CN110118836A - 高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法 - Google Patents

高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用体积比计为69‑71∶29‑31的水和乙腈，调节所述水的pH值至2.5±0.1；检测波长为245nm～255nm和/或225nm～235nm。本发明提供的高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法，能够更好的控制利伐沙班的质量。

Description

高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法
技术领域
本发明涉及物质检测技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法。
背景技术
利伐沙班是一种高选择性，直接抑制因子Xa的口服药物。通过抑制因子Xa可以中断凝血瀑布的内源性和外源性途径，抑制凝血酶的产生和血栓形成。利伐沙班并不抑制凝血酶(活化因子Ⅱ)，也并未证明其对于血小板有影响。利伐沙班由德国拜耳公司与美国强生公司联合开发，于2008年9月首先在加拿大上市，同年在欧洲上市，2011年7月在美国上市。
目前，暂无法定的利伐沙班遗传毒性检测方法，同时，现有检测方法不能同时有效检测特定多个遗传毒性杂质，且存在检测方法复杂(LC-MS)、成本较高等技术缺陷。因此需要提供一种高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法。
本发明目的在于提供一种高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用体积比计为69-71∶29-31的水和乙腈，调节所述水的pH值至2.5±0.1；检测波长为245nm～255nm和/或225nm～235nm。本发明所提供的高效液相色谱法能够有效测定利伐沙班中遗传毒性杂质，能够更好的控制利伐沙班的质量。本发明中，利伐沙班中的遗传毒性杂质为1-羟基苯并三唑(式1)、SM2(式2)、SM3(式3)、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸(式4)；利伐沙班的结构图如式5所示。根据本发明采用改进的测定条件，在测定利伐沙班中的上述遗传毒性杂质方面取得了很好的效果，不仅提高了方法的检测灵敏度，而且同时有效检测特定的多个遗传毒性杂质。
根据本发明的一些优选实施方式，流动相采用体积比计为70∶30的水和乙腈流动相，和/或，用三氟乙酸调节所述水的pH值至2.5。
根据本发明的一些优选实施方式，所述色谱柱为Waters T3C18；优选的，所述色谱柱的规格为：内径4.6，长度250mm，填料粒径5μm。
根据本发明的一些优选实施方式，供试品溶液的制备方法为：取利伐沙班10mg，置量瓶中，加水适量，超声10min，用水稀释至10ml刻度，搅拌，过滤，取续滤液作为所述供试品溶液。
根据本发明的一些优选实施方式，对照品溶液的制备方法为：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3及4,5-二氯-噻吩-2-甲酸对照品各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含0.05-0.25μg优选0.15μg的对照品溶液。
根据本发明的一些优选实施方式，所述遗传毒性杂质包括1-羟基苯并三唑、SM2、SM3和4,5-二氯-噻吩-2-甲酸；和/或，所述检测波长为250nm和230nm；优选的，所述250nm用于检测1-羟基苯并三唑、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸，所述230nm用于检测SM2。
根据本发明的一些优选实施方式，流速为0.8-1.2ml/min，优选为1ml/min；和/或，柱温为25-35℃，优选为30℃；和/或，进样体积为30-50μl，优选为40μl。
根据本发明的一些优选实施方式，洗脱方式采用等度洗脱。
根据本发明的一些优选实施方式，还包括对系统适用性溶液进行测定，所述系统适用性溶液的制备方法为：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸及利伐沙班各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含0.1-1.5μg优选1μg的系统适用性试验溶液。
根据本发明的一些优选实施方式，包括以下步骤：1)制备所述供试品溶液、所述对照品溶液和所述系统适用性溶液：所述供试品溶液的制备方法：取利伐沙班10mg，置量瓶中，加水适量，超声10min，用水稀释至10ml刻度，搅拌，过滤，取续滤液作为所述供试品溶液；所述对照品溶液的制备方法：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3及4,5-二氯-噻吩-2-甲酸对照品各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含0.15μg的对照品溶液；所述系统适用性溶液的制备方法：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸及利伐沙班各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含1μg的系统适用性试验溶液；2)采用高效液相色谱对所述供试品溶液、所述对照品溶液和所述系统适用性溶液进行测定；测定条件包含：所述色谱柱采用Waters T3C18，所述色谱柱的规格为：内径4.6，长度250mm，填料粒径5μm；所述流动相采用体积比计为70∶30的水和乙腈，所述水用三氟乙酸调节pH值至2.5；所述柱温为30℃，所述进样体积为40μl；所述流速为1ml/min；采用等度洗脱；检测波长为250nm、230nm，检测波长250nm用于检测1-羟基苯并三唑、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸，检测波长230nm用于检测SM2。
根据本发明，采用改进的测定条件，增大供试品浓度及进样体积、改变流动相组成及比例、降低柱温以及增加一组检测波长等，在测定利伐沙班中的上述遗传毒性杂质方面取得了很好的效果，提高了方法的检测灵敏度。
本发明的有益效果至少在于：本发明提供的高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法，能够更好的控制利伐沙班的质量，并且大大降低了研发成本。
附图说明
图1为本发明实施例1所提供的利伐沙班系统适用性色谱图。
图2为本发明对比例1所提供的利伐沙班系统适用性色谱图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入的各原料除特别说明外，均为市售常规原料。
实验例1系统适用性试验：
各杂质定位溶液的配制：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3及4,5-二氯-噻吩-2-甲酸对照品各适量，分别加水溶解并稀释制成每1mL中各含上述杂质0.1mg的溶液，作为杂质定位溶液。
利伐沙班定位溶液的配制：称取利伐沙班适量，加乙腈-水(3∶2)溶解并稀释制成每1mL中含0.1mg的溶液，作为利伐沙班定位溶液。
供试品溶液的配制：取利伐沙班约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，超声10min，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液：精密量取上述杂质定位溶液各1mL，置同一100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
系统适用性溶液：精密量取上述杂质定位溶液和利伐沙班定位溶液各1mL，置同一100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液。
精密量取上述定位溶液及系统适用性溶液各40μl，注入Agilent1206-Ⅱ型高效液相色谱仪(UV检测器)进行测定。
本实验例所采用的测定条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters T3C18 4.6×250mm，5μm)，以水(用三氟乙酸调节pH值至2.5)-乙腈(70∶30)为流动相，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml，检测波长为250nm(用于检测1-羟基苯并三唑、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸)与230nm(用于检测SM2)，采用等度洗脱。采用上述测定条件进行测定，记录色谱图。测定分析结果见表1～表3，本实验例提供的系统适用性色谱图见图1。
表1专属性-定位试验结果
表2专属性-系统适用性试验结果(250nm)
表3专属性-系统适用性试验结果(230nm)
根据本实施例的系统适用性试验可得以下结论：溶剂不干扰供试品溶液中1-羟基苯并三唑、SM2溶液、SM3溶液、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸溶液有关物质的检测，各杂质之间均不相互干扰。
对比例1
测定条件与实验例1相同，不同之处在于，测定条件中色谱柱选用purospher starRP-18 endcapped 55mm×4.0mm 3μm；流动相：以0.01mol/L磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表4进行梯度洗脱；检测波长为250nm；柱温为45℃、进样体积为5μl。
表4对比例1的梯度洗脱条件
SM1溶液：称取SM1约1mg，置进样小瓶中，加乙腈1ml超声使溶解，摇匀，即得。
1-羟基苯并三唑溶液：称取1-羟基苯并三唑约1mg，置进样小瓶中，加乙腈1ml超声使溶解，摇匀，即得。
SM2溶液：称取SM2约1mg，置进样小瓶中，加乙腈1ml超声使溶解，摇匀，即得。
SM3溶液：称取SM3约1mg，置进样小瓶中，加乙腈1ml超声使溶解，摇匀，即得。
4,5-二氯-噻吩-2-甲酸溶液：称取4,5-二氯-噻吩-2-甲酸约1mg，置进样小瓶中，加乙腈1ml超声使溶解，摇匀，即得。
供试品溶液：精密称取利伐沙班约10mg，置10ml量瓶中，加溶剂[乙腈-0.01mol/L磷酸溶液(3:2)]适量，超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
系统适用性贮备液：精密称取利伐沙班、利伐沙班中间体I、中间体Ⅱ、脱氯化合物、4,5-二氯化合物各适量，加溶剂[乙腈-0.01mol/L的磷酸溶液(3:2)]配成每ml含0.2mg的混合溶液。
混合对照溶液：量取SM1溶液、1-羟基苯并三唑溶液、SM2溶液、SM3溶液、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸溶液各100μl，系统适用性贮备液500μl，置同一进样小瓶中，摇匀，即得。
分别精密量取上述溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见下图2及下表5。图2中，由下到上依次为空白溶剂、混合对照；峰1、峰4、峰5、峰7、峰10为利伐沙班原料中控制的其他杂质；峰2为1-羟基苯并三唑、峰3为SM2、峰6为SM3、峰8为利伐沙班、峰9为4,5-二氯-噻吩-2-甲酸。
表5对比例1试验测定结果
峰号 峰归属 保留时间/分钟 理论板数 拖尾因子 分离度
1 / 0.548 1043 1.11 /
2 1-羟基苯并三唑 1.602 483 0.76 5.89
3 SM2 6.161 18941 1.20 19.33
4 / 6.489 31833 1.12 2.05
5 / 7.096 41464 1.15 4.26
6 SM3 8.154 27761 1.16 6.29
7 / 8.593 53227 1.20 2.55
8 利伐沙班 9.471 62259 1.18 5.85
9 4,5-二氯-噻吩-2-甲酸 11.291 47431 1.15 10.13
10 / 11.871 87238 1.17 3.15
结果显示，对比例1中1-羟基苯并三唑峰形较差，理论板数较低且出峰较早，SM2响应较低，表明对比例1方法不适用于1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸的检测。
实验例2线性与范围试验
杂质(0.1mg/ml)溶液的配制：取方法学研究项下各杂质(1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸)各适量，分别配制成0.1mg/ml的溶液，摇匀，备用。
线性(5μg/ml)溶液的配制：精密量取上述杂质(0.1mg/ml)液各5ml，置同一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
200％线性溶液的配制：精密量取线性(5μg/ml)溶液3ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
120％线性溶液的配制：精密量取200％线性溶液6ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
100％线性溶液的配制：精密量取200％线性溶液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
80％线性溶液的配制：精密量取200％线性溶液4ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
50％线性溶液的配制：精密量取200％线性溶液2.5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取上述各溶液40μl，注入液相色谱仪，采用的测定条件和测定方法同实施例1，记录色谱图。结果见表6。
表6线性与范围试验结果
根据本实验例可得以下结论：1-羟基苯并三唑在0.0751μg/ml～0.3006μg/ml、SM2在0.0750μg/ml～0.3001μg/ml、SM3在0.0761μg/ml～0.3044μg/ml、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸在0.0748μg/ml～0.2994μg/ml浓度范围内(约相当于限度浓度的50％～200％)，线性方程分别为y＝22.7535x-0.1061、y＝163.0172x+2.4631、y＝106.1843x+0.4091、y＝89.2011x+0.3183，相关系数r均大于为0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。
实验例3回收率试验
对照品贮备液的配制：量取1-羟基苯并三唑(0.1mg/ml)液、SM2(0.1mg/ml)溶液、SM3(0.1mg/ml)溶液、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸溶液(0.1mg/ml)液各1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液的配制：精密量取对照品贮备溶液1.5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
80％、100％、120％对照品溶液：分别精密量取对照品贮备液6ml、7.5ml、9ml，分置3个50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别作为80％、100％、120％的对照品溶液。
供试品溶液的配制：称取利伐沙班约10mg，平行称取9份，精密称定，分置10ml量瓶中，每3份一组，分别加上述对照品溶液80％、100％、120％各适量，超声10min，放冷至室温，再用各对照品溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，分别作为杂质回收率80％、100％、120％供试品溶液。
精密量取上述溶液各40μl，分别注入液相色谱仪，采用的测定条件同实验例1，结果见表7。
表7回收率结果
根据本实验例可得以下结论：上述试验结果数据表明，各杂质组间回收率均在85％～110％间，组内及组间RSD值均小于6％，表明本方法准确度良好。
实验例4耐用性试验
系统适用性试验溶液：SM1、1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸及利伐沙班各适量，加乙腈溶解并用水稀释制成每1ml中各约含1μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。
供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，超声10min，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸对照品各适量，加乙腈溶解并用水稀释制成每1ml中各约含0.15μg的溶液，作为对照品溶液。
测定方法：精密量取上述溶液各40μl，采用的测定方法同实验例1，不同之处在于，分别在检测波长变化±5nm、流动相pH值变化±0.1、流速变化±20％、柱温±5℃、流动相中有机性比例变化±1％以及更换相同品牌、不同批号色谱柱的条件下，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表8～表10。
表8耐用性-系统适用性试验结果1
表9耐用性-系统适用性试验结果2
表10耐用性-杂质检出情况
根据本实验例可得以下结论：各条件下，系统适用性试验溶液中，空白溶剂均不干扰检测，SM3与利伐沙班之间的分离度均应大于1.5；供试品溶液中均未检出1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸，表明本色谱条件有微小变动(检测波长变化±5nm、流动相pH值变化±0.1、流速变化±20％、流动相中有机相比例变化±1％、柱温变化±5℃以及更换相同品牌、不同批号色谱柱)时，本方法耐用性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用体积比计为69-71∶29-31的水和乙腈，调节所述水的pH值至2.5±0.1；检测波长为245nm～255nm和/或225nm～235nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相采用体积比计为70∶30的水和乙腈流动相，和/或，用三氟乙酸调节所述水的pH值至2.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters T3 C18；优选的，所述色谱柱的规格为：内径4.6，长度250mm，填料粒径5μm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：取利伐沙班10mg，置量瓶中，加水适量，超声10min，用水稀释至10ml刻度，搅拌，过滤，取续滤液作为所述供试品溶液。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，对照品溶液的制备方法为：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3及4,5-二氯-噻吩-2-甲酸对照品各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含0.05-0.25μg优选0.15μg的对照品溶液。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述遗传毒性杂质包括1-羟基苯并三唑、SM2、SM3和4,5-二氯-噻吩-2-甲酸；和/或，所述检测波长为250nm和230nm；优选的，所述250nm用于检测1-羟基苯并三唑、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸，所述230nm用于检测SM2。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，流速为0.8-1.2ml/min，优选为1ml/min；和/或，柱温为25-35℃，优选为30℃；和/或，进样体积为30-50μl，优选为40μl。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，洗脱方式采用等度洗脱。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，还包括对系统适用性溶液进行测定，所述系统适用性溶液的制备方法为：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸及利伐沙班各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含0.1-1.5μg优选1μg的系统适用性试验溶液。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备所述供试品溶液、所述对照品溶液和所述系统适用性溶液：所述供试品溶液的制备方法：取利伐沙班10mg，置量瓶中，加水适量，超声10min，用水稀释至10ml刻度，搅拌，过滤，取续滤液作为所述供试品溶液；所述对照品溶液的制备方法：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3及4,5-二氯-噻吩-2-甲酸对照品各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含0.15μg的对照品溶液；所述系统适用性溶液的制备方法：取1-羟基苯并三唑、SM2、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸及利伐沙班各适量，加乙腈溶解并用水稀释，制成每1ml中各含1μg的系统适用性试验溶液；
2)采用高效液相色谱对所述供试品溶液、所述对照品溶液和所述系统适用性溶液进行测定；测定条件包含：所述色谱柱采用Waters T3 C18，所述色谱柱的规格为：内径4.6，长度250mm，填料粒径5μm；所述流动相采用体积比计为70∶30的水和乙腈，所述水用三氟乙酸调节pH值至2.5；所述柱温为30℃，所述进样体积为40μl；所述流速为1ml/min；采用等度洗脱；检测波长为250nm、230nm，检测波长250nm用于检测1-羟基苯并三唑、SM3、4,5-二氯-噻吩-2-甲酸，检测波长230nm用于检测SM2。
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