CN109932442A - 一种布瓦西坦异构体的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种布瓦西坦异构体的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：(1)配置溶液；(2)检测；(3)分析色谱图。本发明提供的一种布瓦西坦异构体的检测方法，通过选择特定的色谱条件，能简单、快速、准确地分离、检测出布瓦西坦及其光学异构体杂质，从而保证了布瓦西坦及其制剂的质量可控，用本发明方法能够测定出异构体含量，对合成工艺的开发起到指导了作用，有助于对原料药的质量标准制订。

Description

一种布瓦西坦异构体的检测方法

技术领域

本发明涉及一种布瓦西坦异构体的检测方法，属于医药技术领域。

背景技术

布瓦西坦是由比利时制药商UCB最新开发的第3代抗癫痫药物，化学名为(S)-2-(R)-3-丙基吡咯烷-1-基丁酰胺。是一种新型的突触囊泡蛋白2A(SV2A)高亲和性配体，同时对电压依赖性钠离子通道亦有一定的抑制作用。2005年，布瓦西坦获得FDA及欧盟批准用于治疗罕见症状性肌阵挛癫痫发作，目前正在进行包括癫痫部分发作辅助治疗的多项Ⅲ期临床试验研究，研究结果表明布瓦西坦对于全身性癫痫发作具有较好的疗效。

布瓦西坦的化学结构式如下所示：

目前，布瓦西坦的制备工艺几乎都需要采用手性色谱柱分离异构体，对设备要求较高，很难做到没有异构体产生。比如，专利CN1882535A公开了一种布瓦西坦的制备方法，最终得到的是布瓦西坦及其非对映异构体(2S)-2-((4S)-2-氧代-4-正丙基-1-吡咯烷基)丁酰胺的混合物，需在25±2℃温度下，采用(CHIRALPAK AD 20μm)手性固相、正己烷/乙醇(45/55，V/V)为洗脱剂，通过色谱分离上述混合物，才能得到纯度较高的布瓦西坦。专利WO2007065634A1提供了布瓦西坦的另一种合成路线，其中需要使用价格昂贵的金属催化剂RuCl3，而且，该制备方法同样要采用手性色谱柱分离布瓦西坦及其非对映异构体。而专利US20030120080A1、WO0162726A2及上述所提及专利中均未有详细的布瓦西坦对映异构体和非对映异构体含量测定方法。

布瓦西坦是具有两个手性中心的化学药物，起药效作用的为SR型，其RS型对映异构体、SS型非对映异构体、RR型非对映异构体作为杂质在药学研究中严格控制。

布瓦西坦RS型对映异构体的化学结构式如下：

布瓦西坦SS型非对映异构体的化学结构式如下：

布瓦西坦RR型非对映异构体的化学结构式如下：

鉴于现有的布瓦西坦制备方法均有异构体产生，而并无异构体含量的检测方法。因此，亟需建立一种易操作的关于布瓦西坦对映异构体和非对映异构体的检测方法，以便更好地促进该药物的研发，确保产品质量。

发明内容

为了更好地指导和促进对布瓦西坦原料药的研究开发以及质量标准的制定，本发明的目的在于：提供一种检测布瓦西坦异构体的分析方法，有效用于布瓦西坦合成工艺的研究开发和质量分析。

本发明提供了一种布瓦西坦异构体的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

(1)配置溶液

a、对照品溶液：分别称取布瓦西坦RS、RR、SS型对映异构体对照品，及布瓦西坦对照品，用流动相溶解，得到A、B、C、D对照品溶液；

b、供试品溶液：称取布瓦西坦样品，加流动相溶解，即得；

c、对照溶液：取步骤b供试品溶液，加流动相稀释，即得；

(2)检测

分别取对照品溶液、供试品溶液和对照溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相；流动相：正己烷(A)-乙醇(B)-三氟乙酸(C)，流动相比例：A：B：C＝60～95：5～40：0.05～1；

(3)分析色谱图。

进一步地，步骤a所述对照品溶液每100ml含RS构型、RR构型、SS构型、布瓦西坦对照品5-800mg。

进一步地，步骤b所述样品与流动相的质量体积比为(0.5～2.0)mg：1ml，优选1.0mg:1ml。

进一步地，步骤c所述供试品溶液与流动相的体积比为1：100。

进一步地，步骤(2)所述注入液相色谱仪的溶液体积为20μl；和/或，流动相比例A:B:C＝85：15：0.1；和/或，所述色谱条件中波长为205～254nm，柱温为20～40℃，流动相流速为0.5～1.5ml/min。

更进一步地，所述波长为210nm，柱温为30℃，流动相流速为1ml/min。

进一步地，步骤(3)所述色谱图中，根据对照品溶液色谱图确定布瓦西坦与其对映异构体色谱峰的保留时间，根据供试品溶液和对照溶液色谱图计算供试品中各异构体的含量。

更进一步地，所述各异构体含量的计算公式为：

异构体含量％＝(供试品中异构体的峰面积/对照溶液布瓦西坦峰面积)×100％。

进一步地，步骤(1)所述对照品溶液混合得系统适用性溶液，系统性适用性溶液中每1ml含RS构型、RR构型、SS构型、布瓦西坦分别为0.02～0.5mg、0.005～0.2mg、0.01～0.5mg、0.02～3.0mg，优选为0.05mg、0.01mg、0.02mg、0.05mg。

更进一步地，所述系统适用性溶液注入液相色谱仪，按步骤(2)检测，所得色谱图中，布瓦西坦及其对映异构体色谱峰的分离度应大于2。

本发明中所述“布瓦西坦”是指SR型布瓦西坦。

本发明中所述“布瓦西坦异构体”都是指RS型对映异构体、SS型非对映异构体、RR型非对映异构体。

本发明提供了一种布瓦西坦异构体的检测方法，通过选择特定的色谱条件，能简单、快速、准确地分离、检测出布瓦西坦及其光学异构体杂质，从而保证了布瓦西坦及其制剂的质量可控，用本发明方法能够测定出异构体含量，对合成工艺的开发起到指导了作用，有助于对原料药的质量标准制订。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1系统适用性溶液的HPLC图谱

图2对照溶液的HPLC图谱

图3供试品溶液的HPLC图谱

图4系统适用性溶液的HPLC图谱

图5对照溶液的HPLC图谱

图6供试品溶液的HPLC图谱

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

1)材料

布瓦西坦RS型对映异构体杂质对照品(成都惟邦药业有限公司提供，批号20420211A)

布瓦西坦SS型非对映异构体杂质对照品(成都惟邦药业有限公司提供，批号20420311A)

布瓦西坦RR型非对映异构体杂质对照品(成都惟邦药业有限公司提供，批号20420411A)

布瓦西坦对照品(成都惟邦药业有限公司提供，批号20171201)

布瓦西坦(成都惟邦药业有限公司提供，批号20180501,20180801)

实施例1高效液相色谱法测定布瓦西坦对映异构体含量

1、高效液相色谱法主要技术参数

a、高效液相色谱仪；

b、硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱；

c、流动相:正己烷：乙醇：三氟乙酸＝85:15:0.1，流速为1.0ml/min；

d、检测波长为210nm，柱温30℃。

2、检测

(1)配制溶液

a、供试品溶液：精密称定布瓦西坦样品49.45mg(批号20180501，成都惟邦药业有限公司提供)，置于50ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。

b、对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml至100ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

c、取RS型对映异构体对照品19.35mg，置于100ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，得到A溶液。

d、取RR型非对映异构体对照品5.29mg，置于100ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，得到B溶液。

e、取SS型非对映异构体对照品8.22mg，置于100ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，得到C溶液。

f、取布瓦西坦对照品19.66mg，置于100ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，以流动相稀释，得到D溶液。

g、系统适用性溶液：各取上述A、B、C、D溶液各25ml混合，即得系统适用性溶液。

(2)高效液相色谱法

a、分别取A溶液、B溶液、C溶液、D溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，得布瓦西坦峰与其异构体峰的保留时间分别为9.1min，10.1min，13.1min，18.8min。

b、取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图1和表1所示。

表1系统适用性溶液的HPLC分离情况数据

结论：布瓦西坦峰及其各异构体峰的分离度分别为2.62，6.86，9.11，均大于2.0，符合要求。

c、取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图2和表2所示。

表2对照溶液的HPLC图谱数据

d、取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图3和表3所示。供试品溶液的色谱图中，如有异构体峰，按自身对照法计算含量，要求各异构体含量小于0.1％。

表3供试品溶液的HPLC图谱数据

(3)布瓦西坦异构体含量的计算

异构体含量％＝(供试品中异构体的峰面积/对照溶液峰面积)*100％

测定结果为：布瓦西坦(批号20180501)中，布瓦西坦异构体含量:

SS未检出；

RS异构体％＝(6.186/174.25)*100％＝0.04％；

RR异构体％＝(11.12/174.25)*100％＝0.06％。

实施例2高效液相色谱法测定布瓦西坦对映异构体含量

1、高效液相色谱法主要技术参数

a、高效液相色谱仪；

b、硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱；

c、流动相:正己烷：乙醇：三氟乙酸＝85:15:0.1，流速为1.0ml/min；

d、检测波长为210nm，柱温30℃。

2、检测

(1)配制溶液

a、供试品溶液：精密称定布瓦西坦样品49.54mg(批号20180801，成都惟邦药业有限公司提供)，置于50ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。

b、对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml至100ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

c、取RS型对映异构体对照品97.35mg，置于100ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，得到A溶液。

d、取RR型非对映异构体对照品52.59mg，置于100ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，得到B溶液。

e、取SS型非对映异构体对照品60.09mg，置于100ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，得到C溶液。

f、取布瓦西坦对照品199.96mg，置于25ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，得到D溶液。

g、系统适用性溶液：各取上述A、B、C、D溶液适量混合，制得溶液中RS构型、RR构型、SS构型、布瓦西坦的浓度分别为0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml，作为系统适用性溶液。

(2)高效液相色谱法

a、分别取A溶液、B溶液、C溶液、D溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，得布瓦西坦峰与其异构体峰的保留时间分别为9.3min，10.3min，13.5min，19.1min。

b、取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图4和表4所示。

表4系统适用性溶液的HPLC分离情况数据

结论：布瓦西坦峰及其各异构体峰的分离度分别为2.13，5.93，6.53，均大于2.0，符合要求。

c、取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图5和表5所示。

表5对照溶液的HPLC图谱数据

d、取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图6和表6所示。供试品溶液的色谱图中，如有异构体峰，按自身对照法计算含量，要求各异构体含量小于0.1％。

表6供试品溶液的HPLC图谱数据

(3)布瓦西坦异构体含量的计算

异构体含量％＝(供试品中异构体的峰面积/对照溶液峰面积)*100％

测定结果为：布瓦西坦(批号20180801)中，布瓦西坦异构体含量:

RS未检出；

SS未检出；

RR异构体％＝(10.514/166.25)*100％＝0.06％。

以下通过实验例的方式进一步说明本发明的有益效果：

实验例1系统适用性考察

溶液配制：精密称取布瓦西坦对照品(批号20171201)和布瓦西坦异构体对照品适量，以流动相(正己烷：乙醇：三氟乙酸的体积比为85：15：0.1)配制成布瓦西坦浓度1.0mg/ml，各异构体0.01mg/ml的系统适用性溶液。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，进样6次，考察保留时间和峰面积的相对标准偏差，结果见表7。

表7系统适用性溶液测试结果汇总

结论：供试品溶液连续进样6次，布瓦西坦峰面积的RSD为0.6％，不大于2％，符合要求；各异构体的RSD分别为1.95％,2.73％,2.34％，均不大于10.0％，保留时间的RSD均不大于1.0％，符合，表明系统适用性良好。

实验例2专属性实验

精密称取10.3mg、10.2mg、10.1mg的布瓦西坦(批号20180501)3份，分别加入1M盐酸、1M氢氧化钠、2％双氧水各2ml，常温放置6小时，将酸碱样品中和后与氧化样品一起以流动相(正己烷：乙醇：三氟乙酸的体积比为85：15：0.1)稀释浓度至1.0mg/ml，作为A、B、C供试品溶液；另精密称取布瓦西坦(批号20180501)10.2mg，置于100℃高温试验箱中6小时，以流动相稀释浓度至1.0mg/ml，作为D供试品溶液。

取供试品溶液A、B、C、D各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算分离度。结果为：

主峰与各相邻峰之间的分离度均>2.0(药典标准不低于1.5)，分离度良好。

实验例3检测限和定量限

检测限和定量限测定结果见表8。

取布瓦西坦对照品适量，精密称定，以流动相(正己烷：乙醇：三氟乙酸的体积比为85：15：0.1)溶解，配制成10μg/ml的母液，逐级稀释，进行检测限和定量限确定试验。

表8检测限和定量限测定结果

结论：换算成绝对值，检测限为5.0ng，定量限为10.0ng，能够满足测定要求。

实验例4线性与范围

溶液的配制：精密称取布瓦西坦(批号20171201)50.56mg置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀。分别稀释成浓度为0.5056ug/ml、1.0112ug/ml、2.0224ug/ml、10.112ug/ml、20.224ug/ml、50.56ug/ml的供试品溶液。精密量取1-6号供试品溶液各20μl，注入气相色谱仪，每个编号溶液进样3次，考察峰面积的相对标准偏差，结果见表9。

表9线性与范围测定结果

结论：线性范围为0.2～50.6μg/ml,符合中国药典验证方案要求(LOQ至不低于150％指标浓度)，在此范围内线性方程为Y＝22.75X-6.96，线性回归系数R2为0.9995，符合要求(R2>0.9990)；响应因子的RSD值为7.3％，符合要求(RSD≤10％)；证实了良好线性关系。

实验例5精密度实验

溶液的配制：称取布瓦西坦50mg置50ml量瓶中，精密称定，6份，加甲醇稀释至刻度线，配制成浓度分别为10.0141μg/ml、10.0275μg/ml、10.0341μg/ml、10.0170μg/ml、10.0104μg/ml、10.0211μg/ml的1～6号供试品溶液。

精密量取1-6号供试品溶液各20μl，注入气相色谱仪，考察峰面积的相对标准偏差，结果见表10。

表10精密度测定结果

结论：6份供试液含量的RSD值为2.42％，符合要求(RSD<10％)。

综上，经实验证明，本发明检测方法的系统适用性、专属性、定量限和检测限、线性、精密度的结果良好，均符合要求，可用于布瓦西坦的对映异构体和非对映异构体的检测。

Claims (10)

1.一种布瓦西坦异构体的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

(1)配置溶液

a、对照品溶液：分别称取布瓦西坦RS、RR、SS型对映异构体对照品，及布瓦西坦对照品，用流动相溶解，得到A、B、C、D对照品溶液；

b、供试品溶液：称取布瓦西坦样品，加流动相溶解，即得；

c、对照溶液：取步骤b供试品溶液，加流动相稀释，即得；

(2)检测

分别取对照品溶液、供试品溶液和对照溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以硅胶表面共价键合有直链淀粉－三(3，5－二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相；流动相：正己烷(A)-乙醇(B)-三氟乙酸(C)，流动相比例：

A：B：C＝60～95：5～40：0.05～1；

(3)分析色谱图。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a所述对照品溶液每100ml含RS构型、RR构型、SS构型、布瓦西坦对照品5-800mg。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b所述样品与流动相的质量体积比为(0.5～2.0)mg：1ml，优选1.0mg:1ml。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c所述供试品溶液与流动相的体积比为1：100。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述注入液相色谱仪的溶液体积为20μl；和/或，流动相比例A:B:C＝85：15：0.1；和/或，所述色谱条件中波长为205～254nm，柱温为20～40℃，流动相流速为0.5～1.5ml/min。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述波长为210nm，柱温为30℃，流动相流速为1ml/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)所述色谱图中，根据对照品溶液色谱图确定布瓦西坦与其对映异构体色谱峰的保留时间，根据供试品溶液和对照溶液色谱图计算供试品中各异构体的含量。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述各异构体含量的计算公式为：

异构体含量％＝(供试品中异构体的峰面积/对照溶液布瓦西坦峰面积)×100％。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述对照品溶液混合得系统适用性溶液，系统性适用性溶液中每1ml含RS构型、RR构型、SS构型、布瓦西坦分别为0.02～0.5mg、0.005～0.2mg、0.01～0.5mg、0.02～3.0mg，优选为0.05mg、0.01mg、0.02mg、0.05mg。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述系统适用性溶液注入液相色谱仪，按权利要求1、5～6任意一项所述色谱条件检测，所得色谱图中，布瓦西坦及其对映异构体色谱峰的分离度应大于2。