CN105548393A - 一种检测阿普斯特原料中杂质含量的方法 - Google Patents

一种检测阿普斯特原料中杂质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量的方法，包括以下步骤：a、取式Ⅰ所示化合物的对映异构体，制备对照品溶液，用正相高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；b、取式Ⅰ所示化合物的产品，制备供试品溶液，用正相高效液相色谱方法进行检测；c、计算式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体的含量。本发明方法，式Ⅰ所示化合物色谱峰与对映异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，为监控式Ⅰ所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了阿普斯特的产品质量和患者的用药安全。

Description

一种检测阿普斯特原料中杂质含量的方法
技术领域
本发明涉及一种检测阿普斯特原料中杂质含量的方法。
背景技术
(S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙胺的N-乙酰基-L-亮氨酸盐(如式Ⅰ所示)，是一种重要的药物原料，目前主要用于制备治疗银屑病性关节炎的口服药物：阿普斯特(其化学名称为(S)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基乙基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1,3-二酮，分子式为C22H24N2O7S，分子量为460.5)；以式Ⅰ所示化合物为原料制备阿普斯特的合成路线如下(参见：陈建超.阿普斯特(apremilast).中国药物化学杂志.2014年10月，第24卷，第5期，总121期)：
由于受到操作水平和控制水平的限制，现有式Ⅰ所示化合物的产品中往往会存在少量的对映异构体杂质：(R)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙胺的N-乙酰基-L-亮氨酸盐，该杂质会在阿普斯特的制备过程中，生成阿普斯特的R型对映异构体杂质：(R)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基乙基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1,3-二酮，该对映异构体是已报道的杂质(参见：中国专利CN104792913A说明书的第[0002]段)，它直接影响着阿普斯特的产品质量和患者的用药安全。
为了进一步保证阿普斯特的产品质量和患者的用药安全，有必要对式Ⅰ所示化合物的产品质量进行监控，特别是，需要发明一种新方法，对式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量进行检测。而且，根据目前的检索情况来看，现有技术中也未见有对式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量进行检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量的方法。
本发明提供的一种检测式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量的方法，包括以下步骤：
a、取式Ⅰ所示化合物的对映异构体，制备对照品溶液，用正相高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；
b、取式Ⅰ所示化合物的产品，制备供试品溶液，用正相高效液相色谱方法进行检测；
c、计算式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体的含量；
步骤a和b所用正相高效液相色谱方法的色谱条件为：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂；
流动相：C6～C7正烷烃-C1～C3醇，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为70：30～90：10；
检测波长为230nm～240nm。
进一步的，步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为流动相，对照品溶液的浓度为0.5～11μg/ml；步骤b中，制备供试品溶液的溶剂为流动相，供试品溶液的浓度为0.4～0.6mg/ml。
进一步的，所述的色谱条件中，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm。
进一步的，色谱柱为CHIRALPAKIF。
进一步的，所述的色谱条件中，色谱柱的柱温为30℃～40℃；优选的，色谱柱的柱温为30℃～35℃。
进一步的，所述的色谱条件中，C6～C7正烷烃选自正己烷或正庚烷，C1～C3醇选自甲醇、乙醇或异丙醇。
进一步的，所述的色谱条件中，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为70：30～85：15；优选的，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为70：30～80：20；更优选的，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为75：25。
进一步的，所述的色谱条件中，流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min；优选的，流动相的流速为0.8ml/min～1.0ml/min。
进一步的，所述的色谱条件中，检测波长为232±2nm。
进一步的，所述的色谱条件中，进样量为20μl。
本发明中，式Ⅰ所示化合物的对映异构体，其名称为(R)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙胺的N-乙酰基-L-亮氨酸盐，其结构如式Ⅱ所示：
本发明中，Acetyl表示乙酰基，Leucine表示亮氨酸；C6～C7正烷烃表示含有6个或7个碳原子的正烷烃，即正己烷和正庚烷；C1～C3醇表示含有1个～3个碳原子的低级醇，即甲醇、乙醇和丙醇。
本发明中，标准曲线是对照品色谱峰的峰面积与对照品浓度之间的线性关系方程。
本发明提供了一种检测式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量的方法，式Ⅰ所示化合物色谱峰与对映异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，检测结果准确、可靠，为监控式Ⅰ所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了阿普斯特的产品质量和患者的用药安全。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1中本发明方法进行系统适用性试验的检测结果。
图2为实施例1中对比试验方法对混合溶液的检测结果。
图3为试验例3的标准曲线图。
图4为试验例4中供试品溶液的检测结果。
图5为试验例4中对照品溶液的检测结果。
图6为试验例4中流动相空白溶液的检测结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
高效液相色谱仪(型号：LC-20AT二元泵，生产厂家：日本岛津公司)。
电子天平(型号：AUW220D，生产厂家：日本岛津公司)。
式Ⅰ所示化合物的产品：通过购买苏州卡普维尔医药科技有限公司的市售产品获得，产品批号为20140428。
式Ⅰ所示化合物的对映异构体(如式Ⅱ所示)，作为对照品：通过购买苏州卡普维尔医药科技有限公司的市售产品获得，产品批号为20140428。
实施例1
1、确定检测波长
精密称取式Ⅰ所示化合物的产品适量，用流动相(正己烷-甲醇＝75：25)配制成浓度为20μg/ml的溶液，作为供试品溶液。
精密称取对照品(对映异构体)适量，用流动相(正己烷-甲醇＝75：25)配制成浓度为20μg/ml的溶液，作为对照品溶液。
取上述的供试品溶液、对照品溶液，在200nm～400nm波长范围内进行扫描，试验结果见表1。
表1、本发明的紫外扫描结果
项目 峰波长(nm) 峰值 谷波长(nm) 谷值
供试品溶液 232 0.538 254 0.040
对照品溶液 232 0.291 253 0.013
试验结果表明，检测波长在230nm～240nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱检测方法；优选的，检测波长为232±2nm。
2、高效液相色谱检测方法
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-甲醇(体积比为75：25)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
系统适用性试验：取式Ⅰ所示化合物的产品、对映异构体各20μg，加入1ml流动相(正己烷-甲醇＝75：25)，作为系统适用性溶液；量取20μl系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，式Ⅰ所示化合物色谱峰与对映异构体色谱峰之间的分离度应不低于1.5，理论塔板数按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算应不小于2000。
制备供试品溶液：称取式Ⅰ所示化合物的产品25mg，置于50ml量瓶中，加流动相(正己烷-甲醇＝75：25)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取对照品(对映异构体)5mg，置于100ml量瓶中，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加流动相(正己烷-甲醇＝75：25)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
系统适用性试验的检测结果见图1，式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为25.863min)与对映异构体色谱峰(保留时间为23.578min)之间的分离度为2.27，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为9364，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.087。
本发明正相高效液相色谱检测供试品溶液，结果为：供试品中含有对映异构体的量为0.25％。
对比试验：
采用反相高效液相色谱进行检测
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InertsilODS3，50×4.6mm，5μm或其他性能相当色谱柱)；
流动相：以磷酸二氢钾溶液(取1.4g磷酸二氢钾，置1000ml量瓶中，加水900ml，用磷酸调节pH值至3.0，再用水稀释至刻度，混匀)-乙腈(60:40)为流动相；
流速：1.0ml/min；
检测波长：210nm；
混合溶液：取式Ⅰ所示化合物的产品、对映异构体各20μg，加入1ml流动相，作为混合溶液；
制备供试品溶液：称取式Ⅰ所示化合物的产品25mg，置于50ml量瓶中，加流动相适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取对照品5mg，置于100ml量瓶中，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
混合溶液的检测结果见图2，式Ⅰ所示化合物与对映异构体的色谱峰重叠在一起，不能用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例2
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-甲醇(80：20)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为24.873min)与对映异构体色谱峰(其保留时间为22.511min)之间的分离度为2.17，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为9164，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.129，方法可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例3
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-甲醇(70：30)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为29.112min)与对映异构体色谱峰(保留时间为27.772min)之间的分离度为2.026，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为6782，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为0.9988，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例4
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-乙醇(85：15)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为11.012min)与对映异构体色谱峰(保留时间为9.811min)之间的分离度为1.651，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为2356，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.236，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例5
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKAD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-乙醇(70：30)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为17.553min)与对映异构体色谱峰(保留时间为14.782min)之间的分离度为2.381，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为4567，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.123，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例6
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-异丙醇(80：20)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为21.073min)与对映异构体色谱峰(保留时间为19.115min)之间的分离度为1.956，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为2671，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.371，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例7
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-异丙醇(90：10)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为10.887min)与对映异构体色谱峰(保留时间为8.712min)之间的分离度为1.552，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为9975，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.028，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例8
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-异丙醇(85：15)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为21.221min)与对映异构体色谱峰(保留时间为19.988min)之间的分离度为2.751，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为2577，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.223，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例9
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-甲醇(75：25)；
柱温：30℃；
流速：0.8ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为30.138min)与对映异构体色谱峰(保留时间为28.323min)之间的分离度为2.581，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为9826，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为1.062，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
实施例10
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-甲醇(75：25)；
柱温：40℃；
流速：1.2ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：式Ⅰ所示化合物色谱峰(保留时间为17.995min)与对映异构体色谱峰(保留时间为15.823min)之间的分离度为1.903，理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)为9991，式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子为0.998，可以用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1、流动相筛选试验
选择不同的流动相进行筛选试验，其他色谱条件如下：
色谱柱：用用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl；
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表2：
表2、流动相筛选试验结果
编号 流动相 保留时间 分离度 拖尾因子 理论塔板数
1 正己烷-甲醇(75：25) 25.869min 2.27 1.087 9364
2 正己烷-甲醇(80：20) 24.873min 2.17 1.129 9164
3 正己烷-甲醇(70：30) 29.112min 2.026 0.9988 6782
4 正庚烷-乙醇(85：15) 11.012min 1.651 1.236 2356
5 正庚烷-乙醇(70：30) 17.553min 2.381 1.123 4567
6 正庚烷-异丙醇(80：20) 21.073min 1.956 1.371 2631
7 正庚烷-异丙醇(90：10) 10.887min 1.552 1.028 9875
8 正庚烷-异丙醇(85：15) 21.221min 2.751 1.223 2577
表2中，流动相“例如：正己烷-甲醇(75：25)”具有中国药典2015年版通常具有的含义，其中75：25表示正己烷与甲醇的体积比；保留时间是指式Ⅰ所示化合物色谱峰的保留时间；分离度是指式Ⅰ所示化合物色谱峰与对映异构体色谱峰之间的分离度；拖尾因子是指式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)。
试验结果表明，本发明的流动相条件，均可用于检测式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量。
试验例2、柱温和流速筛选试验
选择不同的柱温和流速进行筛选试验，其他色谱条件如下：
色谱柱：用用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
检测波长：232nm；
进样量：20μl；
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表3：
表3、柱温和流速筛选试验结果
表3中，保留时间是指式Ⅰ所示化合物色谱峰的保留时间；分离度是指式Ⅰ所示化合物色谱峰与对映异构体色谱峰之间的分离度；拖尾因子是指式Ⅰ所示化合物色谱峰的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算)。
试验结果表明，柱温和流速对本发明方法的影响很小；优选的，柱温为30℃～40℃；流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
试验例3、线性关系试验
色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：用用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl；
取对照品(对映异构体)，用流动相稀释制成表4中一系列浓度的对照品溶液。按照上述色谱条件，分别进行检测，检测结果见表4。
表4、线性关系试验的检测结果
编号 1 2 3 4 5 6
浓度(μg/ml) 10.4050 5.2025 2.0810 1.0405 0.8324 0.5203
峰面积 162973 80247 29583 13234 10331 6313
以对映异构体浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y＝15939X-2900，R2＝0.999，如图3所示。
试验结果表明，对映异构体的浓度在0.5203μg/ml～10.4050μg/ml范围内，其峰面积与浓度呈良好的线性关系。
试验例4、专属性研究
按照本发明方法制备供试品溶液、对照品溶液并配制流动相空白。
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl；
精密量取上述各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的检测结果如图4所示，对照品溶液的检测结果如图5所示，流动相空白溶液的检测结果如图6所示。
试验结果表明，空白溶液不会对本发明正相高效液相色谱检测式Ⅰ所示化合物色谱峰中对映异构体的含量造成干扰。
试验例5精密度试验
取对照品对映异构体适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；
按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。
检测结果见表4。
表4、精密度试验的检测结果
编号 1 2 3 4 5 6 平均值 编号
峰面积 85989 86161 87617 85586 88895 88451 1.60％ 峰面积
试验结果表明，本发明检测方法的精密度良好。
试验例6、稳定性试验
取式Ⅰ所示化合物的产品、对映异构体，按照本发明方法将其配制成供试品溶液和对照品溶液，取供试品溶液分别于0h、2h、4h、6h、8h进样检测；按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl供试品溶液，注入液相色谱仪，进行检测，并根据对照品溶液的标准曲线，计算得到式Ⅰ所示化合物的产品中的对映异构体含量，结果见表5。
表5、稳定性试验的检测结果
时间 0h 2h 4h 6h 8h 平均值
对映异构体含量(％) 0.256％ 0.253％ 0.249％ 0.246％ 0.245％ 0.250％
试验结果表明，本发明检测方法的稳定性良好。
试验例7、重复性试验
取式Ⅰ所示化合物的产品，按照本发明方法将其配制成供试品溶液，分别平行制备6份供试品溶液，并制备对映对照品溶液；按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中对映异构体的含量，结果见表6。
表6、重复性试验的检测结果
样品 样1 样2 样3 样4 样5 样6 平均值
对映异构体含量(％) 0.251％ 0.246％ 0.259％ 0.247％ 0.253％ 0.250％ 0.251％
试验结果表明，本发明检测方法的重复性好。
试验例8、色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：用用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl；
取式Ⅰ所示化合物的产品、对映异构体适量，加流动相制成每1ml中各含20μg的溶液，作为系统适用性溶液；量取20μl系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，式Ⅰ所示化合物色谱峰与对映异构体色谱峰之间的分离度应不低于1.5，理论塔板数按式Ⅰ所示化合物色谱峰计算应不小于2000。
制备供试品溶液：称取式Ⅰ所示化合物的产品25mg，置于50ml量瓶中，加流动相(正己烷-甲醇＝75：25)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取对照品(对映异构体)5mg，置于100ml量瓶中，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加流动相(正己烷-甲醇＝75：25)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对映异构体色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20％，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如果显示对映异构体峰，按外标法(标准曲线)以峰面积计算对映异构体的含量不得过0.5％。按照上述的方法，对供试品溶液进行检测3次。
试验结果表明，供试品中检出对映异构体不超过0.3％，式Ⅰ所示化合物与对映异构体达到良好的基线分离。
试验例9、定量限和检测限试验
色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：用用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂的色谱柱；如：色谱柱的型号为CHIRALPAKIF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：232nm；
进样量：20μl；
称取对映异构体20.81mg，置于20ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液a。
取上述对照品溶液a1.0ml，置于100ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液b。
量取上述对照品溶液b1ml，置于25ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为定量限试验的检测溶液(S/N≈10)，量取定量限试验的检测溶液3ml，置于10ml量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，作为检测限试验的检测溶液(S/N≈3)。
测得对映异构体的定量限为8.324ng。
测得对映异构体的检测限为2.497ng。
试验结果表明，本发明方法具有较高的检测灵敏度，可以检测出式Ⅰ所示化合物的产品中的微量对映异构体杂质。
综上所述，本发明提供了一种检测式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量的方法，式Ⅰ所示化合物色谱峰与对映异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，检测结果准确、可靠，为监控式Ⅰ所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了阿普斯特的产品质量和患者的用药安全。

Claims (10)

1.一种检测式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取式Ⅰ所示化合物的对映异构体，制备对照品溶液，用正相高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；
b、取式Ⅰ所示化合物的产品，制备供试品溶液，用正相高效液相色谱方法进行检测；
c、计算式Ⅰ所示化合物的产品中对映异构体的含量；
步骤a和b所用正相高效液相色谱方法的色谱条件为：
色谱柱：用直链淀粉-三(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)键合的硅胶为填充剂；
流动相：C6～C7正烷烃-C1～C3醇，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为70∶30～90∶10；
检测波长为230nm～240nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为流动相，对照品溶液的浓度为0.5～11μg/ml；步骤b中，制备供试品溶液的溶剂为流动相，供试品溶液的浓度为0.4～0.6mg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：色谱柱为CHIRALPAKIF。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，色谱柱的柱温为30℃～40℃；优选的，色谱柱的柱温为30℃～35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，C6～C7正烷烃选自正己烷或正庚烷，C1～C3醇选自甲醇、乙醇或异丙醇。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为70∶30～85∶15；优选的，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为70∶30～80∶20；更优选的，C6～C7正烷烃与C1～C3醇的体积比为75∶25。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min；优选的，流动相的流速为0.8ml/min～1.0ml/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，检测波长为232±2nm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，进样量为20μl。
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