CN117517528A - 一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法 - Google Patents

一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法，涉及药物分析技术领域，是采用高效液相色谱法进行检测；所述色谱检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：流动相A为pH＝2.0‑4.0的磷酸二氢盐溶液，流动相B为乙腈；采用梯度洗脱；紫外检测，检测波长为222nm。本发明通过色谱条件筛选，对芦可替尼中间体中的相关物质进行了分析检测，能够同时检测出4‑氯吡咯并嘧啶、(4‑氯‑7H‑吡咯并[2,3‑D]嘧啶‑7‑基)甲基特戊酸酯、1‑(1‑乙氧基乙基)‑4‑碘‑1H‑吡唑、1‑(1‑乙氧基乙基)‑4‑吡唑硼酸频哪醇酯、[(4‑(1‑乙氧基乙基)‑1H‑吡唑‑4‑基)‑7H‑吡咯并[2,3‑D]嘧啶‑7‑基]甲基特戊酸酯、三苯基氧化膦，分离度高，为芦可替尼中间体的质量控制、杂质研究提供了一种简便合理的检测方法。

Description

一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法。
背景技术
磷酸芦可替尼(Ruxolitinib)作为一种JAK激酶抑制剂，具有潜在的抗肿瘤和免疫调节活性，用于治疗中间或高危骨髓纤维化，包括原发性骨髓纤维化，真性红细胞增多症后骨髓纤维化和原发性血小板增多症后骨髓纤维化。磷酸芦可替尼作为首个骨髓纤维化治疗药物，也是目前唯一批准针对其发病机制的靶向药物。
[4-(1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯，是磷酸芦可替尼制备过程中最为关键的中间体，其英文化学名为[4-(1H-Pyrazol-4-yl)-7H-pyrrolo[2,3-D]pyrimidin-7-yl]methyl pivalate，分子式为C15H17N5O2，分子量为299.33。
目前，上述芦可替尼中间体合成工艺是以4-氯吡咯并嘧啶和4-碘吡唑为原料，经格式反应、偶联反应，酸化反应等多步反应制备的，该芦可替尼中间体合成过程中可能会引入以下5种杂质成分：4-氯吡咯并嘧啶、(4-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯、1-(1-乙氧基乙基)-4-碘-1H-吡唑、1-(1-乙氧基乙基)-4-吡唑硼酸频哪醇酯、[(4-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯(又名巴瑞克替尼中间体1，CAS号：1146629-76-6)。中国药典及国外药典未收录上述芦可替尼中间体中相关物质测定方法，现有技术也未有相关报道。因此，建立芦可替尼中间体中相关物质的检测方法，对有效控制芦可替尼中间体及芦可替尼产品的纯度和质量具有重要意义。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法，能够同时检测芦可替尼中间体中的5种杂质，各杂质峰与主峰之间均能有效分离，从而有效监控芦可替尼中间体中的相关杂质，控制产品质量。
本发明提出的一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法，所述芦可替尼中间体的结构式如式(Ⅰ)所示：
是采用高效液相色谱法进行检测；
所述色谱检测条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：流动相A为pH＝2.0-4.0的磷酸二氢盐溶液，流动相B为乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
采用紫外检测，检测波长为222nm。
进一步地，所述相关物质包括：4-氯吡咯并嘧啶、(4-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯、1-(1-乙氧基乙基)-4-碘-1H-吡唑、1-(1-乙氧基乙基)-4-吡唑硼酸频哪醇酯、[(4-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯、三苯基氧化膦。
进一步地，所述色谱柱选自Agilent SB-C18；规格为5μm，250mm x 4.6mm。
进一步地，所述梯度洗脱程序为：0-3min，流动相中流动相A的体积百分占比为70-90％；3-15min，流动相A的体积百分占比为30-90vt％；15-20min，流动相A的体积百分占比为10-40vt％；20-25min，流动相A的体积百分占比为10-40vt％；25-30min，流动相A的体积百分占比为10-90vt％；30-35min，流动相A的体积百分占比为70-90vt％。
优选地，所述梯度洗脱程序为：0-3min，流动相中流动相A的体积百分占比为80vt％；3-15min，流动相A的体积百分占比为35vt％；15-20min，流动相A的体积百分占比为15vt％；20-25min，流动相A的体积百分占比为15vt％；25-30min，流动相A的体积百分占比为80vt％；30-35min，流动相A的体积百分占比为80vt％。
进一步地，所述磷酸二氢盐溶液为磷酸二氢钾溶液，其浓度为5-25mmol/L，用磷酸调节pH至2.0-4.0。
进一步地，所述流速为0.8-1.2mL/min，柱温为30-45℃，进样体积为10-20μL。
本发明中，流速优选1mL/min，柱温优选40℃、进样体积优选10μL。
本发明中，所述自动进样室温度为4-40℃，优选25℃。
进一步地，所述检测方法包括以下步骤：
S1、配制相关杂质对照品单标溶液：精密称取各相关杂质对照品，分别置于不同容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，配制成各相关杂质对照品单标溶液；
S2、配制芦可替尼中间体对照品溶液：精密称取芦可替尼中间体对照品，置于容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，得到芦可替尼中间体对照品溶液；
S3、配制线性检测溶液：精密量取各相关杂质对照品单标溶液和芦可替尼中间体对照品溶液，混合，加稀释剂进行稀释，配制成线性检测溶液，采用高效液相色谱法进行检测，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
S4、配制供试品溶液：将芦可替尼中间体供试品用稀释剂溶解，配制成供试品溶液，采用高效液相色谱法进行检测，根据线性回归方程计算样品中各相关杂质的含量。
优选地，所述稀释剂为甲醇。
优选地，所述供试品溶液中芦可替尼中间体的浓度为0.2-2mg/mL。
有益效果：针对现有技术中芦可替尼中间体原料杂质检测研究的缺失，本发明提出了一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法，通过色谱条件筛选，能够同时检测出芦可替尼中间体中的4-氯吡咯并嘧啶、(4-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯、1-(1-乙氧基乙基)-4-碘-1H-吡唑、1-(1-乙氧基乙基)-4-吡唑硼酸频哪醇酯、[(4-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯、三苯基氧化膦等杂质成分，分离度高，方法专属性强，为芦可替尼中间体的质量控制、杂质研究提供了一种简便合理的检测方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中的供试品溶液色谱图；
图2为本发明实施例1中的杂质加样对照品溶液色谱图；
图3为本发明实施例2中的系统适用性色谱图；
图4为本发明实施例2中的芦可替尼中间体C5的线性回归方程；
图5为本发明实施例2中的杂质C的线性回归方程；
图6为本发明实施例2中的杂质E的线性回归方程；
图7为本发明实施例2中的杂质F的线性回归方程。
具体实施方式
本发明中，所述“室温”指常规意义上的室内温度，一般指4℃-30℃。
除非另有说明，本发明中关于物质浓度或含量的百分比表示为重量百分比。
芦可替尼中间体合成过程中可能会引入以下5种杂质成分：4-氯吡咯并嘧啶、(4-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯、1-(1-乙氧基乙基)-4-碘-1H-吡唑、1-(1-乙氧基乙基)-4-吡唑硼酸频哪醇酯、[(4-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯；
所述芦可替尼中间体的结构式如式(Ⅰ)所示：
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明芦可替尼中间体有关物质检测方法：
1.检测仪器及检测条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260ⅡVWD；
色谱柱：Agilent SB-C18(5μm,250mm x 4.6mm)；
流动相：流动相A为磷酸二氢钾水溶液(10mmol/L，pH为2.50)，流动相B为乙腈；
洗脱梯度程序如表1所示：
表1梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相(％)
0 80 20
3 80 20
15 35 65
20 15 85
25 15 85
30 80 20
35 80 20
流速：1.0mL/min；
检测波长：222nm；
柱温：40℃。
2.溶液配制：
供试品溶液配制：取芦可替尼中间体样品，加稀释剂溶解制成每1mL中含芦可替尼中间体0.4mg的供试品溶液；
自身对照溶液配制：精密量取供试品溶液1mL，置100mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液；
芦可替尼中间体对照品储备液配制：取芦可替尼中间体(标记为“C5”)对照品20mg，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即为芦可替尼对照品储备液；
相关杂质对照品单标溶液：精密称取4-氯吡咯并嘧啶(标记为“A01”)、1-(1-乙氧基乙基)-4-碘-1H-吡唑(标记为“B2”)、(1-(1-乙氧基乙基)-4-吡唑硼酸频哪醇酯(标记为“B3”)、(4-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯(标记为“杂质F”)、[(4-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯(标记为“杂质E”)对照品各10mg，分别置于不同10mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质对照品溶液母液；
杂质加样对照品溶液配制：精密量取芦可替尼对照品储备液4.0mL和各杂质对照品溶液母液1.0mL，置10mL量瓶中混合，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质加样对照品溶液。
3.测定方法：
取自身对照溶液10μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20％。另取供试品溶液和杂质加样对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3～4倍，供试品溶液色谱图如图1所示，杂质加样对照品溶液色谱图如图2所示。
从图2中可以看出，芦可替尼中间体主峰保留时间约为12分钟左右，检测时间较为合适，5种已知杂质均能得到有效的检测，分离度均符合要求。
对制备的芦可替尼中间体样品进行检测，如图1所示，发现制备的芦可替尼中间体样品中检测出三苯基氧化膦(标记为“杂质C”)和杂质E，杂质C为反应试剂引入的杂质，虽然杂质F未检测出，但是可能存在的一个重要杂质，因此，对杂质C、杂质E和杂质F进行进一步方法学验证。
实施例2：
1.检测仪器与色谱条件：同实施例1。
2.溶液配制：
供试品溶液配制：取芦可替尼中间体样品，加稀释剂溶解制成每1mL含芦可替尼中间体0.4mg的供试品溶液。
3.测定方法
采用以上检测方法，对方法的线性、检测线、定量限、线性、重复性、准确度、稳定性等进行考察，具体操作及结果如下：
(1)系统适用性实验
发明人前期的预实验中发现芦可替尼中间体(C5)样品溶液中会有3个特定杂质，分别为[(4-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯(杂质E)、((4-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯(杂质F)和三苯基氧化膦(杂质C)，因此制备系统适用性溶液。具体制备方法如下：
混合杂质对照品储备液：分别取杂质C、杂质E、杂质F对照品约32mg，精密称定，置200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
混合杂质对照品溶液：精密量取上述混合杂质对照品储备液5ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
系统适用性溶液的制备：取芦可替尼中间体样品20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加适量甲醇溶解，精密加入混合杂质对照品溶液5ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。照上述色谱条件进样分析。
如下图3所示。芦可替尼中间体与相邻杂质峰之间分离度分别为2.29，11.57，均大于1.5，各个杂质峰之间的最小分离度为2.29，大于1.5，结果符合系统适用性要求。
(2)检测限和定量限
杂质E杂质储备液：取杂质E对照品约16mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质F杂质储备液：取杂质F对照品约16mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质C杂质储备液：取杂质C对照品约16mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
芦可替尼中间体储备液：取芦可替尼中间体对照品约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
线性储备液LR0：精密量取杂质C、杂质E、杂质F储备液及芦可替尼中间体储备液分别1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：取线性储备液LR0，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。连续进样3次。
定量限溶液：取线性储备液LR0，精密量取0.5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。连续进样6次。
检测线和定量限检测结果如表2和表3所示。
表2检测限实验结果
样品名 平均S/N 检测限浓度(μg·mL-1)
C5 38.5 0.17
杂质C 20.4 0.06
杂质E 13.5 0.07
杂质F 17.2 0.06
表3定量限实验结果
(3)线性实验与校正因子测定
以芦可替尼中间体供试品溶液浓度(0.4mg·mL-1)为100％，分别考察芦可替尼中间体在0.05％～0.60％、3个特定杂质在0.02％～0.30％浓度范围内的线性关系。取线性储备液LR0(同检测限与定量限项下)，作为线性试验的储备溶液。分别精密量取储备溶液0.5、2.5、4.0、5.0、7.5mL，置于10mL量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度。分别量取上述各溶液10μL进样分析，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程及线性范围；根据各化合物对应线性回归方程斜率计算得校正因子，结果见表4，线性回归图见图4至图7。
表4线性实验结果
化合物 回归方程 r 线性范围(μg·mL-1) 校正因子
C5 Y＝38.334X+1.8442 0.9990 0.21～3.09 1.0
杂质C Y＝52.373X+0.3979 0.9997 0.08～1.20 0.7
杂质E Y＝30.32X+0.3889 0.9997 0.08～1.20 1.3
杂质F Y＝52.898X+0.017 0.9999 0.08～1.20 0.7
(4)重复性实验
平行配制6份供试品溶液，分别精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表5。
表5重复性实验结果
(5)准确度实验
混合杂质对照品溶液：取系统适用性实验项下混合杂质对照品溶液，精密量取0.5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
混合杂质对照品储备液：取系统适用性实验项下混合杂质对照品溶液,精密量取5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
准确度溶液：精密称取芦可替尼中间体约20mg，分别置50mL量瓶中，平行9份，分别加入混合杂质对照品储备液2.5、2.5、2.5、5.0、5.0、5.0、7.5、7.5、7.5mL，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；分别取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算各杂质回收率，结果如表6所示。
表6回收率实验结果
结果表明，杂质C、E、E平均回收率分别为102.4％、9.2.8％、98.5％，均在90％～110％之间，说明准确度良好.
(6)溶液稳定性
取供试品溶液，分别在室温下于0、1.5、4、7、11、12.5h取样检测，记录色谱图。考察芦可替尼中间体溶液的稳定性。试验结果见表7。
表7溶液稳定性实验结果
备注：杂质个数为供试品溶液中的杂质分布个数。
以上结果表明：芦可替尼中间体样品溶液室温下放置12.5h，杂质个数及总杂质含量均无明显变化，这说明芦可替尼中间体样品溶液室温放置12.5h，稳定性良好。
(7)耐用性实验
分别考察检测波长、柱温、流速、流动相的pH对本法色谱行为的影响。耐用性试验条件见表7。取系统适用性样品溶液，于表8中的条件进行检测。
表8耐用性试验条件
色谱条件 参数变化范围
波长/nm 220、222、224
柱温/℃ 38、40、42
流速/(ml/min) 0.9、1.0、1.1
流动相A的pH 2.4、2.5、2.6
结果显示：在可接受的变动条件下芦可替尼中间体与其相邻杂质峰的最小分离度为2.99大于1.5，其他杂质峰之间最小分离度为1.59，大于1.5，杂质个数及含量无明显变化。
其中流速、流动相pH值对相邻杂质的保留时间及分离度影响稍大些；柱温、和检测波长的微小变动对有关物质检测几乎没有影响。上述检测参数的微小调整，对测定结果基本不会产生显著性影响。说明本方法耐用性良好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种芦可替尼中间体中相关物质的检测方法，所述芦可替尼中间体的结构式如式(Ⅰ)所示：
其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测；
所述色谱检测条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：流动相A为pH＝2.0-4.0的磷酸二氢盐溶液，流动相B为乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
采用紫外检测，检测波长为222nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相关物质包括：4-氯吡咯并嘧啶、(4-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基)甲基特戊酸酯、1-(1-乙氧基乙基)-4-碘-1H-吡唑、1-(1-乙氧基乙基)-4-吡唑硼酸频哪醇酯、[(4-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-7-基]甲基特戊酸酯、三苯基氧化膦。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述色谱柱选自Agilent SB-C18；规格为5μm，250mm x 4.6mm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0-3min，流动相中流动相A的体积百分占比为70-90％；3-15min，流动相A的体积百分占比为30-90vt％；15-20min，流动相A的体积百分占比为10-40vt％；20-25min，流动相A的体积百分占比为10-40vt％；25-30min，流动相A的体积百分占比为10-90vt％；30-35min，流动相A的体积百分占比为70-90vt％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0-3min，流动相中流动相A的体积百分占比为80vt％；3-15min，流动相A的体积百分占比为35vt％；15-20min，流动相A的体积百分占比为15vt％；20-25min，流动相A的体积百分占比为15vt％；25-30min，流动相A的体积百分占比为80vt％；30-35min，流动相A的体积百分占比为80vt％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸二氢盐溶液为磷酸二氢钾溶液，其浓度为5-25mmol/L，用磷酸调节pH至2.0-4.0。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述流速为0.8-1.2mL/min，柱温为30-45℃，进样体积为10-20μL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制相关杂质对照品单标溶液：精密称取各相关杂质对照品，分别置于不同容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，配制成各相关杂质对照品单标溶液；
S2、配制芦可替尼中间体对照品溶液：精密称取芦可替尼中间体对照品，置于容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，得到芦可替尼中间体对照品溶液；
S3、配制线性检测溶液：精密量取各相关杂质对照品单标溶液和芦可替尼中间体对照品溶液，混合，加稀释剂进行稀释，配制成线性检测溶液，采用高效液相色谱法进行检测，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
S4、配制供试品溶液：将芦可替尼中间体供试品用稀释剂溶解，配制成供试品溶液，采用高效液相色谱法进行检测，根据线性回归方程计算样品中各相关杂质的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为甲醇。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液中芦可替尼中间体的浓度为0.2-2mg/mL。
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