CN107091895B

CN107091895B - 采用hplc分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法

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Publication number: CN107091895B
Application number: CN201710554189.2A
Authority: CN
Inventors: 韩庆亮; 王森; 何新欢; 宋杰
Original assignee: Individual
Current assignee: Han Qingliang
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2037-07-10
Also published as: CN107091895A

Abstract

本发明公开了一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，涉及高效液相色谱分析法技术领域，采用以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱，采用由作为A相的缓冲盐溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成的流动相进行洗脱，采用紫外检测器作为检测器以测定利奥西呱原料药中的有关物质。本发明能够快速测得利奥西呱原料中有关物质的含量，特别适合于分离检测杂质ROCG‑三胺、ROCG‑甲酸甲酯和ROCG‑间氟的含量。

Description

采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法

技术领域

本发明涉及高效液相色谱分析法技术领域，具体涉及一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法。

背景技术

利奥西呱，简称为ROCG，是由德国拜耳制药公司研发的能够激发可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的化合物，sGC通过作用于cGMP而调节多重血管床的血管舒张作用，可用于治疗心血管病证或/和性功能障碍。目前，拜耳制药公司研制的用于治疗肺动脉高压(PAH)的口服片剂已经获得FDA批准，商品名为Adempas。

在中国专利CN1330649C中公开了利奥西呱、其异构体和水合物的三种制备方法，其中一种制备方法中涉及到2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺(以下简称为ROCG-三胺，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)和4,6-二氨基-2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯(以下简称为ROCG-甲酸甲酯，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)等多个中间体。另外，利奥西呱原料药中还可能含有其异构体(以下简称为ROCG-间氟，可以参照专利文献中利奥西呱的制备方法获得)。以上所述的三个化合物为利奥西呱原料中较为常见的工艺杂质。

因此，为了控制利奥西呱原料药的质量，需要控制以上所述的三个工艺杂质以及其他杂质。在目前现有技术中，中国专利CN104374861B公开了一种用于检测利奥西呱化合物及其中间体纯度的方法。其中所述方法特征是采用UV检测器的高效液相色谱仪；色谱柱是Agilent RX C8,250mm×4.6mm，5μm；洗脱剂：A相是加入2ml磷酸溶液的浓度约为2g/L的辛烷磺酸钠水溶液：乙腈＝90:10，B相是乙腈；梯度程序：0min，27％的B相，20min，27％的B相，51min，65％的B相，52min，27％的B相；流速是1.0ml/min；柱温是40℃；检测波长是UV260nm。所述方法适合于对利奥西呱原料的质量监控。但该方法采用阴离子对试剂作为缓冲溶液，离子对试剂的浓度与对样品保留时间有直接影响，而且离子对试剂对pH值敏感，直接影响样品的重现性。另外，离子对试剂需长时间平衡系统，同时很难洗去，会大大缩短色谱柱使用寿命。

在现有的技术中，适合于分析检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法具有严重缺陷。本发明提供一种适合于分离检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种专属性好，灵敏度高，准确度好，耐用性好、稳定性指示能力好的采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，采用以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱，采用由作为A相的缓冲盐溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成的流动相进行洗脱，采用紫外检测器作为检测器以测定利奥西呱原料药中的有关物质；

所述流动相的洗脱采用梯度洗脱方式，至少包含三个阶段的梯度变化，其中第一阶段梯度变化是在0～20min内进行，A相在流动相中的体积含量为80～100％；第二阶段梯度变化是在第一阶段梯度变化的时间基础上于接下来的10～40min内进行，A相在流动相中的体积含量由80～100％变化至20～40％；第三阶段梯度变化是在第二阶段梯度变化的时间基础上于接下来的5～30min内进行，A相在流动相中的体积含量为20～40％，其中A相中有机溶剂的体积含量为0～20％；

所述A相和B相中的有机溶液选自甲醇、乙腈或其混合物；

所述紫外检测器的检测波长在210～280nm，流动相流速是0.5～1.5ml/min，色谱柱温度在20～60℃；

所述缓冲盐溶液中的缓冲盐选自高氯酸钠、高氯酸钾及其他高氯酸盐中的一种或几种；

所述缓冲盐溶液中的阴离子试剂浓度是0.005～0.1mol/L，缓冲盐溶液还加入了分析纯磷酸调节pH值至2～3。

所述缓冲盐溶液为浓度0.01mol/L的高氯酸钠水溶液，加入分析纯磷酸调节pH值至2.5。

采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，包括如下条件：

色谱柱：菲罗门Gemini 110A，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长237nm；

流速：0.9～1.1ml/min；

柱温：20～60℃；

梯度洗脱：

A相：0.01mol/L pH＝2.5的高氯酸钠水溶液:乙腈＝90:10，体积比；

B相：乙腈。

所述利奥西呱原料药的进样浓度为0.1～5.0mg/ml，利奥西呱原料药的稀释溶剂选自水和乙腈及二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液，进样体积为1～100μl。

本发明的有益效果是：本发明所述方法可以采用未加校正因子的主成分自身对照法进行计算利奥西呱原料药的有关物质的含量，从而快速测得利奥西呱原料中有关物质的含量，特别适合于分离检测杂质ROCG-三胺、ROCG-甲酸甲酯和ROCG-间氟的含量。

附图说明：

图1为实施例1专属性实验的空白溶液的色谱图；

图2为实施例1专属性实验的供试品溶液的色谱图；

图3为实施例1专属性实验的系统适用性溶液的色谱图；

图4为实施例1专属性实验的杂质定位溶液的色谱图。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1专属性实验

色谱条件：

仪器：安捷伦高效液相色谱仪1260；

色谱柱：菲罗门C18Gemini 110A，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长237nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

梯度洗脱：

时间(min)	A相％(体积比)	B相％(体积比)
			0	90	10
5	90	10
			30	30	70
60	30	70
			61	90	10
70	90	10

A相：0.01mol/L高氯酸钠溶液(磷酸调节pH值2.5):乙腈＝90:10，体积比，其中磷酸溶液的浓度是约85％，w/v；

B相：乙腈。

实验步骤：

稀释液(空白溶液)：DMF：(20％乙腈水溶液)＝1:9，体积比。

供试品溶液：取利奥西呱约25mg，精密称定至50mL量瓶，加5ml DMF溶解后用20％乙腈水稀释至刻度，摇匀，即得。

系统适应性溶液：取ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯、ROCG-间氟杂质各25mg同置于50ml容量瓶中，加5ml DMF溶解后加20％乙腈水稀释至刻度，取0.5ml加25mg利奥西呱同置50ml容量瓶中，加5ml DMF溶解后加20％乙腈水稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质定位溶液：取ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯、ROCG-间氟杂质各25mg同置于50ml容量瓶中，加5ml DMF溶解后加20％乙腈水稀释至刻度，取1ml加稀释剂稀释至100ml，摇匀，即得。

分别取空白溶液、供试品溶液、系统适用性溶液、和杂质定位溶液，采用上述色谱条件进样检测，记录色谱图。空白图谱如图1，系统适用性溶液图谱如图2，中间体加标液图谱如图3和供试品溶液图谱如图4。按面积归一化法计算利奥西呱原料药主要有关物质的含量。检测结果如表1。

表1

实施例2耐用性实验

本实施例通过改变部分色谱条件的参数考察色谱方法的耐用性，以如下色谱条件为基础：

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；

色谱柱：菲罗门C18Gemini 110A，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长237nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

梯度洗脱：

A相：0.01mol/L高氯酸钠溶液(磷酸调节pH值2.5)：乙腈＝90:10，体积比，其中磷酸溶液的浓度是约85％，w/v；

B相：乙腈。

以单因素变化的方式考察改变流速、色谱柱温度、流动相pH值、更换不同生产批次的菲罗门C18Gemini 110A，4.6×250mm，5μm色谱柱等色谱条件对检测系统适应性溶液和灵敏度溶液的影响。主要考察改变色谱条件对系统适应性溶液中各峰分离度以及供试品溶液杂质检出的影响。

稀释液(空白溶液)：DMF：(20％乙腈水溶液)＝1:9，体积比。

在各考察色谱方法下，分别取空白软件和系统适应性溶液各进一针，供试品溶液进样两针，检测结果如表2。

表2

实施例3检测限定量限实验

色谱条件如实施例1所述色谱条件。

稀释液(空白溶液)：DMF：(20％乙腈水溶液)＝1:9，体积比。

检测限定量限溶液：取ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯、ROCG-间氟杂质及利奥西呱各适量，加DMF适量溶解后稀释制成一系列不同浓度的溶液，依法测定。当主峰峰高为噪音峰高的3倍时，该物质的浓度或量即为该物质的检测限；当主峰峰高为噪音峰高的10倍时，该物质的浓度或量即为该物质的定量限。结果见下表3。

表3

检测限	占供试品百分百	进样量(μg)	信噪比(S/N)
				ROCG-甲酸甲酯	0.008％	0.41	4.8
ROCG-三胺	0.008％	0.39	4.5
				利奥西呱	0.008％	0.42	5.3
ROCG-间氟	0.008％	0.40	4.9
				定量限	占供试品百分百	进样量(μg)	信噪比(S/N)
ROCG-甲酸甲酯	0.02％	1.02	15.3
				ROCG-三胺	0.02％	0.98	14.8
利奥西呱	0.02％	1.05	17.5
				ROCG-间氟	0.02％	1.01	16.2

实施例4精密度实验

色谱条件如实施例1所述色谱条件。

稀释液(空白溶液)：DMF：(20％乙腈水溶液)＝1:9，体积比。

杂质对照储备液：取ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯、ROCG-间氟杂质各25mg同置于50ml容量瓶中，加5ml DMF溶解后加20％乙腈水稀释至刻度，取1ml加稀释液稀释至100ml，摇匀，即得。

重复性实验溶液：取供试品25mg，精密称定，置于50mL容量瓶内，加入5ml DMF溶解，精密移取上述杂质对照储备液5ml至上述容量瓶中，加20％乙腈水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。

待基线平衡后，取空白溶液及6份分析重复性实验溶液各进样1针，记录色谱图。按不加校正因子的自身对照法计算6份分析重复性试验溶液中各杂质的含量、平均值、相对标准偏差值(RSD)，检测结果如表4。

表4

实施例5回收率试验

色谱条件如实施例1所述色谱条件。

稀释液(空白溶液)：DMF：(20％乙腈水溶液)＝1:9，体积比。系统适应性溶液：取ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯、ROCG-间氟杂质各25mg同置于50ml容量瓶中，加5ml DMF溶解后加20％乙腈水稀释至刻度，取0.5ml加25mg利奥西呱同置50ml容量瓶中，加5ml DMF溶解后加20％乙腈水稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质对照溶液：取杂质对照储备液5ml加稀释液稀释至50ml，摇匀，即得。

回收率实验溶液：取供试品25mg至50ml容量瓶中，先分别加入5ml的DMF溶解，分别量取4ml、5ml、6ml不同体积的杂质对照储备液于上述容量瓶中，再用20％乙腈水定容至刻度，摇匀，每个浓度配制3份，即得杂质的3(份)×3(浓度)共9份回收率供试液。

待系统适用性合格后，取杂质对照溶液连续进样2针，再取2份供试品溶液各进1针，各浓度水平下回收率实验溶液各进样1针，记录色谱图。计算并报告9份样品的回收率单值，平均回收率(n＝9)和回收率(n＝9)的相对标准偏差值(RSD)。按照外标法计算杂质的含量，然后按照以下公式分别计算各浓度水平下回收率实验溶液中杂质回收率，检测结果见表5。

式中：

W_对照：杂质对照的杂质质量，mg；

W_加入：加入回收率实验溶液中的杂质质量，mg；

W_样品：回收率实验溶液中样品的称样量，mg；

W_供试品：回收率实验溶液中样品的称样量，mg；

A_样品：回收率实验样品溶液中的杂质峰面积；

A_供试品：回收率实验供试品溶液中的杂质峰面积；

A_对照：回收率实验杂质对照溶液中的杂质峰面积；

百分比：回收率实验样品溶液与杂质对照溶液相比的百分比，80％、100％、120％；

表5

综上所述，实施例1的实验结果和图谱1-4表明，本发明提供的方法在检测利奥西呱原料药有关物质，特别是ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯和ROCG-间氟有关物质时，空白无干扰，具有很好的专属性，其中ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯和ROCG-间氟与相邻杂质或利奥西呱的分离度均为2.0以上。实施例3的实验结果表明ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯和ROCG-间氟的检测限为0.008％，定量限为0.02％，杂质检出良好。

实施例2的实验结果表明在单因素改变部分色谱参数的情况下，本方法依然适用于检测利奥西呱原料药有关物质，其中考察的系统适应性溶液的分离度和供试品溶液的检测情况受影响不大，所述方法具有较好的耐用性，在适当范围内变更色谱条件完全不影响本发明方法实现分析目的。

实施例4的实验结果表明采用本发明提供的分析方法测定含有杂质的精密度溶液，进样6针后各杂质的测定含量的RSD％小于5％，所述方法具有较好的重复性。

实施例5的实验结果通过测定原料药中含有不同浓度水平的杂质的回收率，考察本发明的分析方法在测定有关物质的准确性。经实验结果表明，不同浓度水平的杂质的回收率均在92-108％之间，多个样品回收率的RSD％小于10％。因此所述方法在测定利奥西呱原料药有关物质中具有很好的准确性。

因此，本发明所述的分析方法在测定利奥西原料药有关物质具有专属性好，灵敏度高，重现性好，准确度高等优点。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，其特征在于，所述有关物质为ROCG-三胺、ROCG-乙酸乙酯和ROCG-间氟；

包括如下条件：

色谱柱：菲罗门Gemini 110A，4.6×250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长237nm；

流速：0.9～1.1ml/min；

柱温：20～60℃；

梯度洗脱：

A相：0.01mol/L pH＝2.5的高氯酸钠水溶液:乙腈＝90:10，体积比；

B相：乙腈。

2.根据权利要求1所述的采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，其特征在于：所述利奥西呱原料药的进样浓度为0.1～5.0mg/ml，利奥西呱原料药的稀释溶剂选自水和乙腈及N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液，进样体积为1～100μl。