CN107870209B - 测定利格列汀原料药中杂质含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种测定利格列汀原料药中杂质含量的方法，该方法包括：通过高效液相色谱分析方法对所述利格列汀原料药进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述利格列汀原料药中杂质的含量，其中，所述高效液相色谱采用以下条件：色谱柱为YMC‑PACK ODS‑AM，4.6×250mm，5微米，检测器为DAD，检测波长为226nm，柱温为25℃，流动相A相为10mmol/L的磷酸二氢钾缓冲液，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为3.0～5.0，流动相B相为乙腈，流速为1.0mL/min，运行时间为65min，洗脱梯度为
Figure 201610862127357773
利用根据本发明实施例的检测方法，可简便、准确、灵敏地测定利格列汀原料药中杂质的含量，从而有效控制利格列汀原料药的质量。

Description

测定利格列汀原料药中杂质含量的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及测定利格列汀原料药中杂质含量的方法。
背景技术
II型糖尿病是由于机体胰岛β细胞分泌胰岛素不足或靶细胞对胰岛素不敏感(胰岛素抵抗)所致，亦称非胰岛素依赖性糖尿病。II型糖尿病多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。
利格列汀(Linagliptin)是一种二肽基肽酶-4(DPP-4)的抑制剂，是一种用于治疗II型糖尿病的有效药。其分子结构为：
Figure BDA0001122885070000011
具有易溶于甲醇，微溶于乙腈，难溶于水的特性。
然而，利格列汀原料药生产过程中，会引入合成起始物料、中间体等杂质，而影响利格列汀产品的质量和利格列汀的疗效。如何准确测定利格列汀原料药中杂质的含量，进而有效控制利格列汀产品的质量，成为拭待解决的关键问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出了一种简便、准确、灵敏地检测利格列汀原料药中起始物料、中间体等杂质含量的方法。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种测定利格列汀原料药中杂质含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：通过高效液相色谱分析方法对所述利格列汀原料药进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述利格列汀原料药中杂质的含量，其中，所述高效液相色谱采用以下条件：色谱柱为YMC-PACK ODS-AM，4.6×250mm，5微米，检测器为DAD，检测波长为226nm，柱温为25℃，流动相A相为10mmol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液(采用0.1％磷酸调节pH)，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为3.0～5.0，流动相B相为乙腈，流速为1.0mL/min，洗脱梯度为
时间(min) A相(％) B相(％)
0 80 20
30 75 25
40 65 35
55 25 75
60 25 75
60.1 80 20
65 80 20
运行时间为65min。利用根据本发明实施例的检测方法，可简便、准确、灵敏地测定利格列汀原料药中杂质的含量，从而有效控制利格列汀原料药的质量。
根据本发明的实施例，上述测定利格列汀原料药中杂质含量的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为4.0。发明人在实验中发现，磷酸二氢钾缓冲液的pH为4.0，待分离杂质化合物存在形态单一，峰单一、峰形尖锐及可实现杂质峰保留时间重现的分离效果。
根据本发明的实施例，所述杂质为
Figure BDA0001122885070000021
Figure BDA0001122885070000022
为合成利格列汀的起始物，
Figure BDA0001122885070000023
为合成利格列汀的中间产物。利用本发明实施例的测定利格列汀原料药中杂质含量的方法，利格列汀主峰与上述两种杂质峰分离度好，上述两种杂质峰的分离度好，杂质峰的形态单一，可实现对上述两种杂质峰的有效分离和含量的准确测定。
根据本发明的实施例，所述利格列汀原料药是以供试品溶液的形式提供的，其中，所述供试品溶液为利格列汀原料药的磷酸二氢钾-乙腈溶液，并且基于每毫升所述供试溶液，利格列汀原料药的含量为0.2mg，其中，所述磷酸二氢钾-乙腈溶液是所述A相和B相的混合溶液，所述A相和B相的体积比为4：1。发明人通过实验发现，利格列汀原料药在上述磷酸二氢钾-乙腈溶液中溶解能力较好，同时，利格列汀原料药的进样浓度在0.2mg/mL时，既可保证足够好的杂质检测灵敏度，又可保证主峰不因浓度过载而变形、不在UV的线性响应范围内，确保不因浓度过高而导致UV谱变形从而致使纯度因子不合格。
根据本发明的实施例，所述供试品溶液的用量为10微升，对杂质含量的测定更加真实、可靠、准确。
根据本发明的实施例，所述基于所述色谱图，确定所述利格列汀原料药中杂质的含量是通过以下公式确定的：
Figure BDA0001122885070000031
其中，AT表示杂质的峰面积；AS表示对照溶液中主峰峰面积；F表示杂质相对于利格列汀的校正因子；WT表示供试品溶液中利格列汀原料药的质量；WS表示用于配制对照溶液利格列汀原料药的质量；所述对照溶液是利格列汀原料药的磷酸二氢钾-乙腈溶液，并且基于每毫升所述对照溶液，利格列汀原料药的含量为0.4微克。根据本发明的实施例，采用上述方式确定利格列汀原料药中杂质的含量，准确率高，结果更加真实可靠。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定利格列汀原料药中杂质含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法具体包括：
(1)色谱条件
色谱柱为YMC-PACK ODS-AM，4.6×250mm，5微米，
检测器为DAD，
检测波长为226nm，
柱温为25℃，
流动相A相为10mmol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液(采用0.1％磷酸调节pH)，所述磷酸二氢钾的pH为4.0，
流动相B相为乙腈，
流速为1.0mL/min，
洗脱梯度为
时间(min) A相(％) B相(％)
0 80 20
30 75 25
40 65 35
55 25 75
60 25 75
60.1 80 20
65 80 20
运行时间为65min，
(2)配制空白溶液
乙腈和A相的体积比为1：4的混合溶液作为所述空白溶液，
(3)配制供试品溶液
精密称定利格列汀原料药20mg，置100mL容量瓶中，用空白溶液溶解，并做超声处理，稀释至刻度，摇匀，即得所述供试品溶液，
(4)配制对照溶液
精密移取1mL供试品溶液至50mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得对照储备液；
精密移取对照储备溶液5mL至50mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得对照溶液；
(5)将10微升供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图，根据所述色谱图计算得到供试品溶液中杂质的含量，
其中，按以下公式计算供试品溶液中各个单杂的含量，取2次测定结果的平均值作为测定结果：
Figure BDA0001122885070000041
式中，AT表示供试品溶液中各杂质的峰面积；
AS表示供试品溶液前后各1针对照溶液中主峰峰面积的平均值；
F表示各杂质相对于利格列汀的校正因子；
WT表示供试品溶液中利格列汀原料药的质量；
WS表示用于配制对照溶液利格列汀原料药的质量；
供试品总杂的含量等于所有单质含量的总和，
所述1针对照溶液的用量为10微升。
利用根据本发明实施例的检测方法，可简便、准确、灵敏地测定利格列汀原料药中杂质的含量，从而有效控制利格列汀原料药的质量。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的不同pH(2.3～7.0)缓冲液条件下利格列汀原料药的色谱图；
图2是根据本发明实施例1的不同pH(7.8～10.5)缓冲液条件下利格列汀原料药的色谱图；
图3是根据本发明实施例2的空白溶液色图谱；
图4是根据本发明实施例2的灵敏度溶液色谱图；
图5是根据本发明实施例2的系统适用性溶液色谱图；
图6是根据本发明实施例2的供试品溶液色谱图；
图7是根据本发明实施例2的杂质B增敏溶液色图谱；以及
图8是根据本发明实施例2的对照溶液色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在本实施例中，发明人详细介绍了测定利格列汀原料药中杂质含量的方法的开发过程。
1.1缓冲盐种类及pH值的确定
利格列汀含有一伯胺基团，CAD软件预测其共轭酸的pKa高达10.0，碱性较强；利格列汀另含有多个碱性基团，均连有较复杂的基团，酸碱性难以判断。需选择一个合适pH值的缓冲液以确保分离过程中待分离化合物存在形态单一，从而实现峰的单一、峰形的尖锐、及保留时间重现的分离效果。因此，方法开发初期，发明人考察了在相同梯度，不同A相下，利格列汀及相应杂质的分离效果。具体考察方法如下所述：
方法A：A相(水相)为0.1％磷酸(pH约为2.3)、10mM pH值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0的KH2PO4溶液，B相为乙腈；
方法B：A相(水相)为10mM pH分别为7.8，9.0，9.5的K2HPO4溶液及0.1％氨水(pH约为10.5)，B相为乙腈。
考察结果如图1、图2所示，其中，图1结果显示，在pH值为2.3-7.0缓冲溶液的考察条件下，利格列汀保留时间随着缓冲溶液的pH值变大而变大。结合利格列汀的化学结构分析，可能的原因为：在pH值为2.3-7.0的缓冲溶液中，利格列汀强碱性的伯胺基团可能已经完全电离，但其它弱碱性基团仅部分电离，且随缓冲pH值变大，离子化程度越小，导致利格列汀的极性逐渐变小，从而导致保留增强；但在pH值为3.0-5.0的缓冲液中，主峰峰形及保留时间基本不变，可能原因是除伯胺基团外的其它弱碱性基团的电离程度也达到了一个相对稳定的状态。
图2结果显示，使用pH值为7.8-10.5的不同缓冲溶液，利格列汀的保留时间依旧随着缓冲溶液的pH值变大而变大。
综合图1和图2结果，说明所考察的上述各条件下利格列汀各碱性基团电离的程度不一致，利格列汀的保留逐渐增强，其中以0.1％氨水利格列汀的保留最强，即在该条件下，利格列汀各碱性基团未电离的程度最大。但使用方法B的相应的色谱图中，虽然利格列汀的峰形较好，但存在较大的杂质峰(或包)，而不利于后续分析方法的进一步优化。
基于上述考察分析，可以得出结论，利格列汀在pH3～5范围内，利格列汀的存在的形态单一。优选10mM pH＝4.0的KH2PO4溶液(含有0.1％磷酸)做为测定利格列汀有关物质含量方法的A相缓冲液，后续可行性实验确认了该条件能提供足够好的保留重现性与峰形。
1.2有机相种类的选择及梯度洗脱条件的确定
上述缓冲盐及pH值的考察中，均选择乙腈为有机相改性剂，在所选择缓冲溶液及初始梯度条件下，利格列汀及各相应杂质均获得了较好的峰形(利格列汀的对称因子为1.7，理论塔板为20250)。考察使用甲醇代替乙腈为有机相改性剂，并开发相应的梯度洗脱方法，所获得分离效果明显不如使用乙腈，使用甲醇，获得的利格列汀的峰形较宽且对称性变差(对称因子为1.8，理论塔板为3000)，此外，使用甲醇时柱压明显高于使用乙腈，对仪器要求高。因此，发明人最终选择乙腈作为有机相。
乙腈为B相，及使用YMC-PACK ODS-AM(4.6×250mm，5微米)色谱柱的基础上，进一步优化梯度，确定为适宜梯度的原则为分离时间尽可能短，但主峰与杂质及杂质与杂质之间充分分离。最终优化的洗脱梯度为：0-30min，20-25％B；30-40min，25％-35％B；40-55min，35％-75％B；55-60min，75％B；60-60.1min，75％-20％B；60.1-65min，20％B。
1.3色谱柱的选择与优化
上述考察已确定了使用PH＝4.0，10mM K2HPO4溶液(含有0.1％磷酸)作为缓冲盐，除上述已考察的YMC-PACK ODS-AM(4.6×250mm，5微米)色谱柱外，发明人在相同梯度方法下还考察了Gemini NX C18、Waters Xbrige C18、Agilent XDB C18、DIONEX Acclaim C18、Wetch Materials Xtimate C18等常见不同品牌的相同粒径的C18色谱柱分离效果，考察的主要指标为利格列汀主峰的对称因子、理论塔板以及利格列汀主峰与邻近杂质峰的分离度，具体考察结果如表1所示。
表1：不同色谱柱考察结果
Figure BDA0001122885070000061
Figure BDA0001122885070000071
表1结果显示，Agilent XDB C8与YMC-PACK ODS-AM都具有较好的峰形但YMC-PACKODS-AM分离效果明显优于Agilent XDB C8；DIONEX Acclaim C18、Wetch MaterialsXtimate C18及YMC-PACK ODS-AM都具有较好的分离效果，但YMC-PACK ODS-AM的峰形优于其他两款。综合以上分析，发明人选择YMC-PACK ODS-AM为所建方法的分析柱。
1.4检测波长的确定
利格列汀及典型杂质的结构和理化性质如表2所示，可见利格列汀及各杂质UV光谱图相似，都在226nm，294nm处有最大吸收。进而，发明人在上述确定的色谱条件下，用公斤级批次的供试品考察各波长下的杂质的检出情况，考察结果如表3所示。
表2：利格列汀及典型杂质的结构和理化性质
Figure BDA0001122885070000072
表3：不同检测波长的考察
Figure BDA0001122885070000073
说明：杂质含量为面积归一化结果；低于0.03％的杂质不纳入考察。
经考察，294nm波长下，检出的杂质数目及杂质总量最少，而226nm波长下，杂质检出个数明显增多，有利于对API的质量控制。因此，最终选择的波长为226nm。
1.5供试品制备方法确定
理想的供试品稀释液为流动相溶液，上述确定的洗脱梯度的初始有机相比例为25％，对供试品的溶解能力较好，故发明人选择乙腈/K2HPO4缓冲液(含有0.1％磷酸)的比列为20/80的混合溶液作为供试品稀释液。关于供试品配制浓度及进样量的确定，原则为一方面提供足够好的杂质检测灵敏度，但同时保证主峰不因浓度过载而变形及不在UV的线性响应范围内(确保不因浓度过高而导致UV谱变形从而致使纯度因子不合格)。发明人最终通过实验，确定的供试品浓度为0.2mg/mL，进样量为10微升。
实施例2
在本实施例中，发明人考察了实施例1所确定的测定利格列汀原料药中杂质含量的方法的系统适用性和灵敏性，并详细介绍了如何基于实施例1所确定的色谱条件下获得的色谱图，计算得到杂质的含量。
2.1相关溶液的配制
稀释液(空白溶液)为：乙腈：A相＝1：4的混合溶液；
供试品溶液：取供试品约20mg，精密称定，置100mL容量瓶中，用稀释液适量使溶解、超声并稀释至刻度，摇匀，即得，平行配制2份；
系统适用性溶液：取杂质A对照品约4mg，称定至100mL容量瓶中，精密移取5mL供试品溶液1至同一100mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释到刻度，摇匀，即得；
对照储备溶液：精密移取1mL供试品溶液1至50mL容量瓶中，用稀释至刻度，摇匀，即得；
对照溶液：精密移取对照储备溶液5mL至50mL容量瓶中，用稀释至刻度，摇匀，即得；
灵敏度溶液：精密移取对照储备溶液5mL至100mL容量瓶中，用稀释至刻度，摇匀，精密移取上述溶液5mL至10mL容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，即得浓度水平为0.05％的灵敏度溶液。
2.2色谱条件
色谱柱：YMC-Pack ODS-AM 250*4.6mm，5微米
柱温：25℃
检测波长：226nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10微升
后运行时间：5min
流动相配制：A相(10mM pH＝4.0磷酸二氢钾缓冲溶液)：称取1.4g无水磷酸二氢钾，加1L超纯水溶解，用磷酸调pH＝4.0，用0.2微米滤膜过滤，脱气即得；
B相：乙腈。
洗脱程序：
时间(min) A(％) B(％)
0 80 20
30 75 25
40 65 35
55 25 75
60 25 75
60.1 80 20
65 80 20
2.3相关检测操作
待基线平衡后取空白溶液按2.2色谱条件进样1～2针(使系统充分平衡)后，取灵敏度溶液、对照溶液、系统适用性溶液和供试品溶液按表4所示的序列进样。进样序列需使用随行对照，即每隔9-10小时进1针对照溶液，供试品溶液进样结束时，再进1针对照溶液和灵敏度溶液。取对照溶液的前两针和随行对照的1针计算主峰峰面积的RSD值，要求RSD≤10.0％。
表4：进样序列
供试品名 进样针数
空白溶液 1
灵敏度溶液 1
对照溶液 3
系统适用性溶液 1
供试品溶液1 1
供试品溶液2 1
… 1
对照溶液(每隔9-10小时进随行对照) 1
… 1
对照溶液(结束时的随行对照) 1
灵敏度溶液 1
其中，空白溶液图谱如图3所示，结果显示杂质检测不受干扰，
灵敏度溶液色谱图如图4所示，主峰信噪比≥10，结果显示方法的灵敏度符合检测要求；
对照溶液连续进样3针，色谱图如图8所示，主峰峰面积RSD值≤10.0％；
系统适用性溶液色谱图如图5所示，主峰对称因子在0.8～2.0之间，主峰与杂质A之间的分离度≥3，结果显示方法的分离能力达到了检测要求；
供试品溶液色谱图如图6所示；
杂质B增敏溶液图谱如图7所示，结果显示方法具有对杂质B的检测能力。
注：如果系统适用性不合格，应立即停止进样，并查找原因，排查原因后，再重做系统适应性实验。
2.4基于色谱图的杂质含量的计算方法
发明人按以下公式计算供试品中各个单杂的含量，其中，取2次测定结果的平均值作为测定结果：
Figure BDA0001122885070000101
式中：AT：供试品溶液中各杂质的峰面积；
AS：供试品溶液前后各1针对照溶液(共2针)中主峰峰面积的平均值；
F：各杂质相对于利格列汀的校正因子，如表5所示，表5中校正因子数据由线性实验的结果计算获得；
WT：供试品称样量，mg；
WS：用于配制对照溶液的供试品称样量，mg；
供试品总杂的含量等于所有已知杂质和所有未知单杂含量的总和。
允许误差：平行测定2次，各已知杂质(杂质B)的绝对差值不得超过0.05％，总杂绝对差值不得过0.1％。
杂质限度的接受标准如表5所示。
表5：杂质限度的接受标准
Figure BDA0001122885070000102
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.一种测定利格列汀原料药中杂质含量的方法，其特征在于，
通过高效液相色谱分析方法对所述利格列汀原料药进行分析，以便获得色谱图；以及
基于所述色谱图，确定所述利格列汀原料药中杂质的含量，所述杂质为
Figure FDA0002493524160000011
Figure FDA0002493524160000012
其中，所述高效液相色谱采用以下条件：
色谱柱为YMC-PACK ODS-AM，4.6×250mm，5微米，
检测器为DAD，
检测波长为226nm，
柱温为25℃，
流动相A相为10mmol/L的磷酸二氢钾缓冲液，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为4.0，
流动相B相为乙腈，
流速为1.0mL/min，
洗脱梯度为
时间(min) A相(％) B相(％) 0 80 20 30 75 25 40 65 35 55 25 75 60 25 75 60.1 80 20 65 80 20
运行时间为65min；
所述利格列汀原料药是以供试品溶液的形式提供的，其中，所述供试品溶液为利格列汀原料药的磷酸二氢钾-乙腈溶液，并且基于每毫升所述供试品溶液，利格列汀原料药的含量为0.2mg，
其中，所述磷酸二氢钾-乙腈溶液是所述A相和B相的混合溶液，所述A相和B相的体积比为4：1；
所述供试品溶液的用量为10微升。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于所述色谱图，确定所述利格列汀原料药中杂质的含量是通过以下公式确定的：
Figure FDA0002493524160000021
其中，AT表示杂质的峰面积；
AS表示对照溶液中主峰峰面积；
F表示杂质相对于利格列汀的校正因子；
WT表示供试品溶液中利格列汀原料药的质量；
WS表示用于配制对照溶液利格列汀原料药的质量；
所述对照溶液是利格列汀原料药的磷酸二氢钾-乙腈溶液，并且基于每毫升所述对照溶液，利格列汀原料药的含量为0.4微克。
3.一种测定利格列汀原料药中杂质含量的方法，所述杂质为
Figure FDA0002493524160000022
Figure FDA0002493524160000023
其特征在于，包括：
(1)色谱条件
色谱柱为YMC-PACK ODS-AM，4.6×250mm，5微米，
检测器为DAD，
检测波长为226nm，
柱温为25℃，
流动相A相为10mmol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液，所述磷酸二氢钾缓冲溶液的pH为4.0，
流动相B相为乙腈，
流速为1.0mL/min，
洗脱梯度为
Figure FDA0002493524160000024
Figure FDA0002493524160000031
运行时间为65min，
(2)配制空白溶液
乙腈和A相的体积比为1：4的混合溶液作为所述空白溶液，
(3)配制供试品溶液
精密称定利格列汀原料药20mg，置100mL容量瓶中，用空白溶液溶解，并做超声处理，稀释至刻度，摇匀，即得所述供试品溶液，
(4)配制对照溶液
精密移取1mL供试品溶液至50mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得对照储备液；
精密移取对照储备溶液5mL至50mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得对照溶液；
(5)将10微升供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图，根据所述色谱图计算得到供试品溶液中杂质的含量，
其中，按以下公式计算供试品溶液中各个单杂的含量，取2次测定结果的平均值作为测定结果：
Figure FDA0002493524160000032
式中，AT表示供试品溶液中各杂质的峰面积；
AS表示供试品溶液前后各1针对照溶液中主峰峰面积的平均值；
F表示各杂质相对于利格列汀的校正因子；
WT表示供试品溶液中利格列汀原料药的质量；
WS表示用于配制对照溶液利格列汀原料药的质量；
供试品总杂的含量等于所有单质含量的总和，
所述1针对照溶液的用量为10微升。
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