CN105092751A - 分离和测定苯磺贝他斯汀光学异构体杂质的方法 - Google Patents

Abstract

一种拆分苯磺贝他斯汀光学异构体并定量测定R-异构体杂质的方法，采用高效液相色谱法，流动相中含有正己烷和乙醇，其特征在于采用正相液相色谱法；使用的色谱柱中所用的填料是表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶；所述流动相中还含有碱性添加剂。本方法与现有技术方法相比，流动相配制简单，两异构体的分离度均在4.5～5.5范围内。尤其是，本方法的色谱柱耐用性较好，使用一年后仍有较高的柱效，极大降低了分析测定成本。

Description

分离和测定苯磺贝他斯汀光学异构体杂质的方法

技术领域：

本发明涉及一种分离和测定药物的光学异构体杂质的方法，具体涉及用高效液相色谱法分离苯磺贝他斯汀及其R-异构体并定量测定该R-异构体的方法。

背景技术：

苯磺贝他斯汀是非镇静类高选择性组胺H1受体拮抗剂类药物，具抗过敏、止痒效果。

苯磺贝他斯汀是S-构型的手性化合物，化学名(+)-(S)-4-[4-[(4-氯苯基)(2-吡啶)甲氧基]哌啶]丁酸苯磺酸盐，与其R-异构体在药理作用方面有较大差异，苯磺贝他斯汀较R-异构体更优越。

在制药过程中，往往将苯磺贝他斯汀的R-异构体作为杂质监控。因此，苯磺贝他斯汀(S-构型)与R-异构体的分离、以及对苯磺贝他斯汀的R-异构体的含量测定，对苯磺贝他斯汀质量的控制具有非常重要的意义。

现有技术都是用反相液相色谱法来拆分苯磺贝他斯汀的S-构型和R-构型，当使用正相色谱方法时，使用常用填料的色谱柱不能将苯磺贝他斯汀(S-构型)与R-异构体分离。如专利(CN1098262C)报道采用ULTRONES-OVM色谱柱反相液相色谱法来拆分，进口标准(JX20060221)采用ULTRONES-CD反相液相色谱法来拆分。

虽反相色谱所用试剂较便宜，但上述两种反相液相色谱拆分方法都存在明显缺点：

ULTRONES-CD柱对苯磺贝他斯汀两光学异构体的分离效果不理想，且使用一个月左右后，两异构体基本不能分离；

ULTRONES-OVM柱填料为卵蛋白键合硅胶，对苯磺贝他斯汀及其异构体能够有效分离，但使用一段时间后，峰型变宽，柱效明显下降，色谱柱耐用性差。

两种方法的拆分条件和结果如表1所示：

表1现有技术两种反相液相色谱方法比较

发明内容：

本发明的目的一是提供一种拆分苯磺贝他斯汀光学异构体的方法，不仅两光学异构体的分离效果好，而且色谱柱耐用性较好，使用一段时间后仍能保持较高柱效。

本发明另一目的是提供定量测定苯磺贝他斯汀中所含的R-异构体杂质的方法。

本发明提供了一种拆分苯磺贝他斯汀光学异构体并定量测定R-异构体杂质的方法，采用高效液相色谱法，流动相中含有正己烷和乙醇，其特征在于：

1)采用正相液相色谱法；

2)使用的色谱柱中所用的填料是表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶，如ChiralpakAD-H色谱柱；

3)所述流动相中还含有碱性添加剂；

所述碱性添加剂为含氮原子的碱性有机溶剂，优选为乙醇胺、二乙胺、三乙胺中的一种或几种。

所述流动相中正己烷和乙醇的体积比为：正己烷:乙醇＝85～90:10～15。

所述碱性添加剂的比例(V/V)为0.05％～0.15％，优选浓度为0.05％～0.1％。

在本发明的一个实施例中，用ChiralpakAD-H色谱柱(4.6×250mm，5μm，填料为表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶)；以正己烷-乙醇-乙醇胺(87:13:0.1)为流动相；检测波长为260nm。分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品适量，加乙醇适量超声使溶解，用正己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体5μg的混合溶液，按上述色谱条件进样20μl，记录色谱图。出峰顺序依次为贝他斯汀、R-异构体，理论板数按贝他斯汀峰计算不低于2000，贝他斯汀和相邻异构体的分离度不低于2.0。

本发明的方法经线性关系、回收率试验、检测限等方法学验证，结果证明该测定方法准确可靠。方法学验证见实施例1。

用本发明的方法不仅可将苯磺贝他斯汀与其光学异构体进行分离，还能够采用不加校正因子的主成分自身对照法(见实施例2)对R-异构体的含量进行测定。

实施例1、2给出了有效成分苯磺贝他斯汀(S-构型)与光学异构体(R-构型)分离的研究，并对三批样品中的光学异构体进行定量测定。结果表明，本方法与专利CN1098262C方法和进口标准(JX20060221)中的方法相比，本发明方法具有如下优点：

1、流动相配制简单。

2、两异构体的分离度均在4.5～5.5范围内.。

3、色谱柱耐用性较好，使用一年ChiralpakAD-H色谱柱后，仍有较高的柱效。

附图说明：

图1～图6是采用HPLC(高效液相色谱)方法分离苯磺贝他斯汀与R-异构体得到的色谱图。从各图可看到，现有技术和本发明所用的三种色谱柱，各自在使用时间不同的情况下，苯磺贝他斯汀及其R-异构体分离情况的比较：

图1本发明所用的ChiralpakAD-H新色谱柱初次使用时；

图2本发明所用的ChiralpakAD-H色谱柱使用一年后；

图3现有技术所用的ULTRONES-CD新色谱柱初次使用时；

图4现有技术所用的ULTRONES-CD色谱柱使用一个月后；

图5现有技术所用的ULTRONES-OVM新色谱柱初次使用时；

图6现有技术所用的ULTRONES-OVM色谱柱使用三个月后。

各图中，纵座标是峰面积(单位：mV)，横座标是时间(单位：min)。

具体实施方式

下面以实施例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例中所使用的色谱分离的流动相、流动相的组成和使用的色谱分离柱及色谱分离柱的填料。

以下各实验中所用色谱仪：SHIMADZULC-2010AHT(日本岛津)；检测器：UV；色谱工作站：LCsolution，流速：1.0ml/min。

实施例1ChiralpakAD-H色谱柱正相HPLC(高效液相色谱)检测

色谱条件

色谱柱：ChiralpakAD-H(填料是表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶，4.6×250mm,5μm)

流动相：正己烷-乙醇-乙醇胺(87:13:0.1，V/V/V)；所用正己烷、乙醇均为色谱纯，乙醇胺为分析纯

检测波长：260nm；

进样量：20μl；理论板数按苯磺贝他斯汀峰计不低于2000

方法：分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品适量，加乙醇适量超声使溶解，用正己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体50μg的混合溶液，照上述色谱条件进样20μl，记录色谱图(图1、图2)

图1是ChiralpakAD-H色谱柱初次使用记录的色谱图；图2是该色谱柱使用一年后，采用同样色谱方法条件记录的色谱图。分离数据见表2。

表2ChiralpakAD-H色谱柱使用前后分离数据对比

从表2数据中看出：ChiralpakAD-H色谱柱使用一年后，理论板数和分离度均没有明显变化。证明ChiralpakAD-H色谱柱对苯磺贝他斯汀及R-异构体不仅有较好的分离效果，而且该色谱柱耐用性较好。

本发明方法的方法学验证

1、线性关系

精密称取R-异构体对照品16.49mg(含量99.41％)于100ml量瓶中，用8ml乙醇超声溶解并用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(1)；再精密量取该贮备液5ml至50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(2)。

线性溶液的配制：分别精密量取上述贮备液(2)1.5、2.5ml于25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，配制成异构体浓度为0.98、1.64μg/ml的溶液；再分别精密量取上述贮备液(1)0.5、0.6、0.9、1.0、1.5ml于25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，配制成异构体浓度为3.28、3.93、5.90、6.56以及9.84μg/ml的溶液。取上述各线性溶液，由从低到高的浓度，按异构体测定色谱条件进样20μl，记录色谱图，以浓度为X轴、峰面积为Y轴进行线性回归，回归方程为Y＝11977.4X-985.5，r＝0.9996(n＝7)，R-异构体浓度在0.98μg/ml～9.83μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。

2、回收率试验

精密称取R-异构体对照品25.05mg于50ml量瓶中，用乙醇约16ml超声溶解并用正己烷稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml至50ml量瓶中，用溶剂稀释刻度，摇匀，作为贮备液。称取不含主药的空白辅料约2.0、2.5、3.0g各3份于25ml量瓶中，共9份。分别精密量取上述贮备液2.0、2.5、3.0ml各三份于上述25ml量瓶中，加乙醇约8ml超声溶解并用正己烷稀释至刻度，摇匀，分别测定，计算回收率，得平均回收率为100.3％，RSD为0.84％，表明准确度良好，见表3。

表3R-异构体回收率试验

注：准确度良好的标准通常是平均回收率90％～110％，RSD≤2.0％。

3、检测限

取浓度为0.384μg/ml的R-异构体溶液，照前述色谱条件，取20μl注入液相色谱仪，连续进样6次，信噪比(S/N)均大于3，因此R-异构体的检测限为3.84×10^-7g/ml。

实施例2苯磺贝他斯汀片中光学异构体含量测定

按前述方法、仪器和色谱条件进行正相HPLC测定，具体操作如下：

分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品适量，加乙醇适量超声使溶解，用正己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体5μg的混合溶液，按上述色谱条件进样20μl，记录色谱图。出峰顺序依次为贝他斯汀、R-异构体，理论板数按贝他斯汀峰计算不低于2000，贝他斯汀和相邻异构体的分离度应不低于2.0。

取连续三批苯磺贝他斯汀片，研细，称细粉适量(约相当于苯磺贝他斯汀25mg)，置25ml量瓶中，加乙醇约8ml，超声3分钟使苯磺贝他斯汀溶解，用正己烷稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取0.5ml，置100ml量瓶中，用正己烷-乙醇(70:30)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别精密量取供试品和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按不加校正因子的主成分自身对照法计算R-异构体的量。

结果见表4。

表4三批样品中R-异构体含量

样品批号	20130703	20130704	20130705
				R-异构体(％)	0.13	0.09	0.11

对比例1ULTRONES-CD色谱柱反相HPLC检测苯磺贝他斯汀与R-异构体

以下实验参照进口标准(JX20060221)异构体的鉴别方法进行。

色谱柱：ULTRONES-CD(填料是β-环糊精，4.6×250mm,5μm)

流动相：0.02mol/lKH₂PO₄水溶液-乙腈(75:25)；

检测波长：225nm；

方法：分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品适量，加乙醇适量超声使溶解，用正己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体50μg的混合溶液，其它色谱条件同实施例1进行。

图3是ULTRONES-CD色谱柱初次使用记录的色谱图；图4是该色谱柱使用一个月后，采用同样色谱方法条件记录的色谱图。分离数据见表5。

表5ULTRONES-CD色谱柱使用前后分离数据对比

表5中数据说明：ULTRONES-CD色谱柱使用一个月后对苯磺贝他斯汀及R-异构体的分离度明显降低，明显低于本发明方法中的分离度(实施例1表2)，理论板数亦明显降低。

证明对比例1方法的分离效果明显不如本发明方法，且该方法色谱柱耐用性差。

对比例2ULTRONES-OVM色谱柱反相HPLC(高效液相色谱)检测

以下实验参照专利(CN1098262C)中异构体的测定方法进行。

色谱柱：ULTRONES-OVM(填料是卵蛋白键合硅胶，150mm×4.6mm)

流动相：0.02mol/LKH₂PO₄水溶液(pH4.6)-乙醇(100:8)

检测波长：220nm；

检测方法同对比例1。

图5是ULTRONES-OVM色谱柱初次使用记录的色谱图；图6是该色谱柱使用三个月后，采用同样色谱方法条件记录的色谱图。分离数据见表6：

表6ULTRONES-OVM色谱柱使用前后分离数据对比

表6中数据说明：ULTRONES-OVM色谱柱使用三个月后对苯磺贝他斯汀及R-异构体的分离度明显降低，明显低于本发明方法中的分离度(实施例1表2)，贝他斯汀峰理论板数亦明显降低。

证明对比例2方法的分离效果明显不如本发明方法，且该方法色谱柱耐用性差。

Claims (8)

1.一种拆分苯磺贝他斯汀光学异构体并定量测定R-异构体杂质的方法，采用高效液相色谱法，流动相中含有正己烷和乙醇，其特征在于：

1)采用正相液相色谱法；

2)使用的色谱柱中所用的填料是表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶；

3)所述流动相中还含有碱性添加剂；所述碱性添加剂为含氮原子的碱性有机溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，所述色谱柱是ChiralpakAD-H色谱柱。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述碱性添加剂选自乙醇胺、二乙胺、三乙胺中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的方法，所述流动相中正己烷和乙醇的体积比为：

正己烷:乙醇＝85～90:10～15。

5.根据权利要求1或4所述的方法，所述碱性添加剂在流动相中的的体积比为0.05％～0.15％。

6.根据权利要求1或5所述的方法，所述碱性添加剂在流动相中的的体积比为0.05％～0.1％。

7.根据权利要求1所述的方法，色谱检测条件是：

色谱柱规格为4.6×250mm，5μm；填料为表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶；

体积比为87:13:0.1的正己烷-乙醇-乙醇胺为流动相；

检测波长为260nm；

检测方法是：分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品，加乙醇溶解，用正己烷稀释成每1ml含苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体5μg的混合溶液，按上述色谱检测条件进样20μl，记录色谱图；出峰顺序依次为贝他斯汀、R-异构体，理论板数按贝他斯汀峰计算不低于2000，贝他斯汀和相邻异构体的分离度不低于2.0。

8.一种定量测定苯磺贝他斯汀中所含R-异构体杂质的方法，用权利要求1或7的方法对R-异构体杂质进行分离，其特征是采用不加校正因子的主成分自身对照法对R-异构体的含量进行测定。