CN104833737A - 正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中srs异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法，它包括以下步骤：a、制备供试品溶液；b、制备对照品溶液；c、采用正相高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测；d、按外标法以峰面积计算供试品中SRS异构体的含量。本发明正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法，流动相中无需加入离子对试剂，就能实现阿瑞匹坦与SRS异构体色谱峰之间的完全分离，分离度高达2.8以上；同时，本发明方法的检测结果准确、可靠，对色谱柱的影响较小，具有操作简便、成本低等诸多优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法。
背景技术
阿瑞匹坦的化学名称为：5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啡啉]甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮，分子式：C23H21F7N4O3，分子量：534.43，结构式如下所示；现已上市的阿瑞匹坦产品有阿瑞匹坦胶囊(阿瑞匹坦胶囊收载于国家食品药品监督管理总局《进口药品注册标准》，标准号：JX20050253)。
在阿瑞匹坦产品中，往往会存在有多种杂质化合物，例如：SRS异构体、RRR异构体、RSS异构体、中间体等，这些杂质化合物的存在会严重影响其产品的质量控制和用药安全，因此需要对阿瑞匹坦进行检测和监控。
高效液相色谱是一种常用的检测方法，它又分为反相高效液相色谱、正相高效液相色谱，由于两者的固定相、流动相等都完全不同，因此它们是两种差异非常大的检测方法，具体而言：
反相高效液相色谱：采用非极性或相对极性较弱的固定相，以极性较强的溶剂作为流动相，常用于分离、检测非极性和极性较弱的化合物；反相高效液相色谱在现代液相色谱中的应用最为广泛，据统计，它占整个高效液相色谱应用的80％左右。
正相高效液相色谱：采用极性固定相，以相对极性较弱的溶剂作为流动相，常用于分离、检测中等极性和极性较强的化合物。
阿瑞匹坦为极性较弱的化合物，通常采用反相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中的杂质，如：阿瑞匹坦胶囊质量标准中就是采用十八烷基硅烷键合硅胶 为填充剂的反相高效液相色谱进行检测，但阿瑞匹坦与SRS异构体的色谱峰重叠在一起，该方法不能用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
为了实现阿瑞匹坦与SRS异构体的分离，往往需要在流动相中加入离子对试剂(如：三氟乙酸、十二烷基硫酸钠等，余丽辜慧晁若冰.阿瑞匹坦中有关物质检查方法的研究.药物分析杂志.2013，33(8)和中国专利CN103760257A.)，然而，流动相中加入离子对试剂会对色谱柱造成不可逆的伤害，而且离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，会大大缩短色谱柱的使用寿命，检测成本高，同时，离子对试剂对pH值敏感，配制流动相时要求精确度较高，否则直接影响实验的重复性和重现性，该检测方法的实际应用价值也很小。
因此，需要开发一种检测阿瑞匹坦中SRS异构体的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法。
本发明提供的正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法，它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：取阿瑞匹坦胶囊内容物，用流动相溶解，得到供试品溶液；
b、制备对照品溶液：取SRS异构体，用流动相溶解，得到对照品溶液；
c、采用正相高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测：
色谱柱的固定相：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶为填充剂；
流动相选自正己烷-乙醇、正庚烷-乙醇或正庚烷-异丙醇；
检测波长为210nm～220nm；
d、按外标法以峰面积计算供试品中SRS异构体的含量。
本发明中的SRS异构体，其化学名称为5-(((2S，3R)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮，结构式如下：
进一步的，步骤a中，供试品溶液的浓度为0.8～1.0mg/ml；步骤b中，对照品溶液的浓度为0.1～5.2μg/ml。
进一步的，步骤c中，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
进一步的，步骤c中，色谱柱为CHIRALPAK AD-H。
进一步的，步骤c中，正己烷与乙醇的体积比为85％：15％～90％：10％；正庚烷与乙醇的体积比为85％：15％～95％：5％；正庚烷与异丙醇的体积比为85％：15％～95％：5％。
进一步的，步骤c中，正己烷与乙醇的体积比为90％：10％。
进一步的，步骤c中，柱温为30℃～40℃；流速为0.4ml/min～0.7ml/min。
进一步的，步骤c中，柱温为30℃或35℃或40℃；流速为0.4ml/min或0.5ml/min或0.7ml/min。
进一步的，步骤c中，检测波长为215nm。
进一步的，步骤c中，进样量为20μl。
本发明正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法，流动相中无需加入离子对试剂，就能实现阿瑞匹坦与SRS异构体色谱峰之间的完全分离，分离度高达2.8以上；同时，本发明方法的检测结果准确、可靠，对色谱柱的影响较小，具有操作简便、成本低等诸多优点。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1实施例1本发明方法对系统适用性试验的检测结果；
图2实施例1对比试验方法对混合溶液的检测结果；
图3试验例3的标准曲线图；
图4试验例4的检测结果：供试品溶液；
图5试验例4的检测结果：对照品溶液；
图6试验例4的检测结果：阴性样品溶液。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
高效液相色谱仪(型号：LC-20AT二元泵，生产厂家：日本岛津公司)
电子天平(型号：AUW220D，生产厂家：日本岛津公司)
实施例1
1、确定检测波长
精密称取阿瑞匹坦胶囊内容物适量，用流动相(正己烷-乙醇＝90：10)配制成浓度为20μg/ml的溶液，作为供试品溶液。
精密称取对照品(SRS异构体)适量，用流动相(正己烷-乙醇＝90：10)配制成浓度为20μg/ml的溶液，作为对照品溶液。
取上述的供试品溶液、对照品溶液，在200nm～400nm波长范围内进行扫描，试验结果见表1。
表1、本发明的紫外扫描结果
| 项目 | 峰波长(nm) | 峰值 | 谷波长(nm) | 谷值 |
| 供试品溶液 | 215.2 | 0.5618 | 231.8 | 0.0210 |
| 对照品溶液 | 215.8 | 0.5596 | 230.5 | 0.0198 |
试验结果表明，检测波长在210nm～220nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱检测方法；优选的，检测波长为215±2nm。
2、高效液相色谱检测方法
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-乙醇(体积比为90：10)；
柱温：30℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
系统适用性试验：取阿瑞匹坦胶囊内容物、SRS异构体各20μg，加入1ml流动相(正己烷-乙醇＝90：10)，作为系统适用性溶液；量取20μl系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿瑞匹坦与SRS异构体之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按阿瑞匹坦峰计算应不小于2000。
制备供试品溶液：称取阿瑞匹坦胶囊内容物43mg，置于50ml量瓶中，加流动相(正己烷-乙醇＝90：10)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取对照品(SRS异构体)5mg，置于100ml量瓶中，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加流动相(正己烷-乙醇＝90：10)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
系统适用性试验的检测结果见图1，阿瑞匹坦(保留时间为14.728min)与SRS异构体(保留时间为12.140min)之间的分离度为4.423，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为8467，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
本发明正相高效液相色谱检测供试品溶液，结果为：供试品中未检出SRS异构体。
对比试验：采用反相高效液相色谱进行检测
按照《进口药品注册标准》阿瑞匹坦胶囊有关物质检测方法：
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS3，50×4.6mm，5μm或其他性能相当色谱柱)；
流动相：以磷酸二氢钾溶液(取3.40g磷酸二氢钾，置1000ml量瓶中，加水900ml，用磷酸调节pH值至3.0，再用水稀释至刻度，混匀)-乙腈(55:45)为流动相；
流速：1.5ml/min；
检测波长：210nm；
混合溶液：取阿瑞匹坦胶囊内容物、SRS异构体各20μg，加入1ml流动相，作为混合溶液；
制备供试品溶液：称取阿瑞匹坦胶囊内容物43mg，置于50ml量瓶中，加流动相适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液 作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取对照品5mg，置于100ml量瓶中，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
混合溶液的检测结果见图2，阿瑞匹坦与SRS异构体的色谱峰重叠在一起，对比试验的反相高效液相色谱不能用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例2
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-乙醇(90：10)；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为15.128min)与SRS异构体(供其保留时间为13.502min)之间的分离度为3.887，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为4820，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.026，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例3
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-乙醇(85：15)；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为22.482min)与SRS异构体(保留时间为18.762min)之间的分离度为 4.226，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为2583，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.189，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例4
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-乙醇(95：5)；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为11.526min)与SRS异构体(保留时间为9.871min)之间的分离度为2.872，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为2112，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.482，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例5
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-乙醇(90：10)；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为18.212min)与SRS异构体(保留时间为16.523min)之间的分离度为2.928，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为2013，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.868，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例6
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-异丙醇(95：5)；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为13.252min)与SRS异构体(保留时间为11.011min)之间的分离度为3.551，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为2332，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.524，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例7
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-异丙醇(90：10)；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为20.081min)与SRS异构体(保留时间为17.872min)之间的分离度为3.995，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为2508，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.611，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例8
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正庚烷-异丙醇(85：15)；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为28.113min)与SRS异构体(保留时间为25.856min)之间的分离度为4.537，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为2279，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.857，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例9
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-乙醇(90：10)；
柱温：30℃；
流速：0.4ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为16.122min)与SRS异构体(保留时间为14.128min)之间的分离度为4.117，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为3513，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为1.085，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
实施例10
采用正相高效液相色谱进行检测：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-乙醇(90：10)；
柱温：40℃；
流速：0.7ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿瑞匹坦(保留时间为13.708min)与SRS异构体(保留时间为10.022min)之间的分离度为3.672，理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)为4822，阿瑞匹坦峰的拖尾因子为0.996，本发明正相高效液相色谱可以用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
综上所述，本发明正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法，流动相中无需加入离子对试剂，就能实现阿瑞匹坦与SRS异构体色谱峰之间的完全分离，分离度高达2.8以上；同时，本发明方法的检测结果准确、可靠，对色谱柱的影响较小，具有操作简便、成本低等诸多优点。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1 流动相筛选试验
选择不同的流动相进行筛选试验，其他色谱条件如下：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温：35℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μl；
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表2：
表2、流动相筛选试验结果
| 编号 | 流动相 | 保留时间 | 分离度 | 拖尾因子 | 理论塔板数 |
| 1 | 正己烷-乙醇(95：5) | 7.852min | 1.282 | 1.075 | 3521 |
| 2 | 正己烷-乙醇(90：10) | 15.128min | 3.887 | 1.026 | 4820 |
| 3 | 正己烷-乙醇(85：15) | 22.482min | 4.226 | 1.189 | 2583 |
| 4 | 正己烷-异丙醇(95：5) | 8.853min | 1.113 | 0.956 | 2871 |
| 5 | 正己烷-异丙醇(90：10) | 13.331min | 1.527 | 0.981 | 2623 |
| 6 | 正己烷-异丙醇(85：15) | 19.251min | 1.856 | 1.227 | 2992 |
| 7 | 正庚烷-乙醇(95：5) | 11.526min | 2.872 | 1.482 | 2112 |
| 8 | 正庚烷-乙醇(90：10) | 18.212min | 2.928 | 1.868 | 2013 |
| 9 | 正庚烷-乙醇(85：15) | 26.189min | 3.013 | 1.921 | 1988 |
| 10 | 正庚烷-异丙醇(95：5) | 13.252min | 3.551 | 1.524 | 2332 |
| 11 | 正庚烷-异丙醇(90：10) | 20.081min | 3.995 | 1.611 | 2508 |
| 12 | 正庚烷-异丙醇(85：15) | 28.113min | 4.537 | 1.857 | 2279 |
[0165] 表2中，流动相“例如：正己烷-乙醇(90：10)”具有中国药典2010年版通常具有的含义，其中90：10表示正己烷与乙醇的体积比；保留时间是指阿瑞匹坦的保留时间；分离度是指阿瑞匹坦与SRS异构体之间的分离度；拖尾因子是指阿瑞匹坦峰的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)。
试验结果表明，流动相为正己烷-乙醇(90：10)、正己烷-乙醇(85：15)、正庚烷-乙醇(95：5)、正庚烷-乙醇(90：10)、正庚烷-乙醇(85：15)、正庚烷-异丙醇(95：5)、正庚烷-异丙醇(90：10)、正庚烷-异丙醇(85：15)时，均适合用于检测阿瑞匹坦中的SRS异构体。
试验例2 柱温和流速筛选试验
选择不同的柱温和流速进行筛选试验，其他色谱条件如下：
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-乙醇(90：10)；
检测波长：215nm；
进样量：20μl。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表3：
表3、柱温和流速筛选试验结果
表3中，保留时间是指阿瑞匹坦的保留时间；分离度是指阿瑞匹坦与SRS异构体之间的分离度；拖尾因子是指阿瑞匹坦峰的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按阿瑞匹坦峰计算)。
试验结果表明，柱温和流速对本发明检测结果的影响很小；优选的，柱温为30℃～40℃；流速为0.4ml/min～0.7ml/min。
试验例3 线性关系试验
色谱条件与系统适用性试验：
用直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶为填充剂的色谱 柱；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温30℃；
正己烷-乙醇(90:10)为流动相；
流速为0.5ml/min；
检测波长为215nm；
进样量：20μl。
取对照品(SRS异构体)，用流动相稀释制成表4中一系列浓度的对照品溶液。按照上述色谱条件，分别进行检测，检测结果见表4。
表4、线性关系试验的检测结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 浓度(μg/ml) | 0.104 | 0.260 | 0.521 | 1.041 | 2.083 | 5.207 |
| 峰面积 | 6548 | 16185 | 33555 | 67775 | 138760 | 359740 |
以SRS异构体浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，其标准曲线见图3。
试验结果表明，在0.1μg/ml～5.2μg/ml范围内，本发明检测方法具有良好的线性关系。
试验例4 专属性研究
按照本发明方法制备供试品溶液、对照品溶液。
取甘露醇10g、交联羧甲基纤维钠1g、羟丙甲纤维素1.2g、十二烷基硫酸钠0.72g、微晶纤维素2.1g、硬脂酸镁0.5g，以上六种辅料，混匀；按照类似方法制备阴性样品溶液，按照下列色谱条件进行测定。
色谱柱的填充剂：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶；如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：正己烷-乙醇(体积比为90：10)；
柱温：30℃；
流速：0.5ml/min；
检测波长：215nm；
精密量取上述各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4：供试品溶液；图5：对照品溶液；图6：阴性样品溶液。
试验结果表明，阴性样品溶液不会对本发明正相高效液相色谱检测阿瑞 匹坦中SRS异构体的方法造成干扰。
试验例5 精密度试验
取对照品SRS异构体适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；
按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。
检测结果见表5。
表5、精密度试验的检测结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD |
| 峰面积 | 32364 | 33113 | 32682 | 34080 | 32721 | 32868 | 32971 | 1.81％ |
试验结果表明，本发明正相高效液相色谱的精密度良好。
试验例6 稳定性试验
取两种不同规格(规格：80mg、125mg)的阿瑞匹坦胶囊，按照本发明方法将其配制成供试品溶液和SRS对照品溶液，取供试品溶液分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h进样检测；按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl对照品溶液，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中SRS异构体的含量，结果见表6。
表6、稳定性试验的检测结果
| 进样时间 | 0h | 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | 12h |
| 规格：80mg | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 规格：125mg | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
试验结果表明，本发明正相高效液相色谱的稳定性良好。
试验例7 重复性试验
取两种不同规格(规格：80mg、125mg)的阿瑞匹坦胶囊，按照本发明方法将其配制成供试品溶液，分别平行制备6份供试品溶液，并制备SRS对照品溶液；按照试验例3的色谱条件，精密量取20μl对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中SRS异构体的含量，结果见表7。
表7、重复性试验的检测结果
| 供试品 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 |
| 规格：80mg | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 规格：125mg | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
[0217] 试验结果表明，本发明正相高效液相色谱的重复性好。
试验例8
色谱条件与系统适用性试验：
用直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶为填充剂的色谱柱如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温30℃；
正己烷-乙醇(90:10)为流动相；
流速为0.5ml/min；
检测波长为215nm。
取阿瑞匹坦胶囊内容物及SRS异构体适量，加流动相制成每1ml中各含20μg的溶液，作为系统适用性溶液；量取20μl系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿瑞匹坦与SRS异构体之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按阿瑞匹坦峰计算应不小于2000。
制备供试品溶液：称取阿瑞匹坦胶囊内容物43mg，置于50ml量瓶中，加流动相(正己烷-乙醇＝90：10)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取对照品(SRS异构体)5mg，置于100ml量瓶中，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加流动相(正己烷-乙醇＝90：10)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使SRS异构体色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20％，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如果显示SRS异构体峰，按外标法以峰面积计算SRS异构体的含量不得过0.1％。按照上述的方法，分别对两种不同规格(规格：80mg、125mg)的阿瑞匹坦胶囊进行检测3次。
试验结果表明，供试品中未检出SRS异构体，阿瑞匹坦与SRS异构体达到良好的基线分离。
试验例9 定量限和检测限试验
色谱条件与系统适用性试验：
用直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶为填充剂的色谱柱如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度 为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温30℃；
正己烷-乙醇(90:10)为流动相；
流速为0.5ml/min；
检测波长为215nm。
称取阿瑞匹坦胶囊内容物13.20mg，置于25ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
称取SRS异构体13.01mg，置于25ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
制备混合溶液：取上述供试品溶液和对照品溶液各1.0ml，置于25ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为混合溶液。
量取上述混合溶液1.0ml，置于100ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀；取其中的2.5ml，置于10ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为定量限和检测限试验的检测溶液(S/N≈10)。
检测结果见表8。
表8、试验例9的检测结果
测得SRS异构体和阿瑞匹坦的定量限分别为1.04ng和1.06ng。
精密量取检测溶液10μl进样分析，作为检测限结果(S/N≈3)；测得SRS异构体和阿瑞匹坦的检测限分别为0.52ng和0.53ng。
试验例10 回收率试验
色谱条件与系统适用性试验：
用直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶为填充剂的色谱柱如：色谱柱的型号为CHIRAL PAK AD-H，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
柱温30℃；
正己烷-乙醇(90:10)为流动相；
流速为0.5ml/min；
检测波长为215nm。
浓度1：取专属性试验项下的阴性样品，称取约75mg，置于200ml量瓶中，加入SRS异构体对照品贮备液(浓度：0.0521mg/ml)1ml，加流动相稀 释至刻度，摇匀，同法配制三份；浓度2：取专属性试验项下的阴性样品，称取约75mg，置于200ml量瓶中，加入SRS异构体对照品贮备液(浓度：0.0521mg/ml)2ml，加流动相稀释至刻度，摇匀，同法配制三份；浓度3：取专属性试验项下的阴性样品，称取约75mg，置于200ml量瓶中，加入SRS异构体对照品贮备液(浓度：0.0521mg/ml)3ml，加流动相稀释至刻度，摇匀，同法配制三份。
按照上述拟定的方法制备SRS异构体对照品溶液，精密吸取供试品溶液(浓度1、浓度2、浓度3)及SRS异构体对照品溶液20μl进样测定，记录色谱图，并计算测得量及回收率，其结果见表9。
表9、回收率试验的结果
试验结果表明，本发明检测方法的回收率高，相对标准偏差小，检测结果的准确度高。
Claims (10)
1.正相高效液相色谱检测阿瑞匹坦中SRS异构体的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：取阿瑞匹坦胶囊内容物，用流动相溶解，得到供试品溶液；
b、制备对照品溶液：取SRS异构体，用流动相溶解，得到对照品溶液；
c、采用正相高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测：
色谱柱的固定相：用直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂布的硅胶为填充剂；
流动相选自正己烷-乙醇、正庚烷-乙醇或正庚烷-异丙醇；
检测波长为210nm～220nm；
d、按外标法以峰面积计算供试品中SRS异构体的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，供试品溶液的浓度为0.8～1.0mg/ml；步骤b中，对照品溶液的浓度为0.1～5.2μg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱为CHIRALPAK AD-H。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，正己烷与乙醇的体积比为85％：15％～90％：10％；正庚烷与乙醇的体积比为85％：15％～95％：5％；正庚烷与异丙醇的体积比为85％：15％～95％：5％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，正己烷与乙醇的体积比为90％：10％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，柱温为30℃～40℃；流速为0.4ml/min～0.7ml/min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤c中，柱温为30℃或35℃或40℃；流速为0.4ml/min或0.5ml/min或0.7ml/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，检测波长为215nm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，进样量为20μl。
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