CN114113375B

CN114113375B - 一种hplc检测盐酸屈他维林原料药含量的方法

Info

Publication number: CN114113375B
Application number: CN202111327016.XA
Authority: CN
Inventors: 王凯; 卢书玉; 董鑫; 谭忠琴; 姜军; 叶文静; 赵一玫; 贾芳
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2021-11-10
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2041-11-10
Also published as: CN114113375A

Abstract

本发明公开了一种HPLC检测盐酸屈他维林原料药含量的方法。具体步骤为：配制盐酸屈他维林对照品储备液和供试品储备液；通过高效液相色谱进行检测，色谱条件为：色谱柱：C₁₈色谱柱；流动相：A为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH为2.8‑3.2；B相为体积比为1:4的流动相A与乙腈混合液；等度洗脱：A/B＝38/62，流速：1.4‑1.6mL/min，柱温28‑32℃，检测波长：237‑247nm；进样量：10‑20μL，样品浓度：20.00～100.00μg/mL；根据测试结果计算得到盐酸屈他维林含量。该方法专属性好、灵敏度高，杂质分离理想，测定更准确，可实现盐酸屈他维林的质量监控。

Description

一种HPLC检测盐酸屈他维林原料药含量的方法

技术领域

本发明涉及到分析化学领域，特别涉及到一种HPLC检测盐酸屈他维林原料药含量的方法。

背景技术

盐酸屈他维林作为一种亲肌性解痉药，可直接作用于平滑肌细胞，其解痉作用比同样作用于平滑肌的罂粟碱强，作用持续时间更长。由于对自主神经不产生影响，可应用于青光眼、前列腺肥大患者，弥补了抗胆碱类药物的不足。盐酸屈他维林主要出口欧洲各国，国内于近几年开始使用，所以对其结构、含量测定、有关物质的研究相对较少。对其结构进行确认，并进行初步的质量及降解产物的研究是具有重大意义。

盐酸屈他维林属于罂粟碱(异喹啉类)衍生物，是一种亲肌性解痉药，可直接作用于平滑肌细胞。在治疗过程中，盐酸屈他维林主要通过以下作用机理达到治疗和预防功能性或神经性痉挛。

1.作用于平滑肌细胞表面，改变细胞膜电位和通透性；

2.抑制磷酸二酯酶，增加肌细胞内环磷腺苷(cAMP)水平，抑制肌球蛋白轻链肌酶；

3.抑制肌细胞内钙离子反应，通过cAMP途径降低细胞质中钙离子浓度。

由于目前通过高效液相色谱测试盐酸屈他维林含量的方法有分离时间长(15分钟左右)，分离不彻底，峰形拖尾严重，流动相消耗大等缺点，急需进行工艺优化。

发明内容

本发明的目的主要在于提供一种HPLC检测盐酸屈他维林原料药含量的方法，检测盐酸屈他维林时专属性好、灵敏度高，杂质分离理想，测定更准确，可实现盐酸屈他维林的质量监控。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种HPLC检测盐酸屈他维林含量的方法，包括如下步骤：

1)配制盐酸屈他维林对照品储备液；

2)配制盐酸屈他维林供试品储备液；

3)通过高效液相色谱分别对盐酸屈他维林对照品储备液和供试品储备液进行检测，色谱条件为：

色谱柱：C₁₈色谱柱；

流动相：A为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH为2.8-3.2；B相为体积比为1:4的流动相A与乙腈混合液；

等度洗脱：A/B＝38/62，流速：1.4-1.6mL/min，柱温28-32℃，检测波长：237-247nm；进样量：10-20μL，样品浓度：20.00～100.00μg/mL；

4)根据测试结果计算得到盐酸屈他维林含量。

按上述方案，所述步骤1)中，精密称取盐酸屈他维林对照品，通过加入乙腈超声溶解完全，再用乙腈稀释定容，最后采用0.22μm滤膜过滤，配置得到盐酸屈他维林对照品储备液，可根据测试浓度需要进行稀释。

按上述方案，所述步骤2)中，精密称取盐酸屈他维林供试品，通过加入乙腈超声溶解完全，再用乙腈稀释定容，最后采用0.22μm滤膜过滤，配置得到盐酸屈他维林供试品储备液，可根据测试浓度需要进行稀释。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种HPLC检测盐酸屈他维林含量的方法，通过优化检测波长、样品浓度、柱温、流速等条件，并将梯度洗脱优化为等度洗脱，检测盐酸屈他维林时专属性好、灵敏度高，杂质分离理想，测定更准确；其中，检测限、定量限、仪器精密度、溶液稳定性、耐用性等均符合原料药质量标准，盐酸屈他维林中各杂质与主成分分离度均大于1.5，在线性范围内，盐酸屈他维林及各有关物质的线性良好，R2＞0.9997。

附图说明

图1为实施例中专属性测试中的空白实验。

图2为实施例中盐酸屈他维林对照品储备液专属试验色谱图。

图3为实施例中盐酸屈他维林供试品、杂质A和杂质B混合液专属试验色谱图。

图4为实施例中盐酸屈他维林含量标准曲线。

图5为实施例中盐酸屈他维林定量限试验色谱图。

图6为实施例中盐酸屈他维林稳定性试验。

图7实施例中为盐酸屈他维林线性色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的解释说明。

根据盐酸屈他维林合成路线及对可能降解产生的杂质进行文献查阅研究。可知，盐酸屈他维林原料中可能会产生的杂质，结果见表1。杂质A、B、C、D均为本实验自制，杂质结构均经核磁共振氢谱、核磁共振碳谱及红外分光光谱进行确认。

表1

本发明主要对盐酸屈他维林进行含量测定，就必定要研究其有关物质检测，建立盐酸屈他维林有关物质的检查方法，并进行方法学研究。原料药的有关物质研究目的是检查药物中的杂质是否符合安全要求，是控制盐酸屈他维林质量的重要指标。一般原料药有关物质主要是在生产过程中带入的原始材料、中间产物、聚合体、副产物，以及存储和运输环节中的降解产物等。

本发明提供一种HPLC检测盐酸屈他维林原料药含量的方法，所述方法选用Supersil ODS2 C18(200×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相：A相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节PH为3)，B相为流动相A—乙腈(体积比1：4)，等度洗脱：A/B＝38/62，流速：1.5mL/min，柱温30℃，检测波长：242nm；进样量：10μL，样品浓度：100.00μg/mL。

所述的方法具体操作步骤如下：

1.自制盐酸屈他维林对照品溶液配制：精密称取自制盐酸屈他维林对照品(经三次乙醇重结晶)50mg于50mL容量瓶中，加入适量的乙腈将其充分溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.00mg/mL的盐酸屈他维林对照品储备液：

2.自制盐酸屈他维林供试品溶液配制：精密称取自制盐酸屈他维林供试品50mg于50mL容量瓶中，加入适量的乙腈将其充分溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.00mg/mL的盐酸屈他维林供试品储备液：

3.盐酸屈他维林中杂质A-D对照品溶液配制：精密称取自制盐屈他维林杂质A-D对照品50mg分别置于50ml容量瓶中，加入适量的乙腈将其充分溶解并稀释至刻度摇匀，得浓度为1.00mg/ml得盐酸屈他维林杂质对照品储备液，同法制得各杂质1.00mg/ml对照品储备液,再进行稀释制得各杂质0.10mg/ml的对照品储备液；

4.系统适应性溶液配制：取步骤1中盐酸屈他维林对照品储备液与步骤3中盐酸屈他维林各杂质0.10mg/mL对照品储备液各1mL，置于10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，定容，摇匀，采用0.22μm滤膜过滤，作为系统适应性供试液。

5.取步骤4所得系统适应性供试液和步骤3所得各杂质对照品储备液20μL，分别采用上述色谱条件检测，记录色谱图，结果见表2。结果表明，各杂质出峰顺序依次为杂质A(11.05min)、盐酸屈他维林(12.76min)、杂质B(19.08min)、杂质C(16.90min)、杂质D(22.68min)，杂质A、杂质B、杂质C及杂质D相对于盐酸屈他维林的相对保留时间依次为0.80、1.49、1.32、1.78，各峰之间的分离度均大于1.5，理论板数以盐酸屈他维林峰计大于6000，不对称因子符合要求。

表2系统适应性试验数据

线性、校正因子、检测限和定量限

精密量取自制盐酸屈他维林对照品储备液及各杂质储备液适量，乙腈稀释制成一系列浓度：2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL的标准曲线溶液。按照上述色谱条件，记录色谱图；以各样品浓度为横坐标(X),对应的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，进行线性回归。通过自制盐酸屈他维林与杂质线性方程斜率比，计算杂质的相对校正因子，结果见表3。各物质的检测限和定量限则根据信噪比法，采用乙腈不断稀释自制盐酸屈他维林和各杂质对照品，注入高效液相色谱仪。结果见3-7。

表3盐酸屈他维林试验数据

表4杂质A试验数据

表5杂质B试验数据

表6杂质C试验数据

表7杂质D试验数据

实验结果表明：在线性范围内，盐酸屈他维林及各有关物质的线性良好，R2＞0.9997。检测限及定量限满足检测需求。由于杂质A及在D的相对校正因子不在规定范围内，即0.9～1.1之间，在对其杂质含量测定时需要采用加校正因子计算含量值。

方法学验证

1.专属性试验

分别取盐酸屈他维对照品储备液1ml，同时精密量取盐酸屈他维供试品溶液1ml以及取有关物质检查中杂质A和杂质B各0.1ml，混合，同时配制空白溶液，分别按上述色谱条件对上述溶液进行测定，记录色谱图如图1-3。结果表明，供试品溶液中盐酸屈他维林峰与杂质A、杂质B峰分离较好，其自制盐酸屈他维林供试品与对照品保留时间一致，且空白溶剂无干扰。

2.精密度试验

精密量取盐酸屈他维林对照品储备液1mL，置于10mL容量瓶中，加入乙腈稀释至刻度，定容，摇匀，制备成浓度为0.1mg/ml盐酸屈他维林的溶液，确定的色谱条件，重复进样6次，记录主成分峰面积、保留时间，计算其相对标准偏差(RSD)，结果见表8。

表8精密度试验结果

结论：连续进样6次，主峰面积无明显，符合质量要求变化，峰面积相对标准偏差RSD为0.34％，保留时间RSD为0.57％，小于1.5％，表明本法的进样精密度良好。

3.线性与范围

取1.00mg/mL自制盐酸屈他维林对照品储备液1mL、2mL、4mL、6mL、7mL、8mL分别置于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，定容，摇匀，依次制得10.00ug/mL、20.00ug/mL、40.00ug/mL、80.00ug/mL、100.00ug/mL、120.00ug/mL、150.00ug/mL的盐酸屈他维林溶液。在色谱条件下依次精密量取上述溶液进样检测分析，记录主成分峰面积，将溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标拟合标准曲线，建立自制盐酸屈他维林的标准曲线方程，结果见表9，标准曲线图如图4。

表9线性试验结果

实验结果表明：自制盐酸屈他维林在0.01～0.15mg/mL范围内线性良好，回归方程为y＝16.36x-19.6436，R2＝0.9999，符合标准质量要求。

4.定量限试验

取上述“3.线性与范围”项下线性试验的最小系列浓度(10.00μg/mL)作定量限试验的母液，按信噪比法，用溶剂逐步稀释，照“色谱条件进样分析，当色谱峰的信噪比S/N约等于10，记录该样品浓度，作为定量限浓度，定量限色谱图如图5。

结论：经上述实验测得，自制盐酸屈他维林在该色谱条件下的定量限(S/N＝9)为0.50μg/mL。

5.准确度试验

以100.00μg/mL作为盐酸屈他维林准确度测定100％标准。分别精密称取自制盐酸屈他维林对照品8mg、10mg、12mg,各置于100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，定容，摇匀，分别制成准确度试验供试液，以上溶液浓度各配制3份。照色谱条件进样分析，记录色谱图，采用外标法计算样品各浓度回收率，准确度试验结果见表10。

表10准确度试验结果

6.重复性试验

取同一批自制盐酸屈他维林供试品储备液1mL，共6份，各配制成浓度为0.10mg/mL的溶液，依次量取各溶液10μL，采用高效液相色谱自动进样分析，记录色谱图，计算自制盐酸屈他维林的含量及其RSD值，结果见表11。

表11重复性试验结果

结论：对6份盐酸屈他维林供试品储备液进行测试，发现其RSD值小于2％，说明所得数据在规定范围内，盐酸屈他维林供试品符合测定要求。

7.稳定性试验

取上述“5.精密度试验”项下的供试液，室温存放，每隔两小时照上述色谱条件进样分析，记录峰面积。以时间变化为横坐标，盐酸屈他维林峰面积为纵坐标绘制曲线图，考察自制盐酸屈他维林稳定性，结果如图6所示。

结论：随着时间的增长，盐酸屈他维林峰面积未产生明显变化，表明该药物溶液在10h内稳定。峰面积相对标准偏差(RSD)为0.41％。

8.耐用性试验

为验证该方法对自制盐酸屈他维林含量测定耐用性良好，故分别改变上述色谱条件中波长(±5)、柱温(±2℃)、流速(±0.1mL/min)和pH(±0.2)，通过各条件的细微变动，依次对自制盐酸屈他维林溶液进样分析，记录色谱图，计算每次样品含量及相对标准偏差(RSD)，结果见表12。

表12耐用性试验数据

结论：由表可知，色谱各条件的细微变化后，对自制盐酸屈他维林药物进行检测，其各项指标均在标准范围内，即含量的相对标准偏差(RSD)小于2％,理论塔板数均大于3000。表明所建立的高效液相色谱法对测定自制盐酸屈他维林含量的耐用性良好。

下列所述实施例是本发明的一部分，不是全部的实施例。

样品含量测定

1.色谱测试条件

高效液相色谱仪：大连依利特分析仪器有限公司型号P230

色谱柱：Supersil ODS2 C₁₈(200×4.6mm，5μm)

流动相：A相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节PH为3)，B相为流动相A—乙腈(1：4)，A：B＝1：1；

流速：1.5mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：242nm；

进样体积：10μL。

2.测试步骤

精密称取盐酸屈他维林对照品及不同批次自制原料药(200715、200722、200729)各10mg，分别置于100mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，定容，摇匀，制成对照品溶液和供试品溶液，分别精密量取10μL对照品溶液及各供试品溶液，依次照色谱条件进样分析，记录各试验数据，以峰面积按外标法计算各批次自制盐酸屈他维林供试品含量。测定结果见表13，线性色谱如图7。

表13不同批次盐酸屈他维林含量

在建立高效液相色谱法测定自制盐酸屈他维林初期，我们试图使用其有关物质测定的色谱条件，但出于对流动相用量大、主成分保留时间长等造成环保和试验效率的影响考虑，我们对其有关物质检查的色谱条件进行了优化，并经过方法学验证，表14是自制盐酸屈他维林含量测定方法学验证总结。

表14自制盐酸屈他维林含量测定方法学验证结果

Claims

1.一种HPLC检测盐酸屈他维林含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)配制盐酸屈他维林对照品储备液；

2)配制盐酸屈他维林供试品储备液；

色谱柱：C₁₈色谱柱；

4)根据测试结果计算得到盐酸屈他维林含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，精密称取盐酸屈他维林对照品，通过加入乙腈超声溶解完全，再用乙腈稀释定容，最后采用0.22μm滤膜过滤，配置得到盐酸屈他维林对照品储备液，可根据测试浓度需要进行稀释。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，精密称取盐酸屈他维林供试品，通过加入乙腈超声溶解完全，再用乙腈稀释定容，最后采用0.22μm滤膜过滤，配置得到盐酸屈他维林供试品储备液，可根据测试浓度需要进行稀释。