CN109870528A - 一种高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊中有关物质的方法，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液：乙腈＝97‑99：1‑3，其中，0.05mol/L磷酸氢二钾溶液用20％磷酸溶液调节pH值至8.2；流动相B：乙腈；柱温：20‑35℃；检测波长：205nm‑215nm；流速：0.8‑1.1mL/min；采用梯度洗脱等色谱条件进行检测，该方法专属性好、分析速度快、重现性高，可用于准确、灵敏的检测出阿奇霉素胶囊15个已知杂质与其他未知杂质，有关物质色谱条件明显优于国内外药典方法。

Description

一种高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊有关物质的方法

技术领域

本发明属于有关物质检测领域，特别涉及一种高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊有关物质的方法。

背景技术

阿奇霉素(azithromycin，AZM)是一种新型大环内酯类抗生素，它是由红霉素A9-酮基肟后经Beckman重排，N-甲基化等一系列反应所得。1980年被克罗地亚的Pliva公司研制，并于1988年在世界范围内上市，至今已应用30余年。

目前，阿奇霉素可制成各种制剂形式，如胶囊、注射剂、滴眼剂等，现有技术公开有阿奇霉素滴眼剂和注射剂有关物质的测定方法，上述公开的方法不能实现对阿奇霉素胶囊中有关物质的测定，因此需要提供一种阿奇霉素胶囊有关物质的测定方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊有关物质的方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊中有关物质的方法，该方法采用以下条件进行测定：

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液：乙腈＝97-99：1-3，其中，0.05mol/L磷酸氢二钾溶液用20％磷酸溶液调节pH值至8.2；

流动相B：乙腈；

柱温：20-35℃；

检测波长：205nm-215nm；

流速：0.8-1.1mL/min；

采用梯度洗脱。

进一步的改进，流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液：乙腈＝98：2。

进一步的改进，梯度洗脱的程序为：

。

进一步的改进色谱柱为，规格为：WatersShield RP 18，4.6mm×250mm，5μm。

进一步的改进，所述流速为1mL/min。

进一步的改进，所述方法还包括供试品溶液和混合对照溶液的制备。

进一步的改进，步骤a所述供试品溶液的制备方法为：称取阿奇霉素胶囊内容物，用稀释液制成每1mL稀释液中含阿奇霉素10mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

进一步的改进，步骤b所述对照品溶液的制备方法为：取阿奇霉素和有关物质对照品，用稀释液制成每1mL稀释液中含阿奇霉素10mg、含有关物质0.05mg的溶液，滤过，取续滤液作为混合对照溶液。

进一步的改进所述稀释液为体积比为7：7：6的磷酸二氢铵溶液、甲醇和乙腈的混合物。

进一步的改进，所述磷酸二氢铵溶液的配制方法为：称取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000mL，用氨试液调节pH值至10.0±0.1。

本发明提供的高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊有关物质的方法，能够更好的控制阿奇霉素胶囊的质量，更好的对阿奇霉素胶囊中可能存在的多种已知杂质进行分离与测定。

附图说明

图1是本发明一种阿奇霉素胶囊系统适用性色谱图；

图2是杂质A的结构图；

图3是杂质B的结构图；

图4是杂质C的结构图；

图5是杂质E的结构图；

图6是杂质F的结构图；

图7是杂质G的结构图；

图8是杂质H的结构图；

图9是杂质I的结构图；

图10是杂质J的结构图；

图11是杂质L的结构图；

图12是杂质M的结构图；

图13是杂质N的结构图；

图14是杂质Q的结构图；

图15是杂质R的结构图；

图16是杂质S的结构图。

具体实施方式

实验例1系统适用性试验

混合对照溶液的配制：取杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S及阿奇霉素适量，加稀释液(稀释液为体积比为7：7：6的磷酸二氢铵溶液(称取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000mL，用氨试液调节pH值至10.0±0.1、甲醇和乙腈的混合物，)溶解并稀释制成每1mL中含阿奇霉素10mg，含各杂质0.05mg的溶液，作为混合对照溶液。

各杂质定位溶液的配制：取杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S各适量，分别加稀释液溶解并稀释制成每1mL中各含上述杂质0.05mg的溶液，作为杂质定位溶液。

供试品溶液的配制：精密称取阿奇霉素胶囊内容物适量(相当于处方比例阿奇霉素250mg)，置25mL量瓶中，加稀释液适量，超声10分钟，使阿奇霉素溶解，放冷，加稀释液稀释至刻度，摇匀，每1mL稀释液中含阿奇霉素10mg的溶液，滤过，取续滤液，即得。(临用新制)

对照溶液：精密量取上述供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。

灵敏度溶液：精密量取对照溶液1mL，置20mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。

测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为水相(0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(用20％磷酸溶液调节pH值至8.20))-乙腈(98:2)，流动相B为乙腈，柱温为30℃，检测波长为210nm，流速1mL/min，采用梯度洗脱，其运行的比例变化过程见表1。

表1有关物质梯度洗脱程序

精密量取上述各溶液50μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见表2，系统适用性色谱图见附图1。

表2有关物质方法学-专属性-混合对照结果

结论：空白稀释液、空白辅料均不干扰供试品溶液中有关物质的检测，混合对照溶液中各峰与其相邻色谱峰之间的分离度均符合规定，表明本发明提供的高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊有关物质的方法的专属性良好。

实验例2线性与范围试验

各杂质溶液贮备液：精密称取杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S各10mg，分别置不同5mL量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀，分别作为杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S溶液贮备液。

阿奇霉素对照品贮备液：精密称取阿奇霉素对照品10mg，置5mL量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。

线性溶液：精密量取阿奇霉素对照品贮备液0.5mL，杂质B溶液贮备液0.5mL，杂质G溶液贮备液0.1mL，杂质A、C、E、F、H、I、J、L、M、N、Q、R、S溶液贮备液各0.25mL，置同一5mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为线性200％溶液。分别精密量取上述线性200％溶液10μl、25μl、50μl、100μl、250μl、400μl、500μl、600μl、750μl置不同1mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，分别作为线性2％、线性5％、线性10％、线性20％、线性50％、线性80％、线性100％、线性120％、线性150％溶液。

精密量取上述各溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3。

表3有关物质方法学-线性结果

结论：阿奇霉素在0.0013mg/mL～0.2048mg/mL浓度范围内(相当于自身对照浓度的1％～200％)，线性方程为y＝2866.2725x-0.8105，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质A在0.0049mg/mL～0.0985mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的10％～200％)，线性方程为y＝961.4863x-0.6439，相关系数r为0.9995＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质B在0.0012mg/mL～0.1837mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的1％～200％)，线性方程为y＝2828.4315x+0.0834，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质C在0.0005mg/mL～0.1006mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的1％～200％)，线性方程为y＝6856.2332x+1.2270，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好；

杂质E在0.0050mg/mL～0.1006mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的10％～200％)，线性方程为y＝1063.4699x-1.0676，相关系数r为0.9992＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质F在0.0005mg/mL～0.1005mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的1％～200％)，线性方程为y＝14782.4440x+1.6894，相关系数r为0.9999＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质G在0.0001mg/mL～0.0402mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的0.3％～200％)，线性方程为y＝21606.4934x+1.5528，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质H在0.0001mg/mL～0.1011mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的0.1％～200％)，线性方程为y＝38789.3767x+7.9282，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质I在0.0051mg/mL～0.1011mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的10％～200％)，线性方程为y＝1020.5684x+0.5862，相关系数r为0.9991＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质J在0.0016mg/mL～0.0947mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的3％～200％)，线性方程为y＝3262.6888x-0.4065，相关系数r为0.9997＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质L在0.0044mg/mL～0.0994mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的9％～200％)，线性方程为y＝961.9883x-0.0340，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质M在0.0025mg/mL～0.1008mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的5％～200％)，线性方程为y＝3416.9108x+2.8209，相关系数r为0.9991＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质N在0.0009mg/mL～0.0986mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的1.8％～200％)，线性方程为y＝4737.9251x-2.7583，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质Q在0.0006mg/mL～0.0984mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的1％～200％)，线性方程为y＝57863969x+1.2704，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质R在0.0013mg/mL～0.0975mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的3％～200％)，线性方程为y＝3865.1320x+1.2192，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

杂质S在0.0008mg/mL～0.0986mg/mL浓度范围内(相当于限度浓度的1.7％～200％)，线性方程为y＝5762.9999x+0.2316，相关系数r为0.9998＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。

实验例3回收率试验

供试品溶液：精密称取阿奇霉素胶囊内容物适量(相当于处方比例阿奇霉素250mg)，置25mL量瓶中，加稀释液适量，超声10分钟，使阿奇霉素溶解，放冷，加稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。(临用新制)

各杂质溶液贮备液：精密称取杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S各10mg，分别至不同5mL量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀，分别作为杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S溶液贮备液。

回收率对照品溶液贮备液：分别精密量取上述杂质B溶液贮备液0.5mL，杂质G溶液贮备液0.1mL，杂质A、C、E、F、H、I、J、L、M、N、Q、R、S溶液贮备液各0.25mL，置同一5mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。

回收率对照品溶液：精密量取上述回收率对照品溶液贮备液0.25mL，稀释液0.25mL，置同一进样小瓶中，摇匀，即得。

回收率供试品溶液：精密称取阿奇霉素胶囊内容物适量(相当于处方比例阿奇霉素10mg)，置1mL量瓶中，平行称取9份，平均分为3组，分别精密加入上述回收率对照品溶液贮备液0.25mL、0.5mL、0.75mL，分别加稀释液适量，超声使阿奇霉素溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为50％、100％、150％回收率供试品溶液。(临用新制)

精密量取上述溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，结果见表4。

表4有关物质方法学-回收率结果

结论：50％、100％、150％浓度下，杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S组内平均回收率及组间平均回收率均在90％～108％之间，表明本方法用于检测上述杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S，准确度良好。

实验例4耐用性试验

稀释液：水相(磷酸二氢铵溶液(pH10.0))-甲醇-乙腈(7:7:6)。

空白辅料溶液：精密称取阿奇霉素胶囊空白辅料适量(相当于处方比例阿奇霉素250mg的空白辅料量)，置25mL量瓶中，加稀释液适量，超声10分钟，放冷，加稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

混合对照溶液：取杂质A、B、C、E、F、G、H、I、J、L、M、N、Q、R、S及阿奇霉素适量，加稀释液溶解并稀释制成每1mL中含阿奇霉素10mg，含各杂质0.05mg的溶液，作为混合对照溶液。

系统适用性试验溶液：精密称取阿奇霉素系统适用性对照品5mg，置进样小瓶中，加稀释液450μl，超声使溶解，加杂质A贮备液(1mg/mL)及杂质S贮备液(1mg/mL)各25μl，摇匀，即得。

供试品溶液：精密称取阿奇霉素胶囊内容物适量(相当于处方比例阿奇霉素250mg)，置25mL量瓶中，加稀释液适量，超声10分钟，使阿奇霉素溶解，放冷，加稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，平行配制6份。(临用新制)

对照溶液：精密量取上述供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。

灵敏度溶液：精密量取对照1溶液1mL，置20mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取上述溶液50μl，于各色谱条件下注入液相色谱仪，结果见表5。

表5有关物质方法学-耐用性-混合对照结果

表6有关物质方法学-耐用性-系统适用性试验结果

表7有关物质方法学-耐用性-灵敏度溶液结果

表8有关物质方法学-耐用性-杂质检出情况

表9有关物质方法学-耐用性-结果汇总

结论：当稀释液水相pH变化±0.1、流动相A水相比例变化±1％、柱温变化-10℃～+5℃以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱的条件下，与正常条件相比，混合对照、系统适用性、灵敏度及杂质检出量均无明显差异；当柱温变化-10℃、流动相中盐相pH值变化±0.1时，与正常条件相比，系统适用性、灵敏度及杂质检出量均无明显差异，但混合对照溶液中、均有1个杂质与其他杂质重合，杂质分离情况变差。上述结果表明，色谱条件有微小变动(稀释液水相pH变化±0.1、流动相A水相比例变化±1％、柱温变化+5℃以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱)时，本色谱条件耐用性良好；本色谱条件对流动相pH值耐用性较差，试验过程中应对其严控。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种高效液相色谱法测定阿奇霉素胶囊中有关物质的方法，其特征在于，所述方法采用以下条件进行测定：

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液：乙腈＝97-91：1-3，其中，0.05mol/L磷酸氢二钾溶液用20％磷酸溶液调节pH值至8.2；

流动相B：乙腈；

柱温：20-35℃；

检测波长：205nm-215nm；

流速：0.8-1.1mL/min；

采用梯度洗脱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液：乙腈＝98：2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度洗脱的程序为：

。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱柱为，规格为：WatersShield RP18，4.6mm×250mm，5μm。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流速为1mL/min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括供试品溶液和混合对照溶液的制备。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a所述供试品溶液的制备方法为：称取阿奇霉素胶囊内容物，用稀释液制成每1mL稀释液中含阿奇霉素10mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤b所述对照品溶液的制备方法为：取阿奇霉素和有关物质对照品，用稀释液制成每1mL稀释液中含阿奇霉素10mg、含有关物质0.05mg的溶液，滤过，取续滤液作为混合对照溶液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述稀释液为体积比为7：7：6的磷酸二氢铵溶液、甲醇和乙腈的混合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磷酸二氢铵溶液的配置方法为：称取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000mL，用氨试液调节pH值至10.0±0.1。