CN116953129B - 高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生中十二种杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药检测的技术领域，具体涉及高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法。本发明所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，包括以下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲液与乙腈混和溶液为溶剂。对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液的制备；分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用外标法计算杂质含量。本发明提供的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，杂质分离度高，灵敏度高、重现性好，有效控制富马酸伏诺拉生的质量。
Description
技术领域
本发明属于医药检测的技术领域，具体涉及高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法。
背景技术
反流性食管炎是一种常见的消化系统慢性、进展性疾病，在中国普通人群中的患病率高达6.4%，其病因是胃内容物反流到食管及以上所引起的反流、烧心，同时存在食管黏膜的糜烂，严重影响患者生活和睡眠质量；更为严重的是，持续或未治疗的慢性食管酸暴露还可导致食管的解剖结构改变，进而导致食管溃疡、食管狭窄、食管出血、巴雷特食管甚至食管腺癌等多种并发症，进一步降低患者生活质量、影响患者心理，加重治疗负担。
富马酸伏诺拉生片是国内首个获批的钾离子竞争性酸阻滞剂（P-CAB），通过阻断H+，K+-ATP酶的K+通道，竞争性阻滞K+与该酶的结合，可长时间停留于胃壁细胞，从而快速抑制胃酸的分泌。《2020年中国胃食管反流病专家共识》推荐治疗反流性食管炎（RE）的首选药物为质子泵抑制剂（PPI）和富马酸伏诺拉生，与PPI药物相比，富马酸伏诺拉生具有持久抑酸、起效迅速、方便服用、治疗疗程短等优点。
在原料药富马酸伏诺拉生合成制备过程中，存在多种杂质，包括工艺杂质、降解杂质等，均需要进行严格控制，比如以下：杂质A（5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-基磺酰基)-1H-吡吡咯-3-甲醛）、杂质B（5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-基磺酰基)-1H-吡吡咯-3-甲醇）、杂质C（1-(5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-基)-N-甲基甲胺）、杂质D（5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛）、杂质F（3-((4-(二甲氧基甲基)-2-(2-氟苯基)-1H-吡咯-1-基)磺酰基)-吡啶）、杂质G（N,N-二((5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-甲基)甲胺）、杂质H（N-甲基-1-(5-苯基-1-(吡啶-3-基-磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-甲胺）、杂质I（1-(5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-基-磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N,N-二甲基甲胺）、杂质J（N-(5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-基-磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-甲基)-N-甲基天冬氨酸）、杂质K（5-((2-(2-氟苯基)-4-((甲氨基)-甲基)-1-吡咯-1-基)-磺酰基)-1,2,3,4-四氢吡啶-2-醇）、杂质L（1-(5-(2-氟苯基)-1-(1,4,5,6-四氢吡啶-3-基-磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-甲基甲胺）、杂质M（1-(5-(2-氟苯基)-1-(1,6-二氢吡啶-3-基-磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-甲基甲胺）。
富马酸伏诺拉生未被药典等收载，在合成过程中涉及杂质较多，因此，开发一种快速、简单且准确检测富马酸伏诺拉生有关物质的方法，对其质量控制具有非常重要的意义。
在中国药事，2022年7月第36卷第7期发表的“超高效液相色谱法测定富马酸伏诺拉生原料有关物质（赵静芝，宿亮，朱婧，朱跃芳等）”，采用ZORBAXSB-C18色谱柱（4.6mm×150mm，1.8μm），流动相A为0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）-甲醇-乙腈（14:5:1），流动相B为0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液，柱温30℃，检测波长230nm，进样量20μL，检测了杂质C17H17N3O2S、C16H14FN3O2S、C22H19FN4O4S2、C12H13FN2、C21H20FN3O6S、C17H16FN3O2S、C33H27F2N5O4S2、C17H16FN3O3S、C17H18FN3O2S、C17H20FN3O3S、C17H20FN3O2S，专属性强，准确度高，检测速度快。虽然此方法可以检测杂质H、杂质C、杂质J、杂质G、杂质M、杂质K，但是其流动相pH为6.0，难以检测出对pH敏感度较高的杂质D和杂质I，并且其杂质峰易重合，对于分子量较小的杂质难以检测出。
CN113390983A公开了一种同时测定富马酸伏诺拉生中3种杂质的检测方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱，在260nm检测波长，25～45℃柱温，0.8～1.2mL/min流速条件下，以0.02～0.05mol/L磷酸氢二钾或磷酸二氢钾溶液作为流动相A，以乙腈作为流动相B，在梯度洗脱条件下进行检测。检测方法中吡啶-3-磺酸甲酯、吡啶-3-磺酸乙酯的定量限为0.001～0.002%，检测限为0.0004～0.0007%；吡啶-3-磺酸定量限为0.08～0.10%，检测限为0.004～0.005%。此方法采用流动相B乙腈，洗脱时间短，杂质不能完全冲出，难以同时检测出多种杂质。
CN115656360A公开了一种富马酸伏诺拉生中间体的质量控制方法，其中四种杂质为如下所示：，采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充相的色谱柱，检测器为紫外吸收检测器，检测波长为225～235nm，柱温为35～45℃，流动相流速为0.5～1.0mL/min，流动相A为三氟乙酸水溶液；流动相B为乙腈-四氢呋喃混合溶液，采用梯度洗脱，提高了构造异构体之间的分离能力并改善峰型，实现对富马酸伏诺拉生中间体中各杂质的高灵敏、高准确性地定性定量研究。采用此方法能检测出较少的异构体类，难以同时检测出多种杂质，并且采用的流动相三氟乙酸及四氢呋喃对人体刺激较大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，杂质分离度高，简便快捷、灵敏度高、重现性好，有效控制富马酸伏诺拉生的质量。
本发明所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，包括以下步骤：
（1）色谱条件：
检测器：PDA或紫外检测器；
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：230~250nm；
柱温：25~35℃；
流动相：以磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐浓度为0.0225~0.0275mmol/L，其制备方法为取磷酸二氢钾3.06~3.74g和磷酸氢二钠8.05~9.83g，加水溶解并稀释，用磷酸调节pH值至6.5；优选取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释，用磷酸调节pH值。
流速：0.7~0.9mL/min；优选为0.8mL/min。
进样体积：10μL。
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为70:30~75:25的溶液；磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释制得的。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释，作为对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释作为供试品溶液；
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解，精密加入对照品溶液并稀释，作为系统适用性溶液；
（5）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用外标法计算供试品溶液中的杂质含量及其他未知杂质含量。
步骤（5）的供试品溶液的色谱图中，确定所得供试品溶液中与十二种杂质保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M均不超过0.1%；其他未知杂质按主成分外标法计算，单个杂质都不超过0.10%，杂质总量不超过1.0%。
色谱条件中的洗脱梯度程序，如表1所示为：
表1 洗脱程序
步骤（2）的对照品溶液中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M的浓度为1.5μg/mL。
步骤（3）的供试品溶液中富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL。
步骤（4）的系统适用性溶液中富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M的浓度为1.5μg/mL。
色谱柱为SHIMADZU Shim-pack GIST C18，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5µm。
具体的，本发明所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，包括以下步骤：
（1）色谱条件：
检测器：PDA或紫外检测器；
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：230~250nm；
柱温：25~35℃；
流动相：以磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐浓度为0.0225~0.0275mmol/L，其制备方法为取磷酸二氢钾3.06~3.74g和磷酸氢二钠8.05~9.83g，加水溶解并稀释，用磷酸调节pH值至6.5。
流速：0.7~0.9mL/min；优选为0.8mL/min。
进样体积：10μL。
溶剂：将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的磷酸盐缓冲液，然后将磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为70:30~75:25混合。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释成浓度为1.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释呈浓度为1.5mg/mL溶液，作为供试品溶液；
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液；
（5）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用外标法计算供试品溶液中的杂质含量及其他未知杂质含量。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
（1）本发明的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，设置梯度洗脱程序，协同磷酸盐缓冲液和有机相乙腈比例混合作为溶剂，不干扰待测杂质出峰，且在此溶剂中杂质稳定，重复性好。
（2）本发明的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，简洁方便、分析速度快、灵敏度高、分离度好、检测杂质种类多，可以准确定量检测富马酸伏诺拉生中的多种杂质，专属性好，从而客观、准确、全面的评价富马酸伏诺拉生的质量，对产品的质量控制具有重要的现实意义。
附图说明
图1为实施例1中溶剂的HPLC色谱图。
图2为实施例1中系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图3为实施例1中供试品溶液的HPLC色谱图。
图4为对比例1中对照品溶液的HPLC色谱图。
图5为对比例1中供试品溶液的HPLC色谱图。
图6为对比例2中系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图7为对比例3中系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图8为对比例4中系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图9为对比例5中系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图10为实施例2中系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图11为实施例3中低流速-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图12为实施例3中低流速-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图13为实施例3中低流速-供试品溶液的HPLC色谱图。
图14为实施例4中高流速-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图15为实施例4中高流速-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图16为实施例4中高流速-供试品溶液的HPLC色谱图。
图17为实施例5中低柱温-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图18为实施例5中低柱温-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图19为实施例5中低柱温-供试品溶液的HPLC色谱图。
图20为实施例6中高柱温-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图21为实施例6中高柱温-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图22为实施例6中高柱温-供试品溶液的HPLC色谱图。
图23为实施例7中低浓度盐-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图24为实施例7中低浓度盐-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图25为实施例7中低浓度盐-供试品溶液的HPLC色谱图。
图26为实施例8中高浓度盐-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图27为实施例8中高浓度盐-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图28为实施例8中高浓度盐-供试品溶液的HPLC色谱图。
图29为对比例6中高pH-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图30为对比例6中高pH-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图31为对比例7中低pH-溶剂溶液的HPLC色谱图。
图32为对比例7中低pH-系统适用性溶液的HPLC色谱图。
图33为实施例9中连续6针平行定量限溶液的HPLC色谱图。
图34为实施例9中连续3针平行检测限溶液、连续3针平行溶剂的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生中十二种杂质的方法，包括以下步骤：
（1）色谱条件：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水2000mL溶解并稀释，用磷酸调节pH值至6.5。
梯度程序如表2所示。
表2 洗脱梯度
流速：0.8mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为75:25的溶液；
0.025mol/L磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释成浓度为1.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释呈浓度为1.50mg/mL溶液，作为供试品溶液。
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（5）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、自身对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本实施例溶剂的HPLC色谱图如图1所示，溶剂峰不干扰本发明的检测。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图2所示，由图2可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表3所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.542，已知杂质间最小分离度为1.453，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图3所示，由图3可以看出，供试品溶液中含有杂质L、杂质J、杂质I及其他未知单杂，所示的峰面积的数据表格如表4所示。采用外标法进行计算，杂质L的含量为0.04%，杂质J的含量为0.04%，杂质I的含量为0.03%，其他单杂的含量为0.05%，总杂的含量为0.2%。
表3 实施例1系统适用性溶液峰表
表4 实施例1供试品溶液峰表
对比例1
（1）色谱条件：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比30:60:10混合为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表5所示。
表5 洗脱程序
流速：1.0mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：流动相A。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释成浓度为1.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释呈浓度为1.5mg/mL溶液，作为供试品溶液。
（5）测定方法：
分别精密量取对照品溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本对比例对照品溶液的HPLC色谱图如图4所示，由图4可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、杂质J、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表6所示。其中，已知杂质间最小分离度为1.420，大于1.2。本对比例供试品溶液的HPLC色谱图由图5及数据表格表7所示，供试品溶液中杂质D出峰38.762min，其前面有未知峰与杂质D分离度为0.743，未完全分离，供试品溶液中未知峰干扰杂质D测定，说明此对比例不适用于本品中杂质测定。
表6 对比例1对照品溶液峰表
表7 对比例1供试品溶液峰表
对比例2
（1）色谱条件：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.05mol/L磷酸盐缓冲盐为流动相A，以乙腈-甲醇（20：15）为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表8所示。
表8 洗脱程序
流速：1.0mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：乙腈：水（25:75）。
（2）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（3）测定方法：
精密量取系统适用性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
本对比例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图6所示，由图6可以看出，杂质K、杂质C、杂质J、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表9所示。其中，杂质J、杂质L和杂质M在本对比例中并未完全分离，分离度均小于1.2，影响样品中杂质测定，此对比例不适用于本品杂质测定。
表9 对比例2系统适用性溶液峰表
对比例3
（1）色谱条件：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表10所示。
表10 洗脱程序
流速：1.0mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：乙腈：水（25:75）。
（2）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（3）测定方法：
精密量取系统适用性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
本对比例的系统适用性溶液的HPLC色谱图如图7所示，由图7可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、杂质J、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质I、杂质D、杂质A、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表11所示。其中，富马酸伏诺拉生与相邻杂质的分离度为0.924，杂质C与相邻杂质峰分离度为0.264，均小于1.2，本对比例不适用于本品各杂质测定。
表11 对比例3系统适用性溶液峰表
对比例4
（1）色谱条件：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表12所示。
表12 洗脱程序
流速：0.8mL/min；
进样体积：20μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为75:25的溶液；
0.025mol/L磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的。
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（5）测定方法：
分别精密量取系统适用性溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本对比例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图8所示，由图8可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、杂质J、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表13所示。其中，杂质J与富马酸伏诺拉生峰之间的分离度为1.186，小于1.2，且由图可看出，杂质J与富马酸伏诺拉生峰之间并未基线分离，此对比例无法准确测定本品中各杂质。
表13 对比例4系统适用性溶液峰表
对比例5
（1）色谱条件：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表14所示。
表14 洗脱程序
流速：0.8mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为75:25的溶液；
0.025mol/L磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的。
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（5）测定方法：
精密量取系统适用性溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本对比例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图9所示，由图9可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、杂质J、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表6所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.513，已知杂质间最小分离度为1.416，大于1.2。说明本对比例的方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，但如图9所示，在210nm处测定，基线波动较大，尤其在40min～60min，不适用于本品各杂质测定。
表15 对比例5系统适用性溶液峰表
实施例2
本实施例与对比例5完全相同，其不同之处在于将步骤（1）中的波长210nm替换为250nm。进行测定后，记录色谱图。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图10所示，由图10可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、杂质J、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表16所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.497，已知杂质间最小分离度为1.479，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
表16 实施例2系统适用性溶液峰表
实施例3
（1）色谱条件：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表17所示。
表17 洗脱程序
流速：0.7mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为75:25的溶液；
0.025mol/L磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释成浓度为1.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释呈浓度为1.50mg/mL溶液，作为供试品溶液。
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（5）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、自身对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本实施例溶剂的HPLC色谱图如图11所示，溶剂峰不干扰本发明的检测。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图12所示，由图12可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表18所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.649，已知杂质间最小分离度为1.505，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图13所示，由图13可以看出，供试品溶液中含有杂质L、杂质J、杂质I及其他未知单杂，所示的峰面积的数据表格如表19所示。采用外标法进行计算，杂质L的含量为0.03%，杂质J的含量为0.04%，杂质I的含量为0.03%，其他单杂的含量为0.05%，总杂的含量为0.2%。
表18 实施例3系统适用性溶液峰表
表19 实施例3供试品溶液峰表
实施例4
本实施例与实施例3完全相同，其不同之处在于将步骤（1）中的流速0.7mL/min替换为0.9mL/min。进行测定后，记录色谱图。
本实施例溶剂的HPLC色谱图如图14所示，溶剂峰不干扰本发明的检测。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图15所示，由图15可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表20所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.530，已知杂质间最小分离度为1.433，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图16所示，由图16可以看出，供试品溶液中含有杂质L、杂质J、杂质I及其他未知单杂，所示的峰面积的数据表格如表21所示。采用外标法进行计算，杂质L的含量为0.04%，杂质J的含量为0.04%，杂质I的含量为0.03%，其他单杂的含量为0.05%，总杂的含量为0.2%。
表20 实施例4系统适用性溶液峰表
表21 实施例4供试品溶液峰表
实施例5
所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生中十二种杂质的方法，包括以下步骤：
检测器：紫外检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：25℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表22所示。
表22 洗脱程序
流速：0.8mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为70:30的溶液；
0.025mol/L磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释成浓度为1.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释呈浓度为1.50mg/mL溶液，作为供试品溶液。
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（5）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、自身对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本实施例溶剂的HPLC色谱图如图17所示，溶剂峰不干扰本发明的检测。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图18所示，由图18可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表23所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.503，已知杂质间最小分离度为1.535，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图19所示，由图19可以看出，供试品溶液中含有杂质L、杂质J、杂质I及其他未知单杂，所示的峰面积的数据表格如表24所示。采用外标法进行计算，杂质L的含量为0.04%，杂质J的含量为0.04%，杂质I的含量为0.03%，其他单杂的含量为0.05%，总杂的含量为0.2%。
表23 实施例5系统适用性溶液峰表
表24 实施例5供试品溶液峰表
实施例6
本实施例与实施例5完全相同，其不同之处在于将步骤（1）中的柱温25℃替换为35℃。进行测定后，记录色谱图。
本实施例溶剂的HPLC色谱图如图20所示，溶剂峰不干扰本发明的检测。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图21所示，由图21可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表25所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.675，已知杂质间最小分离度为1.416，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图22所示，由图22可以看出，供试品溶液中含有杂质L、杂质J、杂质I及其他未知单杂，所示的峰面积的数据表格如表26所示。采用外标法进行计算，杂质L的含量为0.04%，杂质J的含量为0.04%，杂质I的含量为0.03%，其他单杂的含量为0.05%，总杂的含量为0.2%。
表25 实施例6系统适用性溶液峰表
表26 实施例6供试品溶液峰表
实施例7
所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生中十二种杂质的方法，包括以下步骤：
（1）色谱条件：
检测器：紫外检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.0225mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.06g和磷酸氢二钠8.05g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。
洗脱梯度程序如表27所示。
表27 洗脱程序
流速：0.8mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为75:25的溶液；
0.025mol/L磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释成浓度为1.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释呈浓度为1.50mg/mL溶液，作为供试品溶液。
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（5）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本实施例溶剂的HPLC色谱图如图23所示，溶剂峰不干扰本发明的检测。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图24所示，由图24可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表28所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.519，已知杂质间最小分离度为1.358，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图25所示，由图25可以看出，供试品溶液中含有杂质L、杂质J、杂质I及其他未知单杂，所示的峰面积的数据表格如表29所示。采用外标法进行计算，杂质L的含量为0.03%，杂质J的含量为0.03%，杂质I的含量为0.02%，其他单杂的含量为0.04%，总杂的含量为0.2%。
表28 实施例7系统适用性溶液峰表
表29 实施例7供试品溶液峰表
实施例8
本实施例与实施例7完全相同，其不同之处在于将步骤（1）中的流动相替换为：以0.0275mmol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.74和磷酸氢二钠9.83g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.5。进行测定后，记录色谱图。
本实施例溶剂的HPLC色谱图如图26所示，溶剂峰不干扰本发明的检测。
本实施例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图27所示，由图27可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质I、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表30所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.594，已知杂质间最小分离度为1.408，大于1.2。说明本发明方法中主峰与相邻杂质，各杂质之间能实现良好分离，从而更准确的评价产品质量。
本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图28所示，由图28可以看出，供试品溶液中含有杂质L、杂质J、杂质I及其他未知单杂，所示的峰面积的数据表格如表31所示。采用外标法进行计算，杂质L的含量为0.03%，杂质J的含量为0.03%，杂质I的含量为0.03%，其他单杂的含量为0.04%，总杂的含量为0.2%。
表30 实施例8系统适用性溶液峰表
表31 实施例8供试品溶液峰表
对比例6
所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生中十二种杂质的方法，包括以下步骤：
（1）色谱条件：
检测器：紫外检测器；
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18，规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流动相：以0.025mol/L磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐制备方法为取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钠8.94g，加水溶解并稀释至2000mL，用磷酸调节pH值至6.7。
洗脱梯度程序如表32所示。
表32 洗脱程序
流速：0.8mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为75:25的溶液；
0.025mol/L磷酸盐缓冲液是将3.40g磷酸二氢钾和8.94g磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释至2000mL制得的。
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释成浓度为1.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
（3）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，溶于溶剂，精密加入对照品溶液并用溶剂稀释为富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，各杂质浓度为1.5μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。
（4）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、自身对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本对比例溶剂的HPLC色谱图如图29所示，溶剂峰不干扰检测。
本对比例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图30所示，由图30可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质D、杂质B、杂质I、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表33所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.807，已知杂质间最小分离度为1.400，大于1.2，但杂质D与杂质I保留时间漂移，杂质I出峰在杂质B后，杂质D保留时间提前，且与实施例1条件下杂质D出峰前一个未知杂质峰重合，说明本对比例的方法中pH上调0.2会影响杂质D与杂质I出峰，该方法不适用。
表33 对比例6系统适用性溶液峰表
对比例7
本对比例与实施例3完全相同，其不同之处在于将步骤（1）中的流动相中的磷酸盐缓冲盐用磷酸调节pH值至6.3。进行测定后，记录色谱图。
本对比例溶剂的HPLC色谱图如图31所示，溶剂峰不干扰检测。
本对比例系统适用性溶液的HPLC色谱图如图32所示，由图32可以看出，杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质I、杂质D、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表34所示。其中，富马酸伏诺拉生与杂质H之间的分离度为4.334，已知杂质间最小分离度为1.342，大于1.2，但杂质I出峰提前，且与杂质D前一个未知杂质峰重合，说明本对比例的方法中pH下调0.2会影响杂质I出峰，该方法不适用。
表34 对比例7系统适用性溶液峰表
实施例9
本发明的方法的定量限和检测限的测定，测定步骤为：
（1）色谱条件与实施例1完全相同；
（2）定量限溶液制备：
精密称取富马酸伏诺拉生、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L和杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释制成每1mL中含富马酸伏诺拉生、杂质B、杂质C、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M各0.15μg，杂质A、杂质D各0.1μg的溶液，作为定量限溶液。
（3）检测限溶液制备：
精密称取富马酸伏诺拉生、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L和杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释制成每1mL中含富马酸伏诺拉生、杂质B、杂质C、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M各0.05μg，杂质A、杂质D各0.03μg的溶液，作为检测限溶液。
（4）测定方法：
分别精密量取溶剂、定量限溶液、检测限溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
本实施例溶剂如图34所示，图34中从上到下，分别为3针平行检测限溶液的色谱图、连续3针平行溶剂的色谱图，不干扰本发明的检测。
本实施例定量限溶液的HPLC色谱图如图33所示，由图33可以看出，连续6针定量限溶液中杂质K、杂质C、杂质L、杂质M、富马酸伏诺拉生、杂质H、杂质I、杂质D、杂质B、杂质A、杂质F、杂质G依次出峰，定量限数据如表35所示，各杂质定量限浓度均低于限度浓度，峰面积RSD均小于10.0%，S/N均大于10。
本实施例检测限溶液的HPLC色谱图如图34所示，检测限数据如表36所示，S/N均大于3，说明本方法灵敏度较高，能够满足各杂质检测要求。
表35 定量限的测定结果
表36 检测限的测定结果
由以上可以看出，本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，设置合理的梯度洗脱程序，采用缓冲盐和有机相比例混合作为溶剂，不干扰待测杂质出峰，且在此溶剂中杂质稳定，重复性好，准确定量检测富马酸伏诺拉生中的多种杂质，专属性好，从而客观、准确、全面的评价富马酸伏诺拉生的质量，对产品的质量控制具有重要的现实意义。
Claims (4)
1.一种高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）色谱条件：
检测器：PDA或紫外检测器；
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱为SHIMADZU Shim-pack GISTC18，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5µm；
检测波长：230~250nm；
柱温：25~35℃；
流动相：以磷酸盐缓冲盐、乙腈、甲醇按照体积比70:5:25混合为流动相A，以甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲盐浓度为0.0225~0.0275mmol/L，其制备方法为取磷酸二氢钾3.06~3.74g和磷酸氢二钠8.05~9.83g，加水溶解并稀释，用磷酸调节pH值至6.5；
流速：0.7~0.9mL/min；
进样体积：10μL；
溶剂：0.025mol/L的磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为70:30~75:25的溶液；
溶剂中的磷酸盐缓冲液是将磷酸二氢钾和磷酸氢二钠混合，加水溶解并稀释制得的；
（2）对照品溶液的制备：
精密称取富马酸伏诺拉生标准品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，加溶剂溶解并稀释，作为对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解并稀释作为供试品溶液；
（4）系统适用性溶液的制备：
精密称定富马酸伏诺拉生，加溶剂溶解，精密加入对照品溶液并稀释，作为系统适用性溶液；
（5）测定方法：
分别精密量取溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用外标法计算供试品溶液中的杂质含量及其他未知杂质含量；
步骤（5）的供试品溶液的色谱图中，确定所得供试品溶液中与十二种杂质保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M均不超过0.1%；其他未知杂质按主成分外标法计算，单个杂质都不超过0.10%，杂质总量不超过1.0%。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，其特征在于：步骤（2）的对照品溶液中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M的浓度为1.5μg/mL。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，其特征在于：步骤（3）的供试品溶液中富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法同时测定富马酸伏诺拉生十二种杂质的方法，其特征在于：步骤（4）的系统适用性溶液中富马酸伏诺拉生浓度为1.5mg/mL，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M的浓度为1.5μg/mL。
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