CN104950066A - 反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体ii的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测领域，涉及一种反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，它包括以下步骤：a、制备供试品溶液；b、采用反相高效液相色谱对供试品进行检测；c、按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量。本发明反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，通过简单的流动相组份，就能实现中间体II与各杂质色谱峰之间的完全分离；同时，本发明方法的检测结果准确、可靠，为控制阿哌沙班合成过程中中间产品的质量提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种反相高效液相色谱检测阿哌沙班合成过程中间体II的方法。
背景技术
阿哌沙班的化学名称为：1-(4-甲氧基苯基)-7-氧代-6-[4-(2-氧代-哌啶-1-基)苯基]-4,5,6,7-四氢-1H-吡唑[3,4-C]-吡啶-3-甲酰胺，分子式：C25H25N5O4，分子量：459.50，阿哌沙班结构式如下所示：
阿哌沙班目前未在中国境内上市销售；现已上市销售的阿哌沙班产品有阿哌沙班片，阿哌沙班片收载于国家食品药品监督管理总局《进口药品注册标准》，标准号：JX20120076。
在阿哌沙班合成过程中，采用起始物料Ⅰ和起始物料Ⅱ定向合成，通过反应制得中间体I，再进一步获得中间体II。其中：
起始物料Ⅰ化学名称为：1-[4-(2-氧代哌啶-1-基)-苯基]-3-(吗啉-4-基)-5,6-二氢-2H-吡啶-2-酮；分子式：C20H25N3O3；分子量：355.43。
起始物料Ⅱ化学名称为：2-氯-2-[2-(4-甲氧基苯基)亚肼基]乙酸乙酯；分子式：C11H13ClN2O3；分子量256.69。
中间体II化学名称为：1-(4-甲氧基苯基)-7-氧代-6-[4-(2-氧代哌啶-1-基)苯基]-4,5,6,7-四氢-1H-吡唑并[3,4-C]吡啶-3-羧酸乙酯；分子式：C27H28N4O5；分子量488.54。
中间体II是合成过程中对成品质量起倒重要作用的关键产物，其结构式如下所示：
在阿哌沙班合成过程中，成品采用定向合成，中间II作为成品的前一步产物，因工艺的稳定性原因，每批产品质量均存在一定的差异且会存在一些有机杂质，这些杂质的存在会严重影响其合成产品的质量和用药安全，因此需要对中间体II进行检测和质量控制，以确保成品的质量。
反相高效液相色谱是一种常用的检测方法，采用非极性或相对极性较弱的固定相，以极性较强的溶剂作为流动相，常用于分离、检测非极性和极性较弱的化合物；反相高效液相色谱在现代液相色谱中的应用最为广泛，据统计，它占整个高效液相色谱应用的80％左右。
阿哌沙班及其中间体II均为极性较弱的化合物，通常采用反相高效液相色谱检测其中的杂质，如：阿哌沙班片质量标准中就是采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相高效液相色谱进行检测阿哌沙班片中的有关物质，该方法采用梯度洗脱，流动相配制复杂，系统平衡时间较长，操作繁琐，用于中间体II的检测，出峰太快，不太适合中间体II的质量控制。
因此，需要开发一种检测阿哌沙班中间体II的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法。
本发明提供的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中中间体II的方法，它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：称取中间体II用流动相溶解并稀释，得到浓度为0.4～0.6mg/ml的供试品溶液；
b、采用反相高效液相色谱对供试品溶液进行检测：
其中，色谱条件如下：
色谱柱的固定相：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相为甲醇、0.025-0.035mol/L磷酸氢二钠溶液，两者按体积比30％：70％～40％：60％混合：
检测波长为270nm～290nm；
c、按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量。
进一步的，步骤a中，供试品溶液的浓度为0.5mg/ml。
进一步的，步骤b中，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150-250mm，填料粒径为3.5-5μm。优选的，步骤b中，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
进一步的，步骤b中，色谱柱为Welch Ultimate XB-C18。
进一步的，步骤b中，所述0.025-0.035mol/L磷酸氢二钠溶液为0.03mol/L磷酸氢二钠溶液、0.025mol/L磷酸氢二钠溶液或0.035mol/L磷酸氢二钠溶液。
进一步的，步骤b中，甲醇与0.03mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为30％：70％～40％：60％；甲醇与0.025mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为30％：70％～40％：60％；甲醇与0.035mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为30％：70％～40％：60％。
进一步的，步骤b中，甲醇与0.03mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为35％：65％。
进一步的，步骤b中，柱温为30℃～40℃；流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
进一步的，步骤b中，柱温为30℃或35℃或40℃；流速为0.8ml/min或1.0ml/min或1.2ml/min。
进一步的，步骤b中，检测波长为280nm。
进一步的，步骤b中，进样量为20μl。
本发明反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，中间体II与各杂质成分之间分离良好，流动相组成简单。同时，本发明方法的检测结果准确、可靠，通过控制阿哌沙班合成过程中中间产品的质量，达到了进一步加强成品合成过程控制的目的。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1实施例1本发明方法对样品初步的检测结果。
图2实施例1对比试验方法对供试品溶液的检测结果。
图3试验例3的标准曲线图。
图4试验例4专属性试验的检测结果。其中，图4-(a)为高温破坏、图4-(b)为光破坏、图4-(c)为碱破坏、图4-(d)为酸破坏、图4-(e)为氧化破坏。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
高效液相色谱仪(型号：LC-20AT二元泵，生产厂家：日本岛津公司)
电子天平(型号：AUW220D，生产厂家：日本岛津公司)
实施例1
1、确定检测波长
精密称取阿哌沙班中间体II适量，用流动相(甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠＝35：65)配制成浓度为20μg/ml的溶液，作为供试品溶液。
取上述供试品溶液，在200nm～400nm波长范围内进行扫描，试验结果见表1。
表1本发明的紫外扫描结果
| 样品名 | 峰波长nm/吸光度A | 谷波长nm/吸光度A |
| 中间体II | 279.0nm/0.655 | 252nm/0.517 |
试验结果表明，检测波长在270nm～290nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱检测方法；优选的，检测波长为280±2nm。
2、高效液相色谱检测方法
采用反相高效液相色谱法进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
制备供试品溶液：称取阿哌沙班中间体II约25mg，置于50ml量瓶中，加流动相(甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠＝35：65)，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
供试品溶液的检测结果见图1，中间体II保留时间为18.886min，理论塔板数(按中间体II计算)为49067，分离度为2.176。上述反相高效液相色谱法检测供试品溶液，结果为：单个杂质为0.455％，总杂质为2.118％。
检测阿哌沙班中间体II的有关物质可采用本发明反相高效液相色谱法。
对比试验：采用反相高效液相色谱进行检测
按照《进口药品注册标准》阿哌沙班片有关物质检测方法：
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters xbridge shield Rp18，150×4.6mm，3.5μm或其他性能相当色谱柱)；
流动相：以30mmol/L醋酸铵溶液-乙腈(90：10)为流动相A，30mmol/L醋酸铵溶液-乙腈(5：95)为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
流速：1.5ml/min；
检测波长：280nm；
制备供试品溶液：称取阿哌沙班中间体II约25mg，置于50ml量瓶中，加溶剂(乙腈-水＝50：50)，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
供试品溶液的检测结果见图2，中间体II主峰的保留时间为1.005min，保留时间太靠前，不能满足本品有关物质检测的需要。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1流动相筛选试验
选择不同的流动相进行筛选试验，其他色谱条件如下：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl；
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表2：
表2流动相筛选试验结果
| 编号 | 流动相 | 保留时间 | 分离度 | 峰纯度指数 | 理论塔板数 |
| 1 | 甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(30：70) | 25.113min | 4.011 | 1.000000 | 38871 |
| 2 | 甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(35：65) | 18.719min | 2.226 | 1.000000 | 50205 |
| 3 | 甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(40：60) | 15.013min | 1.723 | 1.000000 | 64122 |
| 4 | 甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(30：70) | 26.181min | 3.977 | 1.000000 | 37752 |
| 5 | 甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(35：65) | 19.014min | 2.301 | 1.000000 | 48833 |
| 6 | 甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(40：60) | 15.557min | 1.691 | 1.000000 | 65222 |
| 7 | 甲醇-0.035mol/L磷酸二氢钾(30：70) | 25.991min | 3.876 | 1.000000 | 36752 |
| 8 | 甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(35：65) | 19.117min | 2.303 | 1.000000 | 49929 |
| 9 | 甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(40：60) | 14.127min | 1.698 | 1.000000 | 68875 |
| 10 | 乙腈-0.03mol/L磷酸氢二钠(30：70) | 10.071min | 1.411 | 0.997121 | 88789 |
| 11 | 乙腈-0.03mol/L磷酸氢二钠(35：65) | 7.011min | 1.123 | 0.987315 | 92153 |
| 12 | 乙腈-0.03mol/L磷酸氢二钠(40：60) | 5.017min | 0.981 | 0.972588 | 99821 |
表2中，流动相“甲醇-0.03mol/L磷酸二氢钠(35：65)”具有中国药典2010年版通常具有的含义，其中35：65表示甲醇与0.03mol/L磷酸氢二钠的体积比；保留时间是指中间体II的保留时间；分离度是指中间体II与相邻杂质之间的分离度；拖尾因子是指中间体II的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按中间体II峰计算)。
试验结果表明，流动相为甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(30：70)、甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(35：65)、甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(40：60)、甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(30：70)、甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(35：65)、甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(40：60)、甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(30：70)、甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(35：65)、甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(40：60)时，均适合用于检测阿哌沙班中间体II的有关物质。
试验例2柱温和流速筛选试验
选择不同的柱温和流速进行筛选试验，其他色谱条件如下：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表3：
表3柱温和流速筛选试验结果
| 柱温和流速 | 保留时间 | 分离度 | 峰纯度指数 | 理论塔板数 |
| 柱温30℃；流速0.8ml/min | 27.013min | 4.721 | 1.000000 | 32552 |
| 柱温35℃；流速1.0ml/min | 18.585min | 2.259 | 1.00000 | 49959 |
| 柱温40℃；流速1.2ml/min | 15.721min | 1.703 | 1.000000 | 70116 |
表3中，保留时间是指中间体II的保留时间；分离度是指中间体II与相邻杂质峰之间的分离度；拖尾因子是指中间体II的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按中间体II峰计算)。
试验结果表明，柱温和流速对本发明检测结果的影响很小；优选的，柱温为30℃～40℃；流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
试验例3线性关系试验
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
取中间体II，用流动相稀释制成表4中一系列浓度的对照溶液。按照上述色谱条件，分别进行检测，检测结果见表4。
表4线性关系试验的检测结果
以中间体II浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，其标准曲线见图3。
试验结果表明，在0.093μg/ml～4.642μg/ml范围内，本发明检测方法具有良好的线性关系。
试验例4专属性研究
酸破坏 称取中间体II 23.02mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸2ml，放置30min，加入0.1mol/L氢氧化钠2ml中和，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏 称取中间体II 27.13mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液2ml，放置30min，加入0.1mol/L盐酸2ml中和，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏 称取中间体II 22.11mg，置50ml量瓶中，加30％过氧化氢溶液2ml，放置10min，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏 取经130℃烘箱中加热4小时的中间体II。精密称取26.23mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解后并稀释至刻度，摇匀，即得。
强光破坏 取本品，精密称取中间体II 22.02mg，置25ml量瓶中，加溶剂溶解后并稀释至刻度，摇匀，置紫外光灯下照射12h。
未破坏样品 称取中间体II 23.19mg，置于50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
精密量取上述供试品溶液20μl注入液相色谱仪。
色谱图分别见图4-(a)高温破坏、图4-(b)光破坏、图4-(c)碱破坏、图4-(d)酸破坏、图4-(e)氧化破坏。试验结果表明，在本色谱条件下，阿哌沙班经酸、碱、氧化、高温和光照破坏条件下样品相对较稳定，单个最大杂质和总杂质没有明显变化，破坏过程中产生较多的小杂质峰，阿哌沙班产生的降解产物与主峰完全分离，空白溶剂峰不干扰有关物质检查，本方法能够有效的检出阿哌沙班的有关物质及降解产物。
试验例5稳定性试验
取中间体II，按照本发明方法制备供试品溶液，取供试品溶液分别于0h、2h、4h、6h、8h进样检测；按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl对照品溶液，注入液相色谱仪，按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量，结果见表5。
表5稳定性试验的检测结果
| 编号 | 单个杂质 | 总杂质 | 个数 |
| 0h | 0.188％ | 1.304％ | 15 |
| 2h | 0.188％ | 1.337％ | 16 |
| 4h | 0.187％ | 1.375％ | 18 |
| 6h | 0.187％ | 1.346％ | 16 |
| 8h | 0.187％ | 1.338％ | 17 |
试验结果表明，本发明反相高效液相色谱的稳定性良好。
试验例6重复性试验
取中间体II，按照本发明方法将其配制成供试品溶液，分别平行制备6份供试品溶液；按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl供试品溶液，注入液相色谱仪，按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量，结果见表6。
表6重复性试验的检测结果
| 编号 | 单个杂质 | 总杂质 | 个数 |
| 1 | 0.188％ | 1.304％ | 15 |
| 2 | 0.188％ | 1.315％ | 15 |
| 3 | 0.188％ | 1.322％ | 16 |
| 4 | 0.192％ | 1.338％ | 16 |
| 5 | 0.191％ | 1.345％ | 16 |
| 6 | 0.186％ | 1.579％ | 17 |
试验结果表明，本发明反相高效液相色谱的重复性好。
试验例7检测限试验
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
精密称取中间体II约25mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取供试品溶液，加流动相稀释成一定浓度的对照溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。当浓度为每1ml中含13.28ng时，杂质中间体II峰高约为基线噪音的3倍，按信噪比等于3：1计，得中间体II的检测限为0.27ng。
试验例8定量限试验
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸二氢钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
精密称取中间体II约25mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取供试品溶液，加流动相稀释成一定浓度的对照溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。当浓度为每1ml中含44.25ng时，中间体II峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比等于10：1计，得中间体II的定量限为0.88ng。
以下实施例为验证本发明检测方法的检测效果。
实施例2采用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(体积比为30：70)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法制备供试液并进样，结果表明：阿哌沙班中间体II的保留时间为25.113min，与相邻杂质的分离度为4.011，理论塔板数(按中间体II计算)为38871，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测中间体II的有关物质。
实施例3采用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸氢二钠(体积比为40：60)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法制备供试液并测定，结果表明：阿哌沙班中间体II保留时间为15.013min，与相邻杂质的分离度为1.723，理论塔板数(按中间体II计算)为64122，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测中间体II的有关物质。
实施例4采用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(体积比为30：70)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法制备供试液并进样测定，结果表明：阿哌沙班中间体II保留时间为26.181min，与相邻杂质的分离度为3.977，理论塔板数(按中间体II计算)为37752，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测起始物料中的有关物质。
实施例5用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法制备供试液并进样测定，结果表明：阿哌沙班中间体II保留时间为19.014min，与相邻杂质的分离度为2.301，理论塔板数(按中间体II计算)为48833，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测起始物料中的有关物质。
实施例6用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.025mol/L磷酸氢二钠(体积比为40：60)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法制备供试液并进样测定，结果表明：阿哌沙班中间体II保留时间为15.557min，与相邻杂质的分离度为1.691，理论塔板数(按中间体II计算)为65222，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测中间体II的有关物质。
实施例7用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(体积比为30：70)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。。
按照实施例1的方法制备供试液并进样测定，结果表明：阿哌沙班中间体II保留时间为25.991min，与相邻杂质的分离度为3.876，理论塔板数(按中间体II计算)为36752，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测起始物料中的有关物质。
实施例8用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(体积比为35：65)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。。
按照实施例1的方法制备供试液并进样测定，结果表明：阿哌沙班中间体II保留时间为19.117min，与相邻杂质的分离度为2.303，理论塔板数(按中间体II计算)为49929，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测起始物料中的有关物质。
实施例9用反相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Welch Ultimate XB-C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.035mol/L磷酸氢二钠(体积比为40：60)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法制备供试液并进样测定，结果表明：阿哌沙班中间体II保留时间为14.127min，与相邻杂质的分离度为1.698，理论塔板数(按中间体II计算)为68875，阿哌沙班中间体II的峰纯度指数为1.000000，本发明反相高效液相色谱可以用于检测起始物料中的有关物质。
综上所述，本发明反相高效液相色谱检测阿哌沙班中中间体II有关物质的方法，中间体II与各杂质成分之间分离良好，流动相组成简单；同时本发明方法的检测结果准确、可靠，通过控制阿哌沙班合成过程中起始物料的质量进一步的加强了成品合成的过程控制。
Claims (10)
1.反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：称取起始中间体II用流动相溶解并稀释，得到浓度为0.4～0.6mg/ml的供试品溶液；
b、采用反相高效液相色谱分别对供试品溶液进行检测：
其中，色谱条件如下：
色谱柱的固定相：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相为甲醇、0.025-0.035mol/L磷酸氢二钠溶液，两者按体积比30％：70％～40％：60％混合：
检测波长为270nm～290nm；
c、按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量。
2.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤a中供试品溶液的浓度为0.5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150-250mm，填料粒径为3.5-5μm；
优选的，步骤b中，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
4.根据权利要求1或3所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中色谱柱为Welch Ultimate XB-C18。
5.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中所述0.025-0.035mol/L磷酸氢二钠溶液为0.03mol/L磷酸氢二钠溶液、0.025mol/L磷酸氢二钠溶液或0.035mol/L磷酸氢二钠溶液；
优选的，步骤b中甲醇与0.03mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为30％：70％～40％：60％；甲醇与0.025mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为30％：70％～40％：60％；甲醇与0.035mol/L磷酸氢二钠的体积比为30％：70％～40％：60％。
6.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中甲醇与0.03mol/L磷酸氢二钠的体积比为35％：65％。
7.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中柱温为30℃～40℃；流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
8.根据权利要求7所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中柱温为30℃或35℃或40℃；流速为0.8ml/min或1.0ml/min或1.2ml/min。
9.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中检测波长为280nm。
10.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中间体II的方法，其特征在于：步骤b中进样量为20μl。
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