CN113777186A - 一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法，该方法包括如下步骤：分别取供试品溶液和杂质对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，检测条件如下：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；检测波长为250nm～270nm；柱温为25℃～35℃；进样体积为5μL～15μL；流动相A为磷酸盐缓冲液；流动相B为乙腈；流速为0.6～1.2mL/min；洗脱方式为梯度洗脱。本发明提供的检测方法分离度好，可作为富马酸丙酚替诺福韦杂质的检测方法，对有效控制富马酸丙酚替诺福韦的质量具有重要意义。

Description

一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法。
背景技术
乙型肝炎病毒感染为世界性传染病，据世卫组织报道，全球约20亿人曾感染乙型肝炎病毒，且每年约有百万人死于乙型肝炎感染所致的肝硬化或肝衰竭。富马酸丙酚替诺福韦的开发为临床治疗乙型肝炎感染提供了新的选择。富马酸丙酚替诺福韦是GileadSciences Inc.(吉利德)开发的口服核苷转录酶抑制剂，是富马酸丙酚替诺福韦片中的活性成分，化学名为丙-2-基N-[(S)-({[(2R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基]-氧化}甲基)(苯氧基)磷酰基]-l-丙氨酸酯，(2E)-丁-2-烯二酸(2:1)，结构式如下所示：
Figure BDA0003208311500000011
药品在不同工艺条件下可能产生不同的杂质谱，药品中杂质的控制是药品研发的重要方面，也是临床毒性研究的重要指标。富马酸丙酚替诺福韦原料药在合成工艺中、贮藏与运输过程中均会产生副产物或其他降解产物，富马酸丙酚替诺福韦中杂质种类的多少及杂质含量的多少对富马酸丙酚替诺福韦的质量有重要影响。
目前，对有关于富马酸丙酚替诺福韦中杂质检测的相关报道极少，各国药典均没有富马酸丙酚替诺福韦的标准收载，富马酸丙酚替诺福韦中杂质检测方法需要自己建立。因此，提供一种分离度好的富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法对富马酸丙酚替诺福韦的质量控制具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法，所述检测方法操作简便、分离度好，可作为富马酸丙酚替诺福韦杂质的检测方法，应用于富马酸丙酚替诺福韦杂质的定性或定量研究，对有效控制富马酸丙酚替诺福韦的质量具有重要意义。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法，所述富马酸丙酚替诺福韦具有式Ⅰ结构，
Figure BDA0003208311500000021
所述检测方法为反相高效液相色谱法，包括如下步骤：
取待测的富马酸丙酚替诺福韦样品，制备供试品溶液；
制备富马酸丙酚替诺福韦杂质对照品溶液；
分别取所述供试品溶液和所述杂质对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，若所述供试品溶液色谱图中出现与所述杂质对照品溶液色谱图中相对应的一个或多个吸收峰，则判断所述富马酸丙酚替诺福韦样品中含有所述吸收峰所对应的杂质，检测条件如下：
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
采用紫外检测器进行检测，检测波长为250nm～270nm；
柱温为25℃～35℃；
进样体积为5μL～15μL；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.03mol/L；所述流动相B为乙腈；
流速为0.6～1.2mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱的条件按时间分段设定为：
0～10分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(90～100)∶(0～10)到(70～80)∶(20～30)；
10～30分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(70～80)∶(20～30)不变；
30～35分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(70～80)∶(20～30)到(40～50)∶(50～60)；
35～40分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(40～50)∶(50～60)不变；
40～40.1分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(40～50)∶(50～60)到(90～100)∶(0～10)；
40.1～45分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(90～100)∶(0～10)不变。
优选的是，所述检测条件还包括：进样温度为5～10℃。
上述任一方案中优选的是，所述色谱柱为Waters
Figure BDA0003208311500000031
Shield RP18，所述色谱柱的长度为150mm；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的至少一种。
本发明提供的富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法能够有效分离富马酸丙酚替诺福韦及富马酸丙酚替诺福韦杂质，操作简便、分离度好，可作为富马酸丙酚替诺福韦杂质的检测方法，应用于富马酸丙酚替诺福韦杂质的定性或定量研究，对有效控制富马酸丙酚替诺福韦的质量具有重要意义。
附图说明
图1为按照实施例1提供的检测方法对空白溶剂检测得到的高效液相色谱图；
图2为按照实施例1提供的检测方法对系统适用性溶液检测得到的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除另有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可以通过市场上购买或者按照本领域常规方法合成制备；所述实验试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例提供了一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法，所述富马酸丙酚替诺福韦具有式Ⅰ结构，
Figure BDA0003208311500000041
所述检测方法为反相高效液相色谱法，包括如下步骤：
取待测的富马酸丙酚替诺福韦样品，制备供试品溶液；
制备富马酸丙酚替诺福韦杂质对照品溶液；
分别取所述供试品溶液和所述杂质对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，若所述供试品溶液色谱图中出现与所述杂质对照品溶液色谱图中相对应的一个或多个吸收峰，则判断所述富马酸丙酚替诺福韦样品中含有所述吸收峰所对应的杂质，检测条件如下：
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
采用紫外检测器进行检测，检测波长为250nm～270nm；
柱温为25℃～35℃；
进样体积为5μL～15μL；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.03mol/L；所述流动相B为乙腈；
流速为0.6～1.2mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱的条件按时间分段设定为：
0～10分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(90～100)∶(0～10)到(70～80)∶(20～30)；
10～30分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(70～80)∶(20～30)不变；
30～35分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(70～80)∶(20～30)到(40～50)∶(50～60)；
35～40分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(40～50)∶(50～60)不变；
40～40.1分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(40～50)∶(50～60)到(90～100)∶(0～10)；
40.1～45分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(90～100)∶(0～10)不变。
丙酚替诺福韦具有式Ⅱ结构：
Figure BDA0003208311500000061
所述检测波长为250nm～270nm，例如检测波长可以为250nm、255nm、260nm、265nm或270nm等，丙酚替诺福韦及其中的杂质在260nm附近处有最大吸收，因此，紫外检测器的检测波长设置为250nm～270nm之间，均可进一步提高检测的准确度。
所述柱温为25℃～35℃，例如柱温可以为25℃、27℃、29℃、30℃或35℃等，柱温升高可加快分离过程，但因样品保留时间不稳将增加检测工作的麻烦，当柱温降低时，流动相黏度增加，分离过程时间会加长，会延长检测时间，因此控制柱温在25℃～35℃既可以确保检测结果的稳定性，也可以实现较快地检测富马酸丙酚替诺福韦中的杂质，优选地，柱温为30℃。
所述进样体积为5μL～15μL，例如进样体积可以为5μL、8μL、10μL、12μL、或15μL等，为了满足灵敏度要求且峰形最优，优选地，进样体积为10μL。
本发明实施例选用磷酸盐缓冲液-乙腈作为流动相，可以保证富马酸丙酚替诺福韦和相邻杂质之间以及各杂质之间分离度较好，可以达到有效分离。如果将乙腈替换为甲醇，部分杂质出峰时间会延后，分离度较差，例如杂质2与相邻色谱峰的分离度会小于1.5。
所述流速为0.6～1.2mL/min，例如流速可以为0.6mL/min、0.8mL/min、1mL/min、或1.2mL/min等，优选地，流速为1mL/min。流动相的流速较低会使得到的液相色谱图中峰会展宽，柱效降低；流动相的流速较高柱压较大，使得到的液相色谱图中各峰之间无法分开，不利于杂质的分离。
为了保证供试品溶液中含有的富马酸丙酚替诺福韦和杂质在高效液相色谱中尽可能多地检出，并且基线平滑，减少干扰，使检测结果准确、高效，本发明实施例中的洗脱方式为梯度洗脱。
本发明实施例提供的富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法能够有效分离富马酸丙酚替诺福韦及其杂质，操作简便、分析时间短、专属性强、分离度好、重复性好、准确度高、耐用性良好，可作为富马酸丙酚替诺福韦杂质的检测方法，应用于富马酸丙酚替诺福韦杂质的定性或定量研究，对有效控制富马酸丙酚替诺福韦的质量具有重要意义。
进一步地，所述检测条件还包括：进样温度为5～10℃，例如温度可以为5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃等，优选地，进样温度为5℃。
进一步地，所述色谱柱为Waters
Figure BDA0003208311500000071
Shield RP18，所述色谱柱的长度为150mm。色谱柱对富马酸丙酚替诺福韦的检测具有重要影响，如果色谱柱(例如DiamonsilC18(2)色谱柱(4.6mm×250mm，5μm))不合适，富马酸丙酚替诺福韦中主成分及其杂质的分离效果不理想，得到的峰形也并不理想。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的至少一种。
进一步地，采用pH调节剂将所述流动相A的pH值调节为4.6，所述pH调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
进一步地，所述梯度洗脱的条件按时间分段设定为：
0～10分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从98∶2到78∶22；
10～30分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在78∶22不变；
30～35分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从78∶22到45∶55；
35～40分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在45∶55不变；
40～40.1分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从45∶55到98∶2；
40.1～45分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在98∶2不变。
进一步地，所述制备供试品溶液包括如下步骤：用所述磷酸盐缓冲液-乙腈溶解所述待测的富马酸丙酚替诺福韦样品，之后加入所述磷酸盐缓冲液定量稀释成每1mL中含0.5～1.5mg(例如可以为0.5mg、1mg或1.5mg等)丙酚替诺福韦的溶液。增大溶液中丙酚替诺福韦的质量浓度，虽然不影响检出，但是，可能会增加洗脱时间；而减少溶液中丙酚替诺福韦的质量浓度，虽然也不影响检出，但是，可能会造成主峰不十分明显，不利于检测分析。
进一步地，所述富马酸丙酚替诺福韦杂质包括杂质1～4、杂质6、杂质7、杂质13～16中的至少一种：
Figure BDA0003208311500000081
应用本发明实施例提供的检测方法对富马酸丙酚替诺福韦样品进行检测，可以通过一次色谱分析快速检测出该药中是否含有以上10种杂质中的一种或多种，并通过高效液相色谱分析实现对杂质含量的检测，以达到药品质量控制的目的。该检测方法大大缩短了分析时间、操作简单、可靠、准确，是富马酸丙酚替诺福韦药物研究及生产过程质量管控的有效手段。
进一步地，所述制备富马酸丙酚替诺福韦杂质对照品溶液包括如下步骤：
用水溶解杂质1～3，用乙腈-水溶解所述杂质4、杂质6、杂质7和杂质13～16，之后加入所述磷酸盐缓冲液定量稀释成每1mL中含所述杂质1 5μg～10μg、所述杂质2 5μg～10μg、所述杂质3 2μg～4μg和所述杂质4、杂质6、杂质7、杂质13～16各1μg～2μg的溶液。增大溶液中杂质1～4、杂质6、杂质7和杂质13～16的质量浓度，虽然不影响检出，但是，可能会增加洗脱时间；而减少溶液中杂质1～4、杂质6、杂质7和杂质13～16的质量浓度，虽然也不影响检出，但是，可能会造成色谱图中杂质峰不十分明显，不利于定位分析。
进一步地，在所述制备供试品溶液步骤中，所述磷酸盐缓冲液与所述乙腈的体积比为(70～80)：(20～30)，例如体积比可以为70：30、76：24或80:20等。
进一步地，在所述制备富马酸丙酚替诺福韦杂质对照品溶液步骤中，所述乙腈与所述水的体积比为(20～50)：(50～80)，例如体积比可以为20:80、24:76、30:70、40:60或50:50等。
进一步地，所述检测方法还包括对所述富马酸丙酚替诺福韦中杂质的含量进行测定，所述测定包括如下步骤：
分别配制不同浓度的所述富马酸丙酚替诺福韦杂质的标准溶液，采用所述反相高效液相色谱法分别测定所述标准溶液的峰面积，并针对所述富马酸丙酚替诺福韦杂质绘制峰面积-浓度标准曲线；
由所述标准曲线计算出所述供试品溶液中对应杂质的浓度，并由此计算出所述富马酸丙酚替诺福韦中所述对应杂质的含量。
采用本发明实施例提供的检测方法对待测富马酸丙酚替诺福韦样品进行检测，样品中杂质检出限度要求供试品溶液色谱图中，除溶剂峰和富马酸峰外，如有杂质峰，按外标法计算含量，杂质1不得过1.00％，杂质2不得过0.50％，杂质3不得过0.30％，杂质4不得过0.25％，杂质6、杂质7、杂质13、杂质14、杂质15、杂质16均不得过0.15％，其他单个杂质按外标法以富马酸丙酚替诺福韦的峰面积计算，不得过0.10％。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考，对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
表1为富马酸丙酚替诺福韦杂质汇总表
Figure BDA0003208311500000101
Figure BDA0003208311500000111
以下实施例中，采用的仪器如下：
高效液相色谱仪：岛津HPLC-2030(紫外检测器)；分析天平：Sartorius CPA225D。
以下实施例中所用溶液：
2％氢氧化钾溶液：取氢氧化钾2g，加水100mL使溶解，摇匀，即得。
0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)：取磷酸二氢钾5.4g，加水至2000mL使溶解，用2％氢氧化钾溶液调节pH值至6.0，混匀，即得。
溶剂：0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈(体积比为76：24)。
稀释剂：0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)。
0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.6)：取磷酸二氢钾5.4g，加水至2000mL使溶解，用2％氢氧化钾溶液调节pH值至4.6，混匀，即得。
对照品贮备液(1)：分别取杂质4对照品、杂质6对照品、杂质13对照品、杂质14对照品、杂质15对照品、杂质16对照品各适量，精密称定，置于6个不同容量瓶中，分别加入适量乙腈-水(体积比为24：76)，振摇使溶解，并稀释制成每1mL约含30μg的溶液，得到杂质4对照品贮备液、杂质6对照品贮备液、杂质13对照品贮备液、杂质14对照品贮备液、杂质15对照品贮备液和杂质16对照品贮备液
对照品贮备液(2)：分别取杂质1对照品、杂质2对照品、杂质3对照品各适量，精密称定，置于3个不同容量瓶中，分别用水溶解并稀释制成每1mL约含100μg的溶液，得到杂质1对照品贮备液、杂质2对照品贮备液和杂质3对照品贮备液。
对照品贮备液(3)：取杂质7对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，加入适量乙腈-水(体积比为50：50)，振摇使溶解，并稀释制成每1mL约含杂质7 30μg的溶液，得到杂质7对照品贮备液。
以下实施例中主成分指丙酚替诺福韦。
实施例1
选取待测富马酸丙酚替诺福韦样品进行检测。
对照品溶液：分别精密量取杂质3对照品贮备液0.3mL与其余杂质对照品贮备液各0.5mL，置同一10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
系统适用性溶液：取富马酸丙酚替诺福韦对照品约22mg(约相当于丙酚替诺福韦20mg)，精密称定，置20mL量瓶中，加2mL溶剂使溶解，分别精密加入各杂质对照品贮备液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取待测富马酸丙酚替诺福韦样品约56mg(约相当于丙酚替诺福韦50mg)，精密称定，置50mL量瓶中，加5mL溶剂使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取溶剂、供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。溶剂的色谱图如图1所示，系统适用性溶液的色谱图如图2所示。其中，色谱条件包括：
色谱柱：Waters
Figure BDA0003208311500000132
Shield RP18(十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂)，150mm×4.6mm，3.5μm；
流动相包括流动相A和流动相B；
流动相A：0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.6)；流动相B:乙腈；
检测波长：260nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样温度：5℃；进样体积：10μL；
洗脱方式：梯度洗脱，以流动相的总体积为100％计，梯度洗脱的条件按时间分段设定，如表2所示。
表2
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 98 2
10 78 22
30 78 22
35 45 55
40 45 55
40.1 98 2
45 98 2
对本发明实施例得到的色谱图中的数据进行分析，结果如表3所示，主成分为丙酚替诺福韦。
表3
Figure BDA0003208311500000131
Figure BDA0003208311500000141
由图1可知，空白溶剂不干扰各杂质的测定；由表3可知，系统适用性色谱图中，出峰顺序为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质13、杂质16、杂质15、杂质14、杂质6、主成分、杂质7，采用本发明实施例提供的检测方法可以一次性将上述10种杂质全部检出，各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，符合要求，表明富马酸丙酚替诺福韦原料药中杂质检测方法专属性好。
实施例2
取待测富马酸丙酚替诺福韦样品(原料药)，采用高温、强酸、强碱、氧化、光照来加速本品的降解，以考察本发明实施例色谱条件对杂质检查的专属性。
各降解试验供试品制备方法，如表4所示。
表4
Figure BDA0003208311500000151
精密量取表4中溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。其中，色谱条件同实施例1色谱条件。对本发明实施例得到的色谱图中的数据进行分析，结果如表5和表6所示，主成分为丙酚替诺福韦。
表5
Figure BDA0003208311500000161
表6
Figure BDA0003208311500000162
各降解条件下，空白溶剂不干扰各杂质的测定，主峰与相邻杂质峰之间、各相邻杂质峰之间分离度均大于1.5，分离度良好，且主峰峰纯度合格。各降解条件下，物料平衡均在90％～110％，表明物料基本守恒。因此，本发明实施例提供的富马酸丙酚替诺福韦原料药中杂质检测方法专属性强。
实施例3
选取杂质1～4、杂质6、杂质7和杂质13～16对照品贮备液，进行逐级稀释，进行检测限与定量限检测，信噪比为10：1时为定量限，信噪比为3:1时为检测限，本实施例与实施例1色谱条件相同。
经检测可知，杂质1的定量限为0.0193μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0019％，检测限为0.0048μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0005％，符合要求；杂质2的定量限为0.0723μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0072％，检测限为0.0181μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0018％，符合要求；杂质3的定量限为0.0643μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0064％，检测限为0.0161μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0016％，符合要求；杂质4的定量限为0.0689μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0069％，检测限为0.0172μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0017％，符合要求；杂质13的定量限为0.4522μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0452％，检测限为0.1131μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0113％，符合要求；杂质16的定量限为0.3592μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0359％，检测限为0.0898μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0090％，符合要求；杂质15的定量限为0.7428μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0743％，检测限为0.1857μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0186％，符合要求；杂质14的定量限为0.4502μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0450％，检测限为0.1126μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0113％，符合要求；杂质6的定量限为0.3991μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0399％，检测限为0.0998μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0100％，符合要求；杂质7的定量限为0.1146μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0115％，检测限为0.0286μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.0029％，符合要求。
综上所述，杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质13、杂质16、杂质15、杂质14、杂质6、杂质7的定量限和检测限浓度均远低于限度浓度，说明富马酸丙酚替诺福韦原料药中杂质检测方法检测灵敏度满足要求。
实施例4
对照品溶液：与实施例1中对照品溶液相同。
供试品溶液：与实施例1中供试品溶液相同。
将对照品溶液和供试品溶液于室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12、21小时精密量取10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，考察稳定性，其中，色谱条件同实施例1色谱条件。
经检测可知，对照品溶液中：杂质1的保留时间RSD为0.88％，杂质2的保留时间RSD为0.35％，杂质3的保留时间RSD为0.13％，杂质4的保留时间RSD为0.10％，杂质13的保留时间RSD为0.19％和0.23％，杂质16的保留时间RSD为0.26％和0.30％，杂质15的保留时间RSD为0.16％，杂质14的保留时间RSD为0.45％和0.49％，杂质6的保留时间RSD为0.61％，杂质7的保留时间RSD为0.12％。
对照品溶液中：杂质1的峰面积RSD为0.22％，杂质2的峰面积RSD为0.35％，杂质3的峰面积RSD为0.14％，杂质4的峰面积RSD为0.61％，杂质13的峰面积RSD为0.58％，杂质16的峰面积RSD为0.37％，杂质15的峰面积RSD为0.98％，杂质14的峰面积RSD为1.22％，杂质6的峰面积RSD为1.31％，杂质7的峰面积RSD为0.61％。
对照品溶液中，各杂质对照品溶液于室温下放置21小时，保留时间与峰面积RSD值均小于2.0％，均符合要求；供试品溶液于室温下放置21小时，各杂质检出情况基本一致，说明对照品溶液和供试品溶液于室温下放置21小时稳定。
实施例5
分别配制杂质1～4、杂质6、杂质7和杂质13～16定量限浓度以及200％、100％、50％、20％限度浓度(相对于供试品溶液)的标准溶液，进行线性关系检测。
精密量取上述标准溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度(C)为横坐标(X轴)，以峰面积(A)为纵坐标(Y轴)，进行线性回归分析。其中，色谱条件同实施例1色谱条件。
经检测可知，杂质1在0.021μg/mL～20.514μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝32402.0443x-2344.1741，相关系数r为0.9995，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质2在0.073μg/mL～9.792μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝15700.9365x-1117.3363，相关系数r为0.9996，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质3在0.070μg/mL～6.270μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝19985.9146x-519.6227，相关系数r为0.9995，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质4在0.072μg/mL～5.425μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝3214.4226x-20.2915，相关系数r为0.9980，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质6在0.404μg/mL～3.510μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝10960.6085x-289.9412，相关系数r为0.9998，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质7在0.119μg/mL～4.02μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝20712.9796x-28.0670，相关系数r为0.9999，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质13在0.461μg/mL～3.000μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝20816.7477x+180.8303，相关系数r为0.9999，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质14在0.459μg/mL～3.090μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝19919.9774x-429.3884，相关系数r为0.9999，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质15在0.746μg/mL～3.180μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝15888.0065x+6.1563，相关系数r为1.0000，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
杂质16在0.350μg/mL～3.043μg/mL(定量限～200％限度浓度)浓度范围内，线性方程为y＝14947.3880x+32.7596，相关系数r为0.9999，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
实施例6
对照品溶液：与实施例1中对照品溶液相同。
精密量取10μL对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，其中，色谱条件同实施例1色谱条件。
经检测可知，杂质1的保留时间RSD为0.91％，杂质2的保留时间RSD为0.33％，杂质3的保留时间RSD为0.06％，杂质4的保留时间RSD为0.04％，杂质13的保留时间RSD为0.17％和0.20％，杂质16的保留时间RSD为0.22％和0.25％，杂质15的保留时间RSD为0.31％，杂质14的保留时间RSD为0.35％和0.38％，杂质6的保留时间RSD为0.50％，杂质7的保留时间RSD为0.11％。
杂质1的峰面积RSD为0.05％，杂质2的峰面积RSD为0.69％，杂质3的峰面积RSD为0.17％，杂质4的峰面积RSD为0.39％，杂质13的峰面积RSD为0.61％，杂质16的峰面积RSD为0.31％，杂质15的峰面积RSD为0.74％，杂质14的峰面积RSD为0.48％，杂质6的峰面积RSD为1.18％，杂质7的峰面积RSD为0.61％。
由上述结果可知，各杂质保留时间与峰面积的RSD值均小于2.0％，表明仪器进样精密度良好。
实施例7
对照品溶液：与实施例1中对照品溶液相同。
供试品溶液：配制方法与实施例1中供试品溶液配制方法相同，平行配制6份。
精密量取供试品溶液、对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。其中，色谱条件与实施例1色谱条件相同。对本发明实施例得到的色谱图中的数据进行分析，结果如表7和表8所示，按峰面积归一化法计算各杂质含量。
表7
Figure BDA0003208311500000211
表8
Figure BDA0003208311500000212
由表7和表8可知，对6份供试品溶液进行检测，各杂质检出情况基本一致，总杂含量基本一致，RSD值为0.50％，小于2％，表明富马酸丙酚替诺福韦原料药中杂质检测方法重复性良好。
实施例8
供试品溶液：取富马酸丙酚替诺福韦约11.21mg，精密称定，置10mL量瓶中，加1mL溶剂使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
100％回收率溶液：向供试品溶液中加入适量各杂质，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，平行配制3份。
精密量取100％回收率溶液10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。其中，色谱条件与实施例1色谱条件相同。对本发明实施例得到的色谱图中的数据进行分析，结果如表9～表18所示。
表9杂质1回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000221
表10杂质2回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000222
表11杂质3回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000223
表12杂质4回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000224
表13杂质6回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000231
表14杂质7回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000232
表15杂质13回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000233
表16杂质14回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000234
表17杂质15回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000235
表18杂质16回收率考察结果
Figure BDA0003208311500000236
由表9～18可知，杂质1～杂质4、杂质6、杂质7和杂质13～杂质16的回收率均在98％～103％范围内，RSD小于2.0％，表明富马酸丙酚替诺福韦原料药中杂质的检测方法准确度良好。
实施例9
本发明实施例考察在柱温变化±5℃、流速变化±0.2ml/分钟、检测波长变化±5nm、流动相(pH值+0.2/未调pH)及色谱柱(不同批次色谱柱)的微小变化时，富马酸丙酚替诺福韦原料药中杂质的检测方法的耐用性。
对照品溶液：与实施例1中对照品溶液相同。
系统适用性溶液：与实施例1中系统适用性溶液相同。
供试品溶液：与实施例1中供试品溶液相同。
精密量取供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中，色谱条件如表19所示。
表19
Figure BDA0003208311500000241
Figure BDA0003208311500000251
对色谱条件进行微小变化时(柱温变化±5℃、流速变化±0.2ml/分钟、检测波长变化±5nm、流动相(pH值+0.2/未调pH)及色谱柱(不同批次色谱柱))，系统适用性溶液及供试品溶液中，各相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，系统适用性良好，说明富马酸丙酚替诺福韦原料药中杂质检测方法耐用性良好。
对比例1
系统适用性溶液：与实施例1中系统适用性溶液相同。
精密量取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。其中，色谱条件与实施例1色谱条件基本相同，不同之处在于梯度洗脱程序不同，梯度洗脱程序如表20所示。
表20
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
15 60 40
35 30 70
40 30 70
43 98 2
45 98 2
采用本对比例提供的检测方法，杂质4、杂质13与相邻色谱峰的分离度均小于1.5，分离效果较差。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种富马酸丙酚替诺福韦中杂质的检测方法，其特征在于，所述富马酸丙酚替诺福韦具有式Ⅰ结构，
Figure FDA0003208311490000011
所述检测方法为反相高效液相色谱法，包括如下步骤：
取待测的富马酸丙酚替诺福韦样品，制备供试品溶液；
制备富马酸丙酚替诺福韦杂质对照品溶液；
分别取所述供试品溶液和所述杂质对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，若所述供试品溶液色谱图中出现与所述杂质对照品溶液色谱图中相对应的一个或多个吸收峰，则判断所述富马酸丙酚替诺福韦样品中含有所述吸收峰所对应的杂质，检测条件如下：
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
采用紫外检测器进行检测，检测波长为250nm～270nm；
柱温为25℃～35℃；
进样体积为5μL～15μL；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.03mol/L；所述流动相B为乙腈；
流速为0.6～1.2mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱的条件按时间分段设定为：
0～10分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(90～100)∶(0～10)到(70～80)∶(20～30)；
10～30分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(70～80)∶(20～30)不变；
30～35分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(70～80)∶(20～30)到(40～50)∶(50～60)；
35～40分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(40～50)∶(50～60)不变；
40～40.1分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从(40～50)∶(50～60)到(90～100)∶(0～10)；
40.1～45分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在(90～100)∶(0～10)不变。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测条件还包括：
进样温度为5～10℃。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters
Figure FDA0003208311490000021
Shield RP18，所述色谱柱的长度为150mm；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件按时间分段设定为：
0～10分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从98∶2到78∶22；
10～30分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在78∶22不变；
30～35分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从78∶22到45∶55；
35～40分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在45∶55不变；
40～40.1分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比从45∶55到98∶2；
40.1～45分钟，所述流动相A和所述流动相B的体积比保持在98∶2不变。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述制备供试品溶液包括如下步骤：
用所述磷酸盐缓冲液-乙腈溶解所述待测的富马酸丙酚替诺福韦样品，之后加入所述磷酸盐缓冲液定量稀释成每1mL中含0.5～1.5mg丙酚替诺福韦的溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述富马酸丙酚替诺福韦杂质包括杂质1～4、杂质6、杂质7、杂质13～16中的至少一种：
Figure FDA0003208311490000031
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述制备富马酸丙酚替诺福韦杂质对照品溶液包括如下步骤：
用水溶解杂质1～3，用乙腈-水溶解所述杂质4、杂质6、杂质7和杂质13～16，之后加入所述磷酸盐缓冲液定量稀释成每1mL中含所述杂质1 5μg～10μg、所述杂质2 5μg～10μg、所述杂质3 2μg～4μg和所述杂质4、杂质6、杂质7、杂质13～16各1μg～2μg的溶液。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在所述制备供试品溶液步骤中：
所述磷酸盐缓冲液与所述乙腈的体积比为(70～80)：(20～30)。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，在所述制备富马酸丙酚替诺福韦杂质对照品溶液步骤中：
所述乙腈与所述水的体积比为(20～50)：(50～80)。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括对所述富马酸丙酚替诺福韦中杂质的含量进行测定，所述测定包括如下步骤：
分别配制不同浓度的所述富马酸丙酚替诺福韦杂质的标准溶液，采用所述反相高效液相色谱法分别测定所述标准溶液的峰面积，并针对所述富马酸丙酚替诺福韦杂质绘制峰面积-浓度标准曲线；
由所述标准曲线计算出所述供试品溶液中对应杂质的浓度，并由此计算出所述富马酸丙酚替诺福韦中所述对应杂质的含量。
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