CN115184486B - 一种高效液相色谱法检测磷酸二氨基吡啶有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用高效液相色谱法检测磷酸二氨基吡啶有关物质的方法,该方法包括以下步骤:a.取磷酸二氨基吡啶供试品,用水、流动相或有机溶剂的水溶液1,配置成含有磷酸二氨基吡啶的溶液2,b.取步骤a所得溶液2,注入高效液相色谱仪检测,其中,所述有关物质为Ⅰ:4‑羟基吡啶、Ⅱ:4‑羟基‑3‑硝基吡啶、Ⅲ:4‑氨基‑3‑硝基吡啶和Ⅳ:4‑氨基吡啶,步骤b的高效液相色谱条件为梯度洗脱。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域,具体涉及磷酸二氨基吡啶的HPLC有关物质分析方法,更具体的说,涉及一种同时检测磷酸二氨基吡啶中4-羟基吡啶,4-羟基3-硝基吡啶,4-氨基-3-硝基吡啶和4-氨基吡啶的方法。
背景技术
在生产过程中,引入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物,以及贮藏过程中的降解产物都为有关物质,有关物质的存在和含量大小可能会影响药物的疗效,甚至会有毒副作用,所以,要以适当的检测分析方法控制药物中的有关物质的数量和含量,以确保药品质量。
3,4-二氨基吡啶(Amifampridine,阿米吡啶,3,4-DAP)的游离碱药物形式主要用于治疗许多罕见的肌肉疾病,该病症称为兰伯特-伊顿肌无力综合症和先天性肌无力综合症(Lambert-Eaton,LEMS)。其临床特征是肌肉无力和易疲劳(主要是腿部和躯干);上睑下垂和构音障碍;运动后立即增加肌肉力量和短暂肌肉收缩后引发腱反射;还包括感觉神经病,表现为手脚麻木或刺痛;由于副交感神经和交感神经功能障碍引起的自主神经紊乱,导致眼睛干涩、口干、便秘、出汗受损、直立性低血压和阳痿。3,4-二氨基吡啶作为药物活性物质可阻断电压依赖性钾通道,从而延长突触前细胞膜去极化,延长动作电位增强了钙向神经末梢的运输,细胞内钙浓度的增加促进了含乙酰胆碱囊泡的胞吐,进而增强了神经肌肉传递。2000年左右,法国巴黎公立医院集团创建了磷酸盐形式的药物。
磷酸二氨基吡啶原料药在生产过程中可能产生4种有关物质,分别为4-羟基吡啶,4-羟基3-硝基吡啶,4-氨基-3-硝基吡啶和4-氨基吡啶。上述4种有关物质,其含量的多少直接影响了磷酸二氨基吡啶的质量,因其具有基因毒性杂质警示结构,所以作为基因毒性杂质来评估(马磊,马玉楠,陈震,等.遗传毒性杂质的警示结构[J].中国新药杂志,2014,23(18):6.),需要严格控制其在磷酸二氨基吡啶原料中的含量。各有关物质结构式分别如下:
在Firdapse(磷酸二氨基吡啶商品名)的欧盟的审评报告中,杂质4-氨基-3-硝基吡啶控制不得过0.05%,其他各国药典均无记录磷酸二氨基吡啶标准,单一未知杂质不得过0.10%,总杂不得过0.5%;现有的文献中没有明确报道能准确检测分离该4种有关物质的方法。
发明内容
本发明提供了一种利用高效液相色谱法检测磷酸二氨基吡啶有关物质的方法,该方法主要包括以下步骤:
a.取磷酸二氨基吡啶供试品,用水、流动相或有机溶剂的水溶液1,配置成含有磷酸二氨基吡啶的溶液2。
b.取步骤a所得溶液2,注入高效液相色谱仪检测。
在一些实施方案中,所述有关物质为Ⅰ:4-羟基吡啶、Ⅱ:4-羟基-3-硝基吡啶、Ⅲ:4-氨基-3-硝基吡啶和Ⅳ:4-氨基吡啶。
在一些实施方案中,步骤b的高效液相色谱条件为:梯度洗脱。
在一些实施方案中,溶液2中磷酸二氨基吡啶的浓度为1~5mg/ml,优选1mg/ml。
在一些实施方案中,所述有机溶剂的水溶液1选自醇类或腈类的水溶液,优选甲醇水溶液,优选所述甲醇水溶液浓度为10%~60%,最优选为50%。
在一些实施方案中,步骤b的高效液相色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱,柱温30~40℃。
在一些实施方案中,步骤b的高效液相色谱条件为:色谱柱是YMC-Triart C18,250×4.6mml.D.S-5μm,12nm,柱温35℃。
在一些实施方案中,步骤b的高效液相色谱条件为:波长200~254nm的紫外光检测,优选检测波长为225nm。
在一些实施方案中,步骤b的高效液相色谱条件为:流动相流速0.1~1ml/min,优选0.2~0.8ml/min,最优选0.4~0.6ml/min。
在一些实施方案中,所述梯度洗脱过程为:
0-20min内,流动相A:流动相B从100vt%:0vt%渐变至30vt%:70vt%;
20-50min内,流动相A:流动相B为30vt%:70vt%;
50-51min内,流动相A:流动相B从30vt%:70vt%变为100vt%:0vt%;
51-60min内,流动相A:流动相B为100vt%:0vt%。
在一些实施方案中,所述流动相A和流动相B为不同浓度的色谱纯有机试剂和水组成的溶液。
在一些实施方案中,所述流动相A和流动相B,色谱纯有机试剂-水的体积比例可以是10vt%:90vt%~60vt%:40vt%。
优选地,流动相A的色谱纯有机试剂-水的体积比为20vt%:80vt%,流动相B的色谱纯有机试剂-水的体积比为50vt%:50vt%。
在一些实施方案中,所述色谱纯有机试剂选自甲醇或乙腈,优选甲醇。
在一些实施方案中,所述色谱纯有机试剂-水混合溶液的pH值为10.80~11.20,优选11.0。
在一些实施方案中,所述混合溶液中还含有用于调节pH值的无机碱。
所述无机碱优选氨水。
本发明还提供一种采用HPLC测定磷酸二氨基吡啶中的有关物质的方法,其特征色谱条件如下:色谱柱:YMC-Triart C18,250×4.6mml.D.S-5μm,12nm,检测器:UV检测器,检测波长225nm,柱温:34~36测,流动相流速:0.5ml/min,梯度洗脱,流动相:流动相A为20%甲醇溶液,甲醇:水=20:80,用氨水调节pH值为10.80~11.20,流动相B为50%甲醇溶液,甲醇:水=50:50,用氨水调节pH值为10.80~11.20,梯度洗脱过程为:0-20min内,流动相A:流动相B从100vt%:0vt%渐变至30vt%:70vt%;20-50min内,流动相A:流动相B为30vt%:70vt%;50-51min内,流动相A:流动相B从30vt%:70vt%变为100vt%:0vt%;51-60min内,流动相A:流动相B为100vt%:0vt%。
在一些实施方案中,所述流动相配制过程为:流动相A的配制:量取色谱纯甲醇200ml,然后加水至溶液体积至1000ml,再用氨水调节pH值为10.80~11.20,抽滤。流动相B的配制:量取色谱纯甲醇500ml,然后加水至溶液体积至1000ml,再用氨水调节pH值至10.80~11.20,抽滤。
供试品溶液:精密称取磷酸二氨基吡啶供试品,用50%甲醇溶液溶解,制成浓度约为1mg/ml的供试品溶液。
对照品储备液:精密称取杂质Ⅰ对照品,用50%甲醇水溶液溶解,制成浓度约为0.15mg/ml的对照品溶液;精密称取杂质Ⅱ对照品,杂质Ⅲ对照品和杂质Ⅳ对照品,用50%甲醇水溶液溶解,各制成浓度约为0.10mg/ml的对照品溶液。
系统适用性溶液:取磷酸二氨基吡啶、杂质Ⅰ对照品,杂质Ⅱ对照品,杂质Ⅲ对照品和杂质Ⅳ对照品,加50%甲醇水溶液溶解稀释制成每1ml中分别含1mg、1.5μg、0.5μg、0.5μg、0.5μg的磷酸二氨基吡啶、杂质Ⅰ,杂质Ⅱ,杂质Ⅲ和杂质Ⅳ。
采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和系统适用性溶液进行检测。
色谱条件为:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱,以流动相A甲醇-水(20vt%:80vt%),流动相B甲醇-水(50vt%:50vt%)为流动相,检测波长为225nm,进样体积为10μl。
测定法:取供试品溶液与系统适用性溶液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
限度:供试品溶液色谱图中如有杂质4-氨基-3-硝基吡啶,杂质4-羟基-3-硝基吡啶和杂质4-氯-3-硝基吡啶按外标法以峰面积计算,均不得过0.05%,杂质4-羟基吡啶不得过0.15%,单一未知杂质不得过0.10%,总杂不得过0.5%。
本发明提供的有关物质分析方法具有以下技术效果:本发明提供的基于HPLC的磷酸二氨基吡啶的4种有关物质分析方法未出现在国内外文献中,各国药典均未定磷酸二氨基吡啶标准。
附图说明
图1.为用实施例1的方法进行磷酸二氨基吡啶系统适用性溶液有关物质分析得到的色谱图
图2.为用实施例1的方法进行磷酸二氨基吡啶以及各杂质的单针定位色谱图
图3.为用实施例2的方法进行第1批磷酸二氨基吡啶样品有关物质分析得到的色谱图
图4.为用实施例2的方法进行第2批磷酸二氨基吡啶样品有关物质分析得到的色谱图
图5.为用实施例2的方法进行第3批磷酸二氨基吡啶样品有关物质分析得到的色谱图
图6.为用对比例1的方法进行磷酸二氨基吡啶以及各杂质分析得到的色谱图
图7.为用对比例2的方法进行磷酸二氨基吡啶以及各杂质分析得到的色谱图
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种基于HPLC的磷酸二氨基吡啶有关物质分析方法,有关物质包括Ⅰ:4-羟基吡啶,Ⅱ:4-羟基3-硝基吡啶,Ⅲ:4-氨基-3-硝基吡啶和Ⅳ:4-氨基吡啶。
该方法主要包括以下步骤:
制备供试品溶液:在温度为25℃的条件下称取供试品20mg于20ml干燥的容量瓶中,加50%甲醇水溶液适量,超声使其溶解,然后再加50%甲醇水溶液定容,得到供试品溶液。
制备对照品储备液:称取杂质Ⅰ,置于干燥的容量瓶中,加适量50%甲醇水溶液超声溶解,再加50%甲醇水溶液定容,制成浓度约为0.15mg/ml的对照品溶液;称取杂质Ⅱ,杂质Ⅲ和杂质Ⅳ,置于干燥的容量瓶中,加适量50%甲醇水溶液超声溶解,再加50%甲醇水溶液定容,各制成浓度约为0.10mg/ml的对照品溶液。
系统适用性溶液:取磷酸二氨基吡啶100mg置于干燥的100ml容量瓶中,取杂质Ⅱ,杂质Ⅲ和杂质Ⅳ储备液各0.5ml于该容量瓶中,杂质Ⅰ储备液1ml于该容量瓶中,加50%甲醇水溶液溶解稀释并定容制成每1ml中分别含1mg、0.5μg、0.5μg、0.5μg、1.5μg的磷酸二氨基吡啶、杂质Ⅱ对照品,杂质Ⅲ对照品,杂质Ⅳ对照品和杂质Ⅰ对照品。
采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和系统适用性溶液进行检测。
色谱条件为:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱,以流动相A甲醇-水(20vt%:80vt%),流动相B甲醇-水(50vt%:50vt%)为流动相,检测波长为225nm,进样体积为10μl。
系统适用性要求:系统适用性溶液色谱图中,杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ与磷酸二氨基吡啶峰之间的分离度符合要求,分离度≥1.5。
测定法:取供试品溶液与系统适用性溶液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
限度:供试品溶液色谱图中如有杂质4-氨基-3-硝基吡啶,杂质4-羟基-3-硝基吡啶和杂质4-氯-3-硝基吡啶,按外标法以峰面积计算,均不得过0.05%,杂质4-羟基吡啶不得过0.15%,单一未知杂质不得过0.10%,总杂不得过0.5%。
实验结果见表1,色谱图见图1。
系统适用性溶液检测结果
表1
名称 | 保留时间(min) | 分离度 |
杂质Ⅰ | 5.618 | 7.65 |
杂质Ⅱ | 3.726 | -- |
磷酸二氨基吡啶 | 8.791 | 8.95 |
杂质Ⅳ | 12.237 | 7.04 |
杂质Ⅲ | 19.142 | 15.10 |
实施例2
本次检测3批原料
制备供试品溶液:在温度为25℃的条件下称取供试品20mg于20ml干燥的容量瓶中,加50%甲醇水溶液适量,超声使其溶解,然后再加50%甲醇水溶液定容,得到供试品溶液。
制备对照品储备液:称取杂质Ⅰ置于干燥的容量瓶中,加适量50%甲醇水溶液超声溶解,再加50%甲醇水溶液定容,制成浓度约为0.15mg/ml的对照品溶液;称取杂质Ⅱ,杂质Ⅲ,杂质Ⅳ,置于干燥的容量瓶中,加适量50%甲醇水溶液超声溶解,再加50%甲醇水溶液定容,各制成浓度约为0.10mg/ml的对照品溶液。
系统适用性溶液:取磷酸二氨基吡啶100mg置于干燥的100ml容量瓶中、取杂质Ⅱ储备液,杂质Ⅲ储备液和杂质Ⅳ储备液各0.5ml于该容量瓶中,杂质Ⅰ储备液1ml于该容量瓶中,加50%甲醇水溶液溶解稀释并定容制成每1ml中分别含1.0mg、0.5μg、0.5μg、0.5μg、1.5μg的磷酸二氨基吡啶、杂质Ⅱ对照品,杂质Ⅲ对照品,杂质Ⅳ对照品和杂质Ⅰ对照品。
试验前查看试验所用设备仪器,均运行正常且在有效期内,查看所有对照品,样品均正确无误且在有效期内,查看试验现场,容量瓶、移液管使用正确,观察供试品溶液未发现异常情况。
采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和系统适用性溶液进行检测。
色谱条件为:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱,以流动相A甲醇-水(200vt%:800vt%),流动相B甲醇-水(50vt%:500vt%)为流动相,检测波长为225nm,进样体积为10μl。
系统适用性要求:系统适用性溶液色谱图中,杂质Ⅰ,杂质Ⅱ,杂质Ⅲ和杂质Ⅳ与磷酸二氨基吡啶峰之间的分离度符合要求,分离度≥1.5。
测定法:取供试品溶液与对照品溶液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
限度:供试品溶液色谱图中如有杂质4-氨基-3-硝基吡啶,杂质4-羟基-3-硝基吡啶和杂质4-氨基吡啶按外标法以峰面积计算,均不得过0.05%,杂质4-羟基吡啶不得过0.15%,单一未知杂质不得过0.10%,总杂不得过0.5%。
实验结果见表2-4,色谱图见图3-5。
第1批样品中各有关物质检测结果
表2
名称 | 保留时间(min) | 分离度 |
杂质Ⅱ | 3.716 | -- |
磷酸二氨基吡啶 | 9.924 | 16.01 |
杂质Ⅳ | 12.148 | 4.77 |
第2批样品中有关物质检测结果
表3
名称 | 保留时间(min) | 分离度 |
杂质Ⅳ | 12.120 | 6.92 |
杂质Ⅲ | 18.985 | 14.80 |
磷酸二氨基吡啶 | 8.865 | -- |
第3批样品中有关物质检测结果
表4
名称 | 保留时间(min) | 分离度 |
杂质Ⅳ | 12.098 | 5.93 |
磷酸二氨基吡啶 | 8.814 | -- |
实验结论:实施例1的实验结果表明,本发明提供的方法在检测磷酸二氨基吡啶有关物质时,限度浓度下四种杂质均可检出,主峰与各有关物质峰的分离度和各有关物质间的分离度均为1.5以上。实施例2的实验结果表明,本发明提供的方法在检测磷酸二氨基吡啶有关物质时,三批供试品均不含有杂质I,主峰与杂质峰的分离度均为1.5以上。
综上,仅为本发明的较佳实施例,不以此限定本发明的保护范围,凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆为本发明专利涵盖的范围之内。
对比例1
本对比例提供了一种基于HPLC的磷酸二氨基吡啶有关物质分析方法,该分析方法与实施例的区别在于,色谱条件不同,无法同时检出四种有关物质。
该方法主要包括以下步骤:
制备供试品溶液:在温度为25℃的条件下称取供试品20mg于20ml干燥的容量瓶中,加50%甲醇水溶液适量,超声使其溶解,然后再加50%甲醇水溶液定容,得到供试品溶液。
制备对照品储备液:称取杂质Ⅰ,置于干燥的容量瓶中,加适量50%甲醇水溶液超声溶解,再加50%甲醇水溶液定容,制成浓度约为0.15mg/ml的对照品溶液;称取杂质Ⅱ,杂质Ⅲ和杂质Ⅳ,置于干燥的容量瓶中,加适量50%甲醇水溶液超声溶解,再加50%甲醇水溶液定容,各制成浓度约为0.10mg/ml的对照品溶液。
系统适用性溶液:取磷酸二氨基吡啶100mg置于干燥的100ml容量瓶中,取杂质Ⅱ,杂质Ⅲ和杂质Ⅳ储备液各0.5ml于该容量瓶中,杂质Ⅰ储备液1ml于该容量瓶中,加50%甲醇水溶液溶解稀释并定容制成每1ml中分别含1mg、0.5μg、0.5μg、0.5μg、1.5μg的磷酸二氨基吡啶、杂质Ⅱ对照品,杂质Ⅲ对照品,杂质Ⅳ对照品和杂质Ⅰ对照品。
采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和系统适用性溶液进行检测。
色谱条件为:用杂化硅胶基质上键合五氟苯基的色谱柱(YMC-Triart PFP,250×4.6mml.D.S-5μm,12nm),流动相为乙腈-水(10:90,含0.2%三氟乙酸),流速1.0ml/min,柱温40℃,检测波长为225nm,进样体积为10μl。
测定法:取供试品溶液与系统适用性溶液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
实验结果
见表5,色谱图见图6。
表5
名称 | 保留时间(min) |
磷酸二氨基吡啶 | 4.895 |
杂质Ⅰ | 5.837 |
杂质Ⅱ | 5.894 |
杂质Ⅲ | 6.116 |
杂质Ⅳ | 5.475 |
对比例2
本对比例提供了一种基于HPLC的磷酸二氨基吡啶有关物质分析方法,该分析方法与对比例1的区别在于,流动相不同,加入了离子对试剂,但也无法同时检出四种有关物质。
所述离子对试剂为辛烷磺酸钠。
所述流动相为乙腈-盐溶液(10:90,三氟乙酸调节pH为2.0),所述盐溶液为8mmol/L辛烷磺酸钠和10mmol/L乙酸铵。
实验结果
见表6,色谱图见图7。
表6
名称 | 保留时间(min) |
磷酸二氨基吡啶 | 8.376 |
杂质Ⅰ | 8.694 |
杂质Ⅱ | 3.148 |
杂质Ⅲ | 10.695 |
杂质Ⅳ | 8.724 |
实验结论:对比例1的实验结果表明,各杂质保留时间相近,杂质Ⅰ与杂质Ⅳ色谱峰重叠,无法达到较好的分离要求;对比例2的实验结果表明,流动相中加入离子对试剂,也未能将杂质Ⅰ与杂质Ⅳ色谱峰分开,且与主成分保留时间相近,同样无法达到分离要求。
Claims (7)
1.一种利用高效液相色谱法检测磷酸二氨基吡啶有关物质的方法,该方法包括以下步骤:
a.取磷酸二氨基吡啶供试品,用水、流动相或有机溶剂的水溶液1,配置成含有磷酸二氨基吡啶的溶液2,
b.取步骤a所得溶液2,注入高效液相色谱仪检测,
其中,所述有关物质为Ⅰ:4-羟基吡啶、Ⅱ:4-羟基-3-硝基吡啶、Ⅲ:4-氨基-3-硝基吡啶和Ⅳ:4-氨基吡啶,步骤b的高效液相色谱条件为梯度洗脱,
其中,步骤b的高效液相色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱,柱温30~40℃,波长200~254nm的紫外光检测,流动相流速0.1~1ml/min,步骤b所述梯度洗脱过程为:
0-20min内,流动相A:流动相B从100vt%:0vt%渐变至30vt%:70vt%;
20-50min内,流动相A:流动相B为30vt%:70vt%;
50-51min内,流动相A:流动相B从30vt%:70vt%变为100vt%:0vt%;
51-60min内,流动相A:流动相B为100vt%:0vt%,
流动相A:色谱纯有机试剂-水的体积比为20vt%:80vt%,流动相B:色谱纯有机试剂-水的体积比为50vt%:50vt%,所述色谱纯有机溶剂选自甲醇,所述色谱纯有机试剂-水混合溶液的pH值为10.80~11.20。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于溶液2中磷酸二氨基吡啶的浓度为1~5mg/ml,所述有机溶剂的水溶液1选自醇类或腈类的水溶液。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b的高效液相色谱条件为:色谱柱是YMC-Triart C18,250×4.6mml.D.S-5μm,12nm,柱温35℃。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b的高效液相色谱条件为:检测波长为225nm,流动相流速0.4~0.6ml/min。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述色谱纯有机试剂-水混合溶液的pH值为11.0,所述混合溶液中还含有用于调节pH值的无机碱,所述无机碱为氨水。
6.一种利用高效液相色谱法检测磷酸二氨基吡啶有关物质的方法,其特征在于色谱条件如下:色谱柱:YMC-Triart C18,250×4.6mml.D.S-5μm,12nm,检测器:UV检测器,检测波长225nm,柱温:34~36℃,流动相流速:0.5ml/min,梯度洗脱,流动相:流动相A为20%甲醇水溶液,用氨水调节pH值为10.80~11.20,流动相B为50%甲醇水溶液,用氨水调节pH值为10.80~11.20,梯度洗脱过程为:0-20min内,流动相A:流动相B从100vt%:0vt%渐变至30vt%:70vt%;20-50min内,流动相A:流动相B为30vt%:70vt%;50-51min内,流动相A:流动相B从30vt%:70vt%变为100vt%:0vt%;51-60min内,流动相A:流动相B为100vt%:0vt%,其中所述有关物质是:杂质Ⅰ:4-羟基吡啶,杂质Ⅱ:4-羟基-3-硝基吡啶,杂质Ⅲ:4-氨基-3-硝基吡啶,杂质Ⅳ:4-氨基吡啶。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于所述流动相配制方法为:流动相A的配制:量取色谱纯甲醇200ml,然后加水至溶液体积至1000ml,再用氨水调节pH值为10.80~11.20,抽滤;流动相B的配制:量取色谱纯甲醇500ml,然后加水至溶液体积至1000ml,再用氨水调节pH值至10.80~11.20,抽滤;
供试品溶液配制方法为:精密称取磷酸二氨基吡啶供试品,用50%甲醇溶液溶解,制成浓度约为1mg/ml的供试品溶液;
对照品储备液配制方法为:精密称取杂质Ⅰ对照品,用50%甲醇水溶液溶解,制成浓度约为0.15mg/ml的对照品溶液;精密称取杂质Ⅱ对照品,杂质Ⅲ对照品和杂质Ⅳ对照品,用50%甲醇水溶液溶解,各制成浓度约为0.10mg/ml的对照品溶液;
系统适用性溶液配制方法为:取磷酸二氨基吡啶、杂质Ⅰ对照品,杂质Ⅱ对照品,杂质Ⅲ对照品和杂质Ⅳ对照品,加50%甲醇水溶液溶解稀释制成每1ml中分别含1mg、1.5μg、0.5μg、0.5μg、0.5μg的磷酸二氨基吡啶、杂质Ⅰ,杂质Ⅱ,杂质Ⅲ和杂质Ⅳ;
测定法为:取供试品溶液与系统适用性溶液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍,其中所述有关物质是:杂质Ⅰ:4-羟基吡啶,杂质Ⅱ:4-羟基-3-硝基吡啶,杂质Ⅲ:4-氨基-3-硝基吡啶,杂质Ⅳ:4-氨基吡啶。
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