CN114544796B - 一种液相质谱联用测定血浆中司替戊醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效液相质谱联用测定血浆中司替戊醇的方法，以司替戊醇‑d9为内标，加入沉淀剂进行蛋白沉淀，取上清液加稀释剂，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测。本发明建立了一种高通量、高分辨的高效液相‑串联质谱法测定人血浆中司替戊醇浓度的方法；本方法的血浆标准曲线线性范围为5.000ng/mL～5000.000ng/mL，批内和批间精密度CV％均小于±15％。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，涉及一种液相质谱联用测定血浆中司替戊醇的方法。
背景技术
司替戊醇(Stiripentol,SPT)化学名为4,4-二甲基-1-[(3,4-亚甲二氧基)苯基]-1-戊烯-3-醇，是法国Biocodex公司开发的一种细胞色素P450抑制剂。2007年首次在欧盟上市，临床用于治疗各种癫痫发作。
司替戊醇吸收迅速，经1.5h即可达到血药峰值。绝对生物利用度尚不清楚。吸收良好，给药剂量的大部分随尿排泄。司替戊醇广泛与血浆蛋白结合(约99％)。在体内被代谢广泛，在尿液中发现有13种不同物质。主要被去甲基化和葡糖醛酸化代谢。体外试验表明，主要参与第一阶段代谢的CYP同工酶类为CYP1A2、CYP2C19和CYP3A44、排泄本品大部分通过肾排泄。尿液中代谢产物占大部分口服剂量(约73％)，有13％-24％的给药剂量以原药随粪便排泄。本品的全身暴露量与服用剂量成比例关系，在高剂量时，清除率明显下降。
目前现有技术检测人血浆中的司替戊醇的分析方法参差不齐，其通量、选择性、灵敏度均存在一定问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液质联用测定血浆中司替戊醇的方法，用以解决上述背景技术中存在的技术问题。
本发明技术方案提供一种液质联用测定血浆中司替戊醇的方法，血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，包括以下步骤：
S1:血浆样品预处理：以K2EDTA为抗凝剂，以司替戊醇-d9为内标；在96孔板的孔中加入50μL样品，加入50μL浓度为500.000ng/mL的司替戊醇-d9内标工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入400μL体积比为100:0.2的乙腈：乙酸的混合溶液，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液150μL至另一新96孔收集板中，加入150μL水溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，待进样；以上过程均在室温黄光条件下进行；
S2:试样测定：取5μL测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的司替戊醇和内标司替戊醇-d9的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的司替戊醇浓度。
在一个优选地实施例中，液相色谱条件为：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18 4.6×50mm5μm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：纯乙腈；洗针液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1；自动进样器温度为4℃；等度洗脱，流速为0.7mL/min，进样量为5μL，分析时间4min；司替戊醇和司替戊醇-d9预期保留时间约在1.8min
在一个优选地实施例中，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为230℃，接口电压为4.0KV，接口温度为300℃。司替戊醇和司替戊醇-d9的碰撞电压均为9V，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。用于定量分析的离子反应分别为：司替戊醇：m/z 217.1→187.1和司替戊醇-d9：m/z 226.1→196.1。
在一个优选地实施例中，S2中测定方法为内标法，以司替戊醇和内标司替戊醇-d9的峰面积比值带入标准曲线方程计算血浆样品中司替戊醇的浓度，标准曲线方程通过质控样品验证。
在一个优选地实施例中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
A1:取190μL空白血浆置于聚丙烯管中，以工作液的形式分别添加10μL浓度分别为0.100、0.200、1.000、4.000、20.000、40.000、80.000、100.000μg/mL的司替戊醇工作溶液；
A2:混匀后分别取50μL标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本加入50μL的500.000ng/mL的内标司替戊醇-d9溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液；
A3:混匀后每一个样品孔中加入400μL体积比为100:0.2的乙腈：乙酸的混合溶液，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；
A4:取离心后上清液150μL至另一新96孔收集板中，加入150μL水溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，待进样，以上过程均在室温黄光条件下进行；
A5:分别取5μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的司替戊醇和内标司替戊醇-d9的色谱峰面积，并据此得到标准曲线，以用于回算所述血浆样品中的司替戊醇的浓度。
在一个优选地实施例中，所述质控样品的建立包括以下步骤：
B1:配制司替戊醇浓度为0.100、0.300、3.000、30.000、75.000μg/mL的质控样品工作液，取380μL空白血浆置于聚丙烯管中，分别添加质控工作液20μL；
B2:混匀后分别取质控样品50μL加入50μL的500.000ng/mL的内标司替戊醇-d9溶液；
B3:匀后每一个样品孔中加入400μL体积比为100:0.2的乙腈：乙酸的混合溶液，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；
B4:取离心后上清液150μL至另一新96孔收集板中，加入150μL水溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，待进样，以上过程均在室温黄光条件下进行；
B5:分别取5μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测质控样品中的司替戊醇和内标司替戊醇-d9的色谱峰，并根据标准曲线回算出质控样品测定浓度。
本发明技术方案的有益效果是：
(1)使用同位素内标，保证待测物与内标洗脱的一致性；
(2)预处理方法较简便，适用于高通量测定；
(3)专属性强：在本实验所用的色谱条件下，司替戊醇保留时间为1.8min左右，内标司替戊醇-d9保留时间在1.8min左右。司替戊醇和内标司替戊醇-d9的峰形良好，无杂峰明显干扰测定，基线平稳；
(4)本发明方法快速、准确、特异性强、灵敏度低，为司替戊醇的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为5.000～5000.000ng/mL。
附图说明
图1为人血浆中司替戊醇的LC-MS/MS检测方法中司替戊醇的产物离子扫描质谱图；
图2为人血浆中司替戊醇的LC-MS/MS检测方法中司替戊醇-d9的产物离子扫描质谱图；
图3为人空白血浆的LC-MS/MS图；
图4为人空白血浆加入司替戊醇和司替戊醇-d9的LC-MS/MS图；
图5为LC-MS/MS法测得的司替戊醇在人血浆中的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例是为了示例和描述方便起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
本发明技术方案提供一种液质联用测定血浆中司替戊醇的方法，具体如下：
一、实验材料与分析设备
司替戊醇钙(分析物)：AOzeal Certified Standards或相同、更高等级的标准品
司替戊醇-d9钠盐(内标)：TLC Pharmaceutical Standards或相同、更高等级的标准品
使用试剂见下表1：
表1试剂明细
注：可使用相同级别或更高级别的试剂。
使用分析设备见下表2：
表2使用设备明细
二、液质条件
1、液相色谱条件
色谱柱：Welch Ultimate XB-C184.6×50mm 5μm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：纯乙腈；洗针液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1；自动进样器温度为4℃；等度洗脱，流速为0.7mL/min，进样量为5μL，分析时间4min；司替戊醇和司替戊醇-d9预期保留时间约在1.8min。具体的梯度洗脱程序见表3；
表3梯度洗脱程序
表3梯度洗脱程序
2、质谱条件
离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为230℃，接口电压为4.0KV，接口温度为300℃。司替戊醇和司替戊醇-d9的碰撞电压均为9V，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。用于定量分析的离子反应分别为：司替戊醇：m/z 217.1→187.1和司替戊醇-d9：m/z226.1→196.1。
三、实验过程
1、司替戊醇标准曲线工作溶液的配制
精密称取适量的司替戊醇标准品，经质量校正系数校正后，将其溶于甲醇中，得到最终浓度为2.000mg/mL的储备液。再以50％甲醇依次稀释配制司替戊醇工作溶液，具体稀释浓度见下表4：
表4司替戊醇工作溶液配制浓度
SS表示储备液，WS表示工作液。司替戊醇标准曲线工作溶液在棕色玻璃瓶中配制并存储于-20℃条件下，体积可视需要依比例增加或减少。
2、司替戊醇质控样品溶液的配制
司替戊醇工作溶液的配制：精密称取适量的司替戊醇标准品，经质量校正系数校正后，将其溶于甲醇中，得到最终浓度为2.000mg/mL的储备液，再以50％甲醇依次稀释配制司替戊醇工作溶液，具体稀释浓度见下表5：
表5司替戊醇质量控制工作溶液配制浓度
SS表示储备液，WS表示工作液。司替戊醇工作溶液在棕色玻璃瓶中配制并存储于-20℃条件下，体积可视需要依比例增加或减少。
3、司替戊醇-d9内标工作溶液的配制
司替戊醇-d9内标工作溶液的配制：取司替戊醇-d9标准品一支，经质量校正系数校正后，将其溶于甲醇中，得到最终浓度为0.500mg/mL的储备液。再以体积分数为50％的甲醇水溶液溶稀释配制500.000ng/mL内标司替戊醇-d9工作溶液，具体稀释浓度见下表6：
表6司替戊醇-d9工作溶液配制浓度
司替戊醇-d9内标工作溶液在棕色玻璃瓶中配制并存储于-20℃条件下，体积可视需要依比例增加或减少。
4、线性实验
将空白血浆于室温环境解冻；转移190μL的空白血浆8份至聚丙烯管中(每一个标准曲线样本)，分别精密加入不同浓度的司替戊醇工作溶液10μL制备每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。计算司替戊醇峰面积As和内标司替戊醇-d9峰面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)，以峰面积比值Y对血药浓度X作回归计算。以平均比值Y对血药浓度X做回归计算，按该方法测得的司替戊醇的血药浓度的最低定量限为：5.000ng/mL。LC-MS/MS法测得的司替戊醇在人血浆中的标准曲线参数如表7：
表7 LC-MS/MS法测得的司替戊醇在人血浆中的标准曲线(ng/mL)
5、准确度和精密度
将空白血浆于室温环境解冻；转移适当体积的空白血浆至聚丙烯管中，并添加司替戊醇质量控制工作溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(LLOQ、LQC、M1QC、M2QC、HQC)及一条随行标准曲线，按“血浆样品预处理”操作。在至少两天，至少在三个分析批中完成，计算司替戊醇峰面积As和内标司替戊醇-d9峰面积Ai的比值Y，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内与批间精密度，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度，结果见表8。结果表明，司替戊醇血浆样品批内、批间精密度、准确度小于±15％符合要求。
依每一分析批所需，可以选择分装足够的体积至已标示的聚丙烯管中并储存于-70℃条件下。体积可视需要依比例增加或减少。
表8 LC-MS/MS法测定血浆中司替戊醇的批内、批间精度和准确度
6、基质效应
六个不同空白血浆样品分别来源不同健康人体，将六个不同空白血浆样品于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆对司替戊醇分析物及内标司替戊醇-d9的干扰。其内标归一化的基质因子CV％均小于等于4.8％。
表9六个不同来源空白健康人体血浆的基质效应
注：当“无显著峰值可以被积分(或没有峰)”或“峰面积的保留时间不符合样本中分析物或内标物的保留时间”，该区域峰面积认为是零。
从表9可以看出，不同人体的空白血浆对司替戊醇的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于检测不同人体血浆中的司替戊醇浓度。
7、稀释可靠性
考察样品稀释2倍可靠性的样品制备方法：取浓度为2.000mg/mL的司替戊醇储备液，以50％甲醇为稀释剂配制司替戊醇浓度为150000.000ng/mL的工作溶液。
将空白血浆于室温环境解冻，转移380μL的空白血浆至聚丙烯管中，并添加20μL上述工作溶液制备含药血浆稀释质控样品(浓度为7500.000ng/mL)，涡旋混匀，制成高于定量上限的样品，随后取50μL该样品于新聚丙烯管中，加50μL空白血浆稀释2倍，得到稀释2倍样品(浓度为3750.000ng/mL)。然后按“血浆样品预处理”操作，平行处理6次。结果见表10。准确度偏差为-5.2％～-2.0％，说明稀释可靠性满足接受标准。
表10稀释可靠性考察结果
8、回收率
提取回收率是指通过比较处理过的加标样品中待测物/内标响应和处理过的空白基质中加入待测物/内标的响应值来确定。配制LQC、M2QC、HQC 3个浓度水平，每个浓度水平6个重复的样品。接受标准为每个浓度水平的样品的待测物和所有浓度水平的内标：正常提取样品的峰面积、提取基质后样品的峰面积、各浓度水平的样品的回收率的CV％在1.3％～4.0％。司替戊醇和司替戊醇-d9均满足接受标准，结果见表11和表12。
表11待测物提取回收率
表12内标回收率
9、稳定性
(1)冻融稳定性
样品制备方法与质控样品的配制相同，配制结束后分别放置于-70℃冰箱或-20℃冰箱进行存储，再取出于室温条件下放置融解，各冻融5次，每组平行6份，然后按“血浆样品预处理”操作，结果见表13和表14。
高/低浓度样品在-70℃下冻融5次的条件下测量浓度与标示值的偏差在-9.9％～-2.5％范围内，高/低浓度样品在-20℃下冻融5次的条件下测量浓度与标示值的偏差在-6.7％～-2.5％范围内，说明样品在-70℃或-20℃冰箱中冻融处理5次是稳定的。
表13 -70℃与室温间冻融5次的稳定性考察结果
表14 -20℃与室温间冻融5次的稳定性考察结果
(2)长期稳定性
样品制备方法与质控样品的配制相同，配制结束后分别放置于-70℃冰箱进行存储80天后，再取出于室温条件下放置融解，每组平行6份，然后按“血浆样品预处理”操作，结果见表15。
高/低浓度样品在-70℃下存储80天后，测量浓度与标示值的准确度偏差在-6.5％～3.1％范围内，说明样品在-70℃冰箱中存储80天是稳定的。
表15 -70℃长期存储稳定性考察结果
10、人血浆样品检测
将室温下解冻的样品或新配制的样品，涡旋混匀。在96孔板的孔中加入50μL样品(标准曲线，质控样品，系统适用性样品或待测生物样品，对于双空白样品或者零点样品，加入50μL的空白基质样品)；对于双空白样品或ULOQ Without IS样品，加入50μL 50％甲醇溶液，对于其他样品加入50μL内标工作液(500.000ng/mL)，混匀后每一个样品孔中加入400μL体积比为100:0.2的乙腈：乙酸的混合溶液，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液150μL至另一新96孔收集板中，加入150μL水溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，待进样。以上过程均在室温黄光条件下进行。
综上所述，本发明提供的血浆中司替戊醇浓度的测定方法，采用简单的蛋白沉淀处理，适用于常规测定；由上述分析可知，在本实验所采用的色谱条件下，司替戊醇保留时间为1.8min左右，内标司替戊醇-d9保留时间在1.8min左右，司替戊醇和内标司替戊醇-d9的峰形良好，无明显杂峰干扰测定，基线平稳。本方法的血浆标准曲线线性范围为5.000ng/mL～5000.000ng/mL，批内和批间精密度CV％均小于±15％；本方法具有较高的灵敏性、特异性、稳定性好、方便可控能准确测定血浆中的司替戊醇的浓度；同时，本发明方法准确、重现性好，为司替戊醇的血药浓度测定提供依据。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。本发明中未具体描述和解释说明的结构、装置以及操作方法，如无特别说明和限定，均按照本领域的常规手段进行实施。
Claims (4)
1.一种液质联用测定血浆中司替戊醇的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，包括以下步骤：
S1:血浆样品预处理：以K2EDTA为抗凝剂，以司替戊醇-d9为内标；在96孔板的孔中加入50μL样品，加入50μL浓度为500.000ng/mL的司替戊醇-d9内标工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入400 μL体积比为100:0.2的乙腈：乙酸的混合溶液，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液150μL至另一新96孔收集板中，加入150μL水溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，待进样；以上过程均在室温黄光条件下进行；
S2:试样测定：取5μL测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的司替戊醇和内标司替戊醇-d9的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的司替戊醇浓度；
液相色谱条件为：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18，4.6×50mm，5μm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：纯乙腈；洗针液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1；自动进样器温度为4℃；等度洗脱，流速为0.7mL/min，进样量为5μL，分析时间4 min；司替戊醇和司替戊醇-d9预期保留时间约在1.8min；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为230℃，接口电压为4.0 KV，接口温度为300℃，司替戊醇和司替戊醇-d9的碰撞电压均为9V，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测，用于定量分析的离子反应分别为：司替戊醇：m/z 217.1→187.1和司替戊醇-d9：m/z 226.1→196.1。
2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中司替戊醇的方法，其特征在于，S2中测定方法为内标法，以司替戊醇和内标司替戊醇-d9的峰面积比值带入标准曲线方程计算血浆样品中司替戊醇的浓度，标准曲线方程通过质控样品验证。
3.根据权利要求2所述的一种液质联用测定血浆中司替戊醇的方法，其特征在于，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
A1:取190μL空白血浆置于聚丙烯管中，以工作液的形式分别添加10μL浓度分别为0.100、0.200、1.000、4.000、20.000、40.000、80.000、100.000μg/mL的司替戊醇工作溶液；
A2:A1中各组样液混匀后得到标样1-8，分别取50μL标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本加入50μL的500.000ng/mL的内标司替戊醇-d9溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50%的甲醇水溶液；
A3:混匀后每一个样品孔中加入400 μL体积比为100:0.2的乙腈：乙酸的混合溶液，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；
A4:取离心后上清液150μL至另一新96孔收集板中，加入150μL水溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，待进样，以上过程均在室温黄光条件下进行；
A5:分别取5μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的司替戊醇和内标司替戊醇-d9的色谱峰面积，并据此得到标准曲线，以用于回算所述血浆样品中的司替戊醇的浓度。
4.根据权利要求3所述的一种液质联用测定血浆中司替戊醇的方法，其特征在于，所述质控样品的建立包括以下步骤：
B1:配制司替戊醇浓度为0.100、0.300、3.000、30.000、75.000μg/mL的质控样品工作液，取380μL空白血浆置于聚丙烯管中，分别添加质控工作液20μL；
B2:混匀后分别取质控样品50μL加入50μL的500.000ng/mL的内标司替戊醇-d9溶液；
B3:匀后每一个样品孔中加入400 μL体积比为100:0.2的乙腈：乙酸的混合溶液，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；
B4:取离心后上清液150μL至另一新96孔收集板中，加入150μL水溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，待进样，以上过程均在室温黄光条件下进行；
B5:分别取5μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测质控样品中的司替戊醇和内标司替戊醇-d9的色谱峰，并根据标准曲线回算出质控样品测定浓度。
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