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3(保留时间约15min)与相邻峰分离度为1.62,较流动相A2条件分离更优,但分离度仍小于2.0,在此条件下继续优化。
(2)柱温选择
在(1)流动相A1条件基础上,升高柱温至45℃,取供试品溶液A 10µl,注入液相色谱仪,记录色谱图。
结果:N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3峰保留时间为15.753分钟,与相邻峰分离度为1.73,分离得到改善,见图2。
(3)流动相A浓度选择
在(2)条件基础上,调整磷酸溶液浓度至0.2%(ml/ml),按下表进行梯度洗脱:
。
梯度放缓,主峰峰高降低,增大供试品溶液A的浓度至约2mg/ml,即称取N-乙酰基-L-亮氨酸约20mg,置10ml量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。精密量取供试品溶液10µl,注入液相色谱仪,记录色谱图。
结果:主峰保留时间为13.431分钟,理论板数66605,拖尾因子1.11,峰形良好,与相邻杂质间最小分离度为4.31,N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3与相邻峰间最小分离度为2.01,分离良好,见图3。
(4)梯度耐用性
在(3)条件基础上,按下表进行梯度洗脱,考察梯度耐用性:
。
精密量取供试品溶液10µl,注入液相色谱仪,记录色谱图。
结果:主峰及各已知杂质与相邻杂质间分离度不小于2.0,分离良好,杂质谱基本相同,测定结果基本一致,见图4。
(5)柱温耐用性
在(3)条件基础上,调整柱温40℃~50℃(包括40℃、45℃、50℃),考察柱温耐用性。
精密量取供试品溶液10µl,注入液相色谱仪,记录色谱图。
结果:主峰及各已知杂质与相邻杂质间分离度不小于2.0,分离良好,杂质谱基本相同,测定结果基本一致,见图5。
实施例2 溶剂干扰实验
N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质使用溶剂为乙腈-水(30∶70),N-乙酰基-L-亮氨酸及其杂质使用此溶剂溶解性良好。
精密量取溶剂10μl,注入液相色谱仪,按实施例1筛选所得的色谱条件,记录色谱图。结果详见图6,空白溶剂分别在保留时间2.322分钟、2.477分钟、2.961分钟、4.783分钟出峰,不干扰N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质的测定。
实施例3 分离度试验
N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2定位溶液的制备:称取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2对照品约17mg,置25ml量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀;量取0.4ml,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀。
N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3定位溶液的制备:称取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3对照品约1mg,置25ml量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。
N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4定位溶液的制备:称取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4对照品约17.5mg,置100ml量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀;量取2ml,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀。
供试品溶液:称取N-乙酰基-L-亮氨酸约20mg,置10ml量瓶中,加溶剂使溶解并稀释至刻度,摇匀。
取供试品溶液及杂质定位溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。结果:N-乙酰基-L-亮氨酸峰与N-乙酰基-L-亮氨酸4峰之间的分离度为4.31,各已知杂质与相邻杂质间的最小分离度为2.01,分离良好。具体结果见表1、图7。
表1 分离度试验结果
注:L-亮氨酸与N-乙酰基-L-亮氨酸吸收差异大,在有关物质方法基础上微调梯度,增大供试品溶液浓度至10mg/ml,使用外标法进行检测,L-亮氨酸定量限可达3.833μg/ml,约为供试品溶液浓度的0.038%,灵敏度良好。
实施例4 线性试验
N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4贮备液的制备:称取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4对照品约17.5mg,精密称定,置100ml量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。
N-乙酰基-L-亮氨酸贮备液的制备:称取N-乙酰基-L-亮氨酸约0.2g,精密称定,置50ml量瓶中,加溶剂使溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质线性溶液5的制备:取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2对照品与N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3对照品各约2mg,精密称定,置同一10ml量瓶中,加N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4贮备液3.0ml,加溶剂超声使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为杂质线性溶液5。
杂质线性溶液4的制备:取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2对照品及N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3对照品各约1.3mg,精密称定,置同一10ml量瓶中,加N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4贮备液2.0ml,加溶剂超声使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为杂质线性溶液4。
杂质线性溶液3的制备:量取杂质线性溶液4 5.0ml,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为杂质线性溶液3。
杂质线性溶液2的制备:量取杂质线性溶液5 2.0ml,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为杂质线性溶液2。
杂质线性溶液1的制备:量取杂质线性溶液3 2.0ml,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为杂质线性溶液1。
N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液的制备:量取N-乙酰基-L-亮氨酸贮备液0.5ml、2.5ml、6.0ml,分别置3个不同的10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液3~5。
N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液2的制备:量取N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液31.0ml,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液2。
N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液1的制备:量取N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液21.0ml,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液1。
N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4定量限溶液的制备:量取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4贮备液30µl,置10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4定量限溶液。
定量限溶液的制备:量取杂质线性溶液5 25µl、N-乙酰基-L-亮氨酸线性溶液20.25ml,置同一10ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3及N-乙酰基-L-亮氨酸定量限溶液。
精密量取线性溶液与定量限溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积对浓度作曲线,用最小二乘法计算回归方程及相关系数。结果如表2及图8~10所示,结合定量限试验结果,N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4、N-乙酰基-L-亮氨酸、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3在相应浓度范围内,峰面积对浓度均呈良好的相关性。
表2 N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质检查线性试验结果表
实施例5 定量限、检测限试验
取各化合物适量,加溶剂溶解并稀释制成一定浓度的溶液,分别用溶剂逐级稀释至不同浓度,分别精密量取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,至测得的主峰响应值不低于噪音信号的10倍高和3倍高,即为N-乙酰基-L-亮氨酸及各杂质的定量限和检测限。结果见表3、表4及图11~13。
表3 N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质检查定量限结果表
表4 N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质检查检测限结果表
实施例6 精密度试验
平行配制6份供试品溶液。精密量取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。按峰面积归一化法计算,计算N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、其他最大单个杂质及总杂质的量,并分析比较6次测定结果。结果表明:N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4检出量基本一致(在0.77%~0.78%之间),RSD为0.67%;N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2检出量基本一致(在3.24%~3.50%之间),RSD为2.66%;N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3检出量基本一致(在2.70%~2.90%之间),RSD为2.85%;其他最大单个杂质检出量基本一致(在0.10%~0.12%之间),RSD为5.75%;总杂质检出量基本一致(在7.09%~7.51%之间),RSD为2.25%。N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质检查精密度试验结果良好,结果见表5、图14。
表5 N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质检查精密度试验结果表
实施例7 溶液稳定性试验
①对照品溶液稳定性
取限度浓度100%(取“实施例4 线性试验”项下杂质线性溶液3)的溶液,室温自然光下放置,分别于0、2、4、6、8、24小时时,分别精密量取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,与0小时比较,计算对照品溶液色谱图中N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3峰面积的变化率,结果见表6所示,对照品溶液在室温自然光条件下24小时内稳定。
表6 N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质检查供试品溶液的稳定性试验结果表
②供试品溶液稳定性
取“实施例6 精密度试验”项下供试品溶液1,于室温自然光下放置,分别于0、2、4、6、8、24小时时,精密量取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,计算N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、其他最大单个杂质及总杂质的检出量,并分析比较不同时间点的测定结果。结果如表7、图15所示,供试品溶液在室温自然光下放置24小时,N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4检出量(在0.76%~0.77%之间)变化率为1.30%;N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2检出量(在3.43%~3.44%之间)变化率为0.29%;N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3检出量(在2.88%~2.90%之间)变化率为0.69%;其他最大单个杂质检出量(均为0.11%)变化率为0;总杂质检出量(在7.45%~7.48%之间)变化率为0.40%,无新杂质产生,供试品溶液在室温自然光条件下24小时内稳定。
表7 N-乙酰基-L-亮氨酸有关物质检查供试品溶液的稳定性试验结果表
。
Claims (7)
1.一种N-乙酰基-L-亮氨酸杂质的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)供试品溶液:取N-乙酰基-L-亮氨酸适量,加溶剂溶解并稀释制成供试品溶液;
(2)杂质定位溶液:取N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4各适量,分别加溶剂溶解并稀释制成N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4对应的定位溶液;所述的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质2、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质3、N-乙酰基-L-亮氨酸杂质4如下式所示:
;
(3)色谱试验:取供试品溶液和杂质定位溶液各适量,注入液相色谱仪,记录色谱图;
其中,步骤(1)~(2)中的溶剂为乙腈:水=30∶70;步骤(3)中的色谱条件为:检测器:紫外检测器;检测波长:206nm;色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱;流动相:流动相A:磷酸溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱,梯度洗脱程序为:
。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质的检测方法,其特征在于,所述色谱条件还包括:
流速:1.0ml/min;
柱温:40~50℃;
进样体积:10μl;
运行时间:50分钟。
3.根据权利要求1所述的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质的检测方法,其特征在于,所述色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Scepter HD-C18-80,4.6mm×250mm,5μm。
4.根据权利要求1所述的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质的检测方法,其特征在于,所述流动相A的浓度为0.2%(ml/ml)。
5.根据权利要求1所述的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质的检测方法,其特征在于,所述梯度洗脱程序为:
。
6.根据权利要求2所述的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质的检测方法,其特征在于,所述柱温为45℃。
7.根据权利要求1所述的N-乙酰基-L-亮氨酸杂质的检测方法在阿普米司特质量控制中的用途。
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