CN115326999B - 一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于色谱分析技术领域，尤其涉及一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法。本申请提供了一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法，包括：采用高效液相色谱对奥司他韦环氧中间体及其异构体进行检测；高效液相色谱法检测过程中的流动相由正己烷和乙醇组成，正己烷含有乙醇胺；高效液相色谱检测过程中采用等度洗脱的方式使流动相通过色谱柱；高效液相色谱检测过程中的色谱柱填充剂为硅胶表面共价键合纤维素‑三（3,5‑二氯苯基氨基甲酸酯）。本申请的方法为高效液相色谱法分离与检测奥司他韦环氧中间体及其异构体杂质的方法，检测方法专属性良好、灵敏度高，结果准确可靠，可用于奥司他韦环氧中间体及其异构体杂质的质量控制。

Description

一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法
技术领域
本申请属于色谱分析技术领域，尤其涉及一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法。
背景技术
磷酸奥司他韦是一种高效、高选择性神经氨酸酶抑制剂，对常见的甲型、乙型流感病毒及其变异株有强效抗病毒能力；奥司他韦是一种非常有效的流感治疗药物，且可大大减少并发症（主要是气管与支气管、肺炎、咽炎等）的发生和抗生素的使用，是目前最常用的治疗流感药物之一。
奥司他韦环氧中间体为合成奥司他韦磷酸盐的中间体，奥司他韦环氧中间体异构体在后续的合成反应中也同步参与反应生成奥司他韦磷酸盐异构体，故在奥司他韦环氧中间体中控制奥司他韦环氧中间体异构体对于合成奥司他韦磷酸盐的生产及开发具有重大意义。而目前其环氧中间体及其异构体的检测方法未见有报道。
发明内容
鉴于此，本申请在于提供一种高效液相色谱法分离与检测奥司他韦环氧中间体及其3个异构体杂质的方法，检测方法专属性良好、灵敏度高，结果准确可靠，可用于奥司他韦环氧中间体中3个异构体杂质的质量控制。
本申请提供了一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法，包括：
采用高效液相色谱对奥司他韦环氧中间体及其异构体进行检测；
高效液相色谱法检测过程中的流动相由正己烷和乙醇组成，所述正己烷含有乙醇胺；
所述高效液相色谱检测过程中采用等度洗脱的方式使流动相通过色谱柱；所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱填充剂为硅胶表面共价键合纤维素-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）；
对供试品采用所述稀释剂稀释后在进行高效液相色谱法可同时检测式1~式3的奥司他韦环氧中间体异构体以及奥司他韦环氧中间体；
所述奥司他韦环氧中间体具有式4的结构式；
Figure 425828DEST_PATH_IMAGE001
式1；
Figure 763268DEST_PATH_IMAGE002
式2；
Figure 469056DEST_PATH_IMAGE003
式3；
Figure 866540DEST_PATH_IMAGE004
式4。
具体的，奥司他韦环氧中间体异构体中，式1为杂质AS108，式2为杂质AS109，式3为杂质AS110。
具体的，所述色谱柱的粒径为3.0-5.0μm。
另一实施例中，所述正己烷中的乙醇胺体积分数为0.02%~0.4%；优选的，所述正己烷中的乙醇胺体积分数为0.1%。
另一实施例中，所述流动相中，所述正己烷与所述乙醇的体积比为75：25~95：5；优选的，所述流动相中，所述正己烷与所述乙醇的体积比为92：8。
另一实施例中，所述流动相等度洗脱所述供试品至主峰保留时间的2-5倍；优选的，洗脱所述供试品至主峰保留时间的3倍。
更优选的，以正己烷（含体积分数为0.1%的乙醇胺）-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92：8）为流动相等度洗脱样品至主峰保留时间的3倍。
更优选地，以正己烷（含体积分数为0.1%乙醇胺）-乙醇（正己烷与乙醇体积比为75：25~95：5）为流动相进行等度洗脱40min；更优选地，以正己烷（含体积分数为0.1%乙醇胺）-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92：8）为流动相进行等度洗脱40min。
另一实施例中，所述高效液相色谱检测过程中，所述供试品采用稀释剂稀释后再进行检测，所述稀释剂由正己烷和乙醇组成。
另一实施例中，所述稀释剂中，所述正己烷与所述乙醇的体积比为80：20~95：5；优选的，所述正己烷与所述乙醇的体积比为92：8。
另一实施例中，所述高效液相色谱检测过程中的流动相流速为0.5-1.5mL/min；所述色谱柱的柱温为25-35℃；
所述高效液相色谱采用的检测器为紫外检测器，所述高效液相色谱检测过程中的检测波长为205nm-220nm。
为了填补现有技术的空白，本申请提供了一种奥司他韦环氧中间体异构体的检测方法，包括：（1）选用硅胶表面共价键合纤维素-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）为填充剂的色谱柱；采用流动相正己烷（含乙醇胺）-乙醇等度洗脱；高效液相色谱法所采用的检测器为紫外检测器；（2）高效液相色谱检测过程中，供试品采用稀释剂稀释后进行检测，稀释剂选用正己烷和乙醇的混合溶液。该方法可分离与检测奥司他韦环氧中间体异构体，研究参照并符合《中国药典》2020版第四部附录高效液相色谱法的规定，可有效检出奥司他韦环氧中间体中3个异构体杂质，后对分析方法进行验证，该分析方法具有一定的耐用性、灵敏度高，专属性良好。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请对比例提供的条件1中混合加标溶液的高效液相色谱图；
图2为本申请对比例提供的条件2中混合加标溶液的高效液相色谱图；
图3为本申请对比例提供的条件3中混合加标溶液的高效液相色谱图；
图4为本申请实施例1提供的混合加标溶液的高效液相色谱图；
图5为本申请实施例1提供的系统适用性溶液的高效液相色谱图，其中图中标记为1-6.392为杂质AS110、2-8.439为杂质AS108、3-10.772为奥司他环氧中间体、4-18.639为杂质AS109；
图6为本申请实施例2提供的混合加标溶液的高效液相色谱图；
图7为本申请实施例2提供的系统适用性溶液的高效液相色谱图，其中图中标记为1-5.859为杂质AS110、2-7.386为杂质AS108、3-9.066为奥司他环氧中间体、4-15.039为杂质AS109；
图8为本申请实施例2提供的奥司他环氧中间体及各异构体杂质的LOD图，其中图中标记为1-5.994为杂质AS110、2-7.501为杂质AS108、3-9.461为奥司他环氧中间体、4-14.994为杂质AS109；
图9为本申请实施例2提供的奥司他环氧中间体及各异构体杂质的LOQ图，其中图中标记为1-5.987为杂质AS110、2-7.540为杂质AS108、3-9.474为奥司他环氧中间体、4-14.994为杂质AS109。
具体实施方式
本申请提供了一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法，可用于奥司他韦环氧中间体中3个异构体杂质的质量控制，填补目前无法检测奥司他韦环氧中间体及其3个异构体杂质的缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
以下实施例和对比例中，奥司他韦环氧中间体异构体分别为标记为杂质AS108（式1）、杂质AS109（式2）、杂质AS110（式3）。
实施例1
本申请实施例提供了奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测，具体方法包括：
（1）使用高效液相色谱仪检测奥司他韦环氧中间体及其异构体（杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110），具体条件为：紫外检测器波长为210nm。选用粒径为5μm的硅胶表面共价键合纤维素-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）为填充剂的色谱柱。流动相为正己烷（含体积分数为0.1%乙醇胺）-乙醇（正己烷与乙醇体积比为90:10），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，等度洗脱40min。
（2）样品的配制：
混合加标溶液：取奥司他韦环氧中间体对照品10mg于容量瓶中。另取奥司他韦环氧中间体有关物质杂质（AS101、AS102、AS103、AS104、AS105、AS106、AS107）及异构体杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110适量加入容量瓶中，加稀释剂（为正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为90:10））溶解并稀释至刻度，制成每1mL含奥司他韦环氧中间体对照品1mg、有关物质杂质（AS101、AS102、AS103、AS104、AS105、AS106、AS107）及异构体杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110各1μg的混合溶液。
系统适用性溶液：取奥司他韦环氧中间体对照品10mg于容量瓶中。另取杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110适量加入容量瓶中，加稀释剂（为正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为90:10））溶解并稀释至刻度，制成每1mL含奥司他韦环氧中间体对照品1mg、杂质AS108对照品1μg、杂质AS109对照品1μg、杂质AS110对照品1μg的溶液。
取混合加标溶液和系统适用性溶液按照上述高效液相色谱法进行测试，进样量为20μL。结果如图4和图5，图4为混合加标溶液的高效液相色谱图；图5为系统适用性溶液的高效液相色谱图。结果显示混合加标溶液中异构体杂质AS108、AS109、AS110与相邻杂质及主峰的分离度均大于1.5，3个异构体杂质与相邻色谱峰的分离良好（如图4）。系统适用性溶液中异构体杂质AS109、AS110、AS108与相邻色谱峰的分离度均大于5.0（如图5）。可见，采用本申请特定的流动相可有效分离和检测奥司他韦环氧中间体及其异构体。
对比例
本申请对比例提供了使用不同流动相采用高效液相色谱检测对样品进行检测，具体方法包括：
（1）使用高效液相色谱仪检测奥司他韦环氧中间体及其异构体（杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110），具体条件为：表1的流动相和洗脱方式，紫外检测器波长为210nm。
（2）溶液的配制：
混合加标溶液：取奥司他韦环氧中间体对照品10mg于容量瓶中。另取奥司他韦环氧中间体有关物质杂质（AS101、AS102、AS103、AS104、AS105、AS106、AS107）及异构体杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110适量加入容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为90:10））溶解并稀释至刻度，制成每1mL含奥司他韦环氧中间体对照品1mg、有关物质杂质（AS101、AS102、AS103、AS104、AS105、AS106、AS107）及异构体杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110各1μg的混合溶液。
取混合加标溶液按照表1的流动相和洗脱方式使用高效液相色谱仪进行测试，进样量为20μL，实验结果如表1、图1、图2和图3所示，图1为条件1中混合加标溶液的高效液相色谱图；图2为条件2中混合加标溶液的高效液相色谱图；图3为条件3中混合加标溶液的高效液相色谱图。
表1
Figure 657778DEST_PATH_IMAGE005
实施例2
本申请实施例对高效液相色谱仪分离与检测奥司他韦环氧中间体异构体（杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110）的方法进行方法学验证，包括：
（1）采用高效液相色谱仪分离与检测奥司他韦环氧中间体异构体（杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110），紫外检测器波长为210nm，选用粒径为5μm的硅胶表面共价键合纤维素-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）为填充剂的色谱柱。流动相为正己烷（含体积分数为0.1%乙醇胺）-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8）。进样量为20μL，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测时长为40min。
（2）溶液的配制：
a、混合加标溶液的配制：
取奥司他韦环氧中间体对照品10mg于容量瓶中。另取奥司他韦环氧中间体有关物质杂质（AS101、AS102、AS103、AS104、AS105、AS106、AS107）及异构体杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110适量加入同一容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））溶解并稀释至刻度，制成每1mL含奥司他韦环氧中间体对照品1mg、有关物质杂质（AS101、AS102、AS103、AS104、AS105、AS106、AS107）及异构体杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110各1μg的混合溶液。
b、系统适用性溶液的配制：
取奥司他韦环氧中间体对照品、杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110适量加入容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））溶解并稀释至刻度，制成每1mL含奥司他韦环氧中间体对照品1mg、杂质AS108对照品1μg、杂质AS109对照品1μg、杂质AS110对照品1μg的混合溶液。
c、供试品溶液的配制：
取供试品约10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加入稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））溶解并稀释至刻度，摇匀。
d、对照溶液的配制：
精密量取供试品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加入稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））溶解并稀释至刻度，摇匀。
e、各杂质储备液的配制：
分别精密称量杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110、奥司他韦环氧中间体对照品10mg，并分别置于10ml量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））溶解中并稀释至刻度，摇匀，分别得到杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110、奥司他韦环氧中间体储备溶液。
f、各杂质LOQ溶液配制：
精密量取杂质AS108储备液1mL，置于100mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液2mL，置于10mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀得到杂质AS108的LOQ溶液；
精密量取杂质AS109储备液1mL，置于100mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液2.5mL，置于10mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀得到杂质AS109的LOQ溶液；
精密量取杂质AS110储备液1mL，置于100mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液2.5mL，置于10mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀得到杂质AS110的LOQ溶液；
精密量取奥司他韦环氧中间体储备液1mL，置于100mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液2.5mL，置于10ml容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀得到奥司他韦环氧中间体的LOQ溶液；
g、各杂质LOD溶液配制：
分别精密量取杂质AS108的LOQ溶液、杂质AS109的LOQ溶液、杂质AS110的LOQ溶液、奥司他韦环氧中间体的LOQ溶液各5mL，置于10mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀得到杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110和奥司他韦环氧中间体的LOD混合溶液；
h、线性溶液的配制：
线性储备混合液：取奥司他韦环氧中间体储备液、杂质AS108储备液、杂质AS109储备液、杂质AS110储备液各1mL，置100mL量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀即得；
线性溶液1：奥司他韦环氧中间体及3个异构体杂质的LOQ溶液；
线性溶液2：精密量取线性储备混合溶液0.6mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀即得；
线性溶液3：精密量取线性储备混合溶液0.8mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀即得；
线性溶液4：精密量取线性储备混合溶液1.0mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀即得；
线性溶液5：精密量取线性储备混合溶液1.2mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀即得；
线性溶液6：精密量取线性储备混合溶液1.5mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀即得。
i、各杂质定位溶液的配制：
分别精密称取杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110、奥司他韦环氧中间体对照品10mg，分别置于100mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀得到各杂质的储备溶液，再分别取各储备溶液1mL，分别置于100mL容量瓶中，加稀释剂（正己烷-乙醇（正己烷与乙醇体积比为92:8））稀释至刻度，摇匀得到各杂质的定位溶液。
取混合加标溶液和系统适用性溶液按照上述高效液相色谱法进行测试，进样量为20μL。结果如图6和图7，图6为混合加标溶液的高效液相色谱图；图7为系统适用性溶液的高效液相色谱图。结果显示混合加标溶液中异构体杂质AS108、AS109、AS110与相邻杂质及主峰的分离度均大于1.5，3个异构体杂质与相邻色谱峰的分离良好（如图6）。系统适用性溶液中异构体杂质AS109、AS110、AS108与相邻色谱峰的分离度均大于7.0（如图7）。可见，采用本申请特定的色谱参数可有效分离和检测奥司他韦环氧中间体及其异构体。
取上述配制各杂质LOD溶液和各杂质LOQ溶液按照上述高效液相色谱法进行测试，进样量为20μL。结果如图8和图9，图8为奥司他环氧中间体及各异构体杂质的LOD图；图9为奥司他环氧中间体及各异构体杂质的LOQ图。结果显示各杂质LOD溶液中异构体杂质AS108、AS109、AS110的检测限均满足检测，各个异构体杂质和奥司他韦环氧中间体的信噪比（S/N）均大于等于3（如图8）。各杂质LOQ溶液中异构体杂质AS108、AS109、AS110、奥司他韦环氧中间体的定量限均满足检测需求，信噪比均大于等于10，连续进样6针，各异构体杂质和奥司他韦环氧中间体的峰面积RSD均小于等于10%（如图9）。可见，采用本申请特定的色谱参数可有效分离和检测奥司他韦环氧中间体及其异构体。
按上述的色谱参数对建立的分离与检测奥司他韦环氧中间体异构体（杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110）的高效液相色谱分析方法进行方法学验证。验证项目包括定量限及检测限、线性、专属性、精密度（包括重复性及中间精密度）、溶液稳定性和耐用性。
（1）方法学验证结果。
通过以上方法进行方法学验证，其验证结果如下所示：
1、专属性：
Figure 736593DEST_PATH_IMAGE006
2、精密度：
①重复性：6份供试品加标溶液中各杂质峰数一致，杂质AS108、杂质AS109和杂质AS110含量的RSD（%）分别为6.29%、8.05%和3.13%。
②中间精密度：6份供试品加标溶液中各杂质峰数一致，杂质AS108、杂质AS109和杂质AS110含量的RSD（%）分别为6.68%、5.53%和3.41%；12分精密度溶液中各杂质蜂数一致，杂质AS108、杂质AS109和杂质AS110含量的RSD（%）分别为6.19%、8.33%和3.33%。
3、定量限及检测限：
杂质AS108的定量限为相当于供试品浓度的0.020%，检测限为相当于供试品浓度0.01%；
杂质AS109的定量限为相当于供试品浓度的0.025%，检测限为相当于供试品浓度0.01%；
杂质AS110的定量限为相当于供试品浓度的0.025%，检测限为相当于供试品浓度0.01%；
奥司他韦环氧中间体的定量限相当低于供试品浓度的0.020%，检测限为相对于供试品浓度的0.01%。
4、线性：
①杂质AS108线性溶液结果线性方程为y=42.976x+0.9877，r值为0.9977，截距与Y轴100%响应值绝对值百分比为2.49%；
②杂质AS109线性溶液结果线性方程为y=50.708x-1.8681，r值为0.9973，截距与Y轴100%响应值绝对值百分比为3.24%；
③杂质AS110线性溶液结果线性方程为y=43.647x+0.4533，r值为0.9980，截距与Y轴100%响应值绝对值百分比为1.08%；
④奥司他韦环氧中间体线性溶液的线性方程为y = 47.202x + 1.6445，r值为0.9961，截距与Y轴100%响应值绝对值百分比为2.89%。
5、溶液稳定性：
在25℃样品盘中放置16小时，被测试的供试品加标溶液和0小时相比，各杂质峰个数一致，杂质AS108的变化率在1.87%~8.57%之间，杂质AS109的变化率在0.12%~8.18%之间，杂质AS110的变化率在1.78%~8.57%之间，各杂质变化率均低于10%。因此本品样品溶液保存在25℃中放置16小时是稳定的。
6、耐用性：
在色谱条件微小变化（不同柱温±5℃；不同流速±0.2mL/min；初始流动相比例±2%）时，同一条件不同参数下系统适用性溶液中各异构体杂质与相邻色谱峰之间的分离度最小值为4.7，大于1.5，说明本方法耐用性良好。
从上述结果可知，本申请通过采用高效液相色谱法检测检测异构体杂质（杂质AS108、杂质AS109、杂质AS110），以达到奥司他韦环氧中间体异构体控制的目的，对方法的专属性、检测限、定量限、线性、重复性、中间精密度、溶液稳定性、耐用性均能满足实验要求，符合规定。由此表明本方法能适用于奥司他韦环氧中间体异构体的检测。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (8)

1.一种奥司他韦环氧中间体及其异构体的检测方法，其特征在于，包括：
采用高效液相色谱对奥司他韦环氧中间体及其异构体进行检测；
高效液相色谱法检测过程中的流动相由正己烷和乙醇组成，所述正己烷含有乙醇胺；所述正己烷中的乙醇胺体积分数为0.02%~0.4%；所述流动相中，所述正己烷与所述乙醇的体积比为75：25~95：5；
所述高效液相色谱检测过程中采用等度洗脱的方式使流动相通过色谱柱；所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱填充剂为硅胶表面共价键合纤维素-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）；
所述高效液相色谱采用的检测器为紫外检测器，所述高效液相色谱检测过程中的检测波长为205nm-220nm；
对供试品采用稀释剂稀释后在进行高效液相色谱法可同时检测式1~式3的奥司他韦环氧中间体异构体以及奥司他韦环氧中间体；
所述奥司他韦环氧中间体具有式4的结构式；
Figure 134838DEST_PATH_IMAGE001
式1；
Figure 51979DEST_PATH_IMAGE002
式2；
Figure 769399DEST_PATH_IMAGE003
式3；
Figure 102291DEST_PATH_IMAGE004
式4。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述正己烷中的乙醇胺体积分数为0.1%。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相中，所述正己烷与所述乙醇的体积比为92：8。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相等度洗脱所述供试品至主峰保留时间的2-5倍。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测过程中，所述供试品采用稀释剂稀释后再进行检测，所述稀释剂由正己烷和乙醇组成。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述稀释剂中，所述正己烷与所述乙醇的体积比为80：20~95：5。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述稀释剂中，所述正己烷与所述乙醇的体积比为92：8。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测过程中的流动相流速为0.5-1.5mL/min；所述色谱柱的柱温为25-35℃。
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