CN113109493A - 一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，该方法采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的混合有机溶剂进行蛋白沉淀，离心后进行上清液的稀释，预处理后，取适量测试样品注入高效液相色谱‑串联质谱仪中，测试样品中的利福平和内标利福平‑d3的色谱峰，并计算所述血浆样品中的利福平的浓度。本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为利福平的血药浓度测定提供依据；并且本发明预处理方法简便，适用于常规测定。

Description

一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法

技术领域

本发明涉及血浆中利福平测定技术领域，尤其涉及是一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法。

背景技术

利福平是一种所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用，对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有疗效。为红色或暗红色的结晶状粉末，不溶于水。一般为胶囊或者片剂口服药，与其他抗结核药合用起协同作用，并延缓耐药菌株产生。主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染。因此，利福平制剂的药用经济性高，具有广阔的市场前景。人体服用利福平后，由于药物的相互作用，关注人体血浆中利福平浓度是非常有必要的。

然而，目前关于血浆中利福平的高效液相质谱检测方法未见报道，现有的利福平检测方法并不能满足其检测需求。因此建立一种稳定、可靠、准确、快速的血浆中利福平测定方法具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提出的一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法可提高血浆中利福平检测的速度、精度和灵敏度。该方法血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：

S1，血浆样品预处理：

以K2-EDTA为抗凝剂，以利福平-d3为内标；于96深孔板中精密加入50μL的血浆样品，加入50μL的1μg/mL的内标利福平-d3溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合；于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂(混合有机溶剂为甲醇)的96深孔板中；水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀；于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作。

S2，液相色谱条件：

WelchΜltimate XB-C18，5μm，柱规格为2.1x 100mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈；洗液：乙腈/水/甲酸的体积百分比为80/20/0.1；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为5μL，分析时间4.0min。

进一步地，所述梯度洗脱选用二元高压梯度洗脱，所述二元高压梯度洗脱程序为：

S3，质谱条件：

离子源为电喷雾离子源，接口电压为4KV，接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，雾化气流量为3L/min，干燥气流量为10L/min，加热气流量为10L/min，去簇电压分别为-18eV的利福平和-27eV的利福平-d3；Q1 Pre偏差分别为-24V的利福平和-24V的利福平-d3；Q3 Pre偏差分别为-40V的利福平和-28V的利福平-d3；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。

S4，高效液相色谱-串联质谱仪测定：

取适量测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，测试样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

其中，用于定量分析的离子反应分别为：m/z 823.3→791.30，其为利福平；m/z826.10→402.10，其为利福平-d3。

进一步地，所述步骤S4中，采用内标法，以利福平和内标利福平-d3的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

更进一步地，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：

取190μL空白血浆10份置于聚丙烯管中，以贮备液的形式分别添加10μL浓度分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、4.0μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、60μg/mL的利福平工作溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本中，分别添加50μL体积分数为50％的甲醇水溶液至双空白样本中，混匀后分别向标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本、零浓度样本中加入50μL的1μg/μL的内标利福平-d3溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入200μL甲醇于96深孔板中，涡旋混合，于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀，于4℃以4200rp m离心10min后分别作为10份标准样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作。分别取5μL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

本发明的有益效果：1、本发明预处理方法简便，两步有机溶剂萃取，适用于常规测定；2、本发明的方法中血浆最低定量限为10ng/mL，能准确测定血浆中利福平的浓度，灵敏度高，特异性强；3、本发明具有快速、准确、灵敏度高、操作简便优点，为利福平的血药浓度测定提供依据；4、本发明的血浆标准曲线线性范围为10～3000ng/mL，批内和批间精密度CV％均小于±15％。

附图说明

图1为LC-MS/MS法测得的利福平在人血浆中的标准曲线图；

图2为人空白血浆中的LC-MS/MS图；

图3为人空白血浆加入利福平和利福平-d3的LC-MS/MS图；

图4为健康受试者口服利福平药物后血浆样品再加入内标利福平-d3的LC-MS/MS图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

实施例1：

一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，该方法血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：

S1，血浆样品预处理：

以K2-EDTA为抗凝剂，以利福平-d3为内标；于96深孔板中精密加入50μL的血浆样品，加入50μL的1μg/mL的内标利福平-d3溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合；于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂(混合有机溶剂为甲醇)的96深孔板中；水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀；于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作。

S2，液相色谱条件：

WelchΜltimate XB-C18，5μm，柱规格为2.1x 100mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈；洗液：乙腈/水/甲酸的体积百分比为80/20/0.1；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为5μL，分析时间4.0min。

进一步地，所述梯度洗脱选用二元高压梯度洗脱，所述二元高压梯度洗脱程序为：

S3，质谱条件：

离子源为电喷雾离子源，接口电压为4KV，接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，雾化气流量为3L/min，干燥气流量为10L/min，加热气流量为10L/min，去簇电压分别为-18eV的利福平和-27eV的利福平-d3；Q1 Pre偏差分别为-24V的利福平和-24V的利福平-d3；Q3 Pre偏差分别为-40V的利福平和-28V的利福平-d3；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。

S4，高效液相色谱-串联质谱仪测定：

取适量测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，测试样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

其中，用于定量分析的离子反应分别为：m/z 823.3→791.30，其为利福平；m/z826.10→402.10，其为利福平-d3。

进一步地，所述步骤S4中，采用内标法，以利福平和内标利福平-d3的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

更进一步地，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：

取190μL空白血浆10份置于聚丙烯管中，以贮备液的形式分别添加10μL浓度分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、4.0μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、60μg/mL的利福平工作溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本中，分别添加50μL体积分数为50％的甲醇水溶液至双空白样本中，混匀后分别向标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本、零浓度样本中加入50μL的1μg/μL的内标利福平-d3溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入200μL甲醇于96深孔板中，涡旋混合，于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀，于4℃以4200rp m离心10min后分别作为10份标准样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作。分别取5μL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

实施例2：

本实施例，选用人类K2-EDTA血浆为例；

一、实验材料与分析设备

利福平(分析物)：中国食品药品检定研究院或相同、更高等级的标准品；

利福平-d3(内标)：Toronto Research Chemicals或相同、更高等级的标准品。

使用试剂见下表1：

表1试剂明细

使用分析设备见下表2：

表2使用设备明细

二、液质条件

1、液相色谱条件

色谱柱：WelchΜltimate XB-C18，5μm，柱规格为2.1x 100mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈；洗液：乙腈/水/甲酸的体积百分比为80/20/0.1；自动进样器温度为4℃；二元高压梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为5μL，分析时间4.0min；

表3二元高压梯度洗脱程序

2、质谱条件：

离子源为电喷雾离子源，接口电压为4KV，接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，雾化气流量为3L/min，干燥气流量为10L/min，加热气流量为10L/min，去簇电压分别为-18eV的利福平和-27eV的利福平-d3；Q1 Pre偏差分别为-24V的利福平和-24V的利福平-d3；Q3 Pre偏差分别为-40V的利福平和-28V的利福平-d3；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；

用于定量分析的离子反应分别为：m/z 823.3→791.30，其为利福平；m/z 826.10→402.10，其为利福平-d3。

三、实验过程

1、利福平标准溶液的配制

利福平标准溶液的配制：精密称取利福平6.618mg，经质量校正系数(0.988)校正后，将其溶于6.539mL甲醇中，涡旋混匀，得到最终浓度为1000μg/mL的储备液。再以体积分数为50％的甲醇水溶液溶依次稀释配制利福平标准溶液，具体稀释浓度见下表4：

表4利福平标准溶液配制浓度

利福平标准溶液于不使用时储存于玻璃容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。

其中，最终体积＝来源溶液体积+体积分数为50％的甲醇水溶液体积。

2、利福平-d3内标标准溶液的配制

利福平-d3内标标准溶液的配制：取一支利福平-d3标准品，标示量为1mg，经质量校正系数(0.976)校正后，将其溶于0.976mL甲醇中，涡旋混匀，得到最终浓度为1000μg/mL的储备液。再以体积分数为50％的甲醇水溶液溶稀释配制1μg/mL内标利福平-d3标准溶液，具体稀释浓度见下表5：

表5利福平-d3标准溶液配制浓度

来源溶液(μg/mL)	来源溶液体积(mL)	最终体积(mL)	最终浓度(μg/mL)
				1000	0.1	100	1

其中，最终体积＝来源溶液体积+体积分数为50％的甲醇水溶液体积。

利福平-d3内标标准溶液于不使用时储存于塑料容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。

3、线性实验

将空白血浆于室温环境解冻；转移190μL的空白血浆10份至聚丙烯管中(每一个标准曲线样本)，依下表6所列，分别精密加入不同浓度的利福平标准溶液10μL制备每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。计算利福平峰面积As和内标利福平-d3峰面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)，以峰面积比值Y对血药浓度X作回归计算，结果见图1和表7。以平均比值Y对血药浓度X做回归计算，得回归方程Y＝0.00910644X-0.00648724，相关稀释R的R2＝0.9992122，权重系数W＝1/C2，按该方法测得的利福平的血药浓度的最低定量限为：10ng/mL。

表6利福平标准曲线配制浓度

其中，最终体积＝来源溶液体积+血浆体积

表7 LC-MS/MS法测得的利福平在人血浆中的标准曲线(n＝4)

4、准确度和精密度

将空白血浆于室温环境解冻；转移适当体积的空白血浆至聚丙烯管中，并添加利福平质控溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(LLOQ、LQC、M1QC、M2QC、HQC)及一条随行标准曲线，按“血浆样品预处理”操作，质控样品制备如下表8所示。在至少两天，至少在三个分析批中完成，计算利福平峰面积As和内标利福平-d3峰面积Ai的比值Y，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内与批间精密度，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度，结果见表9。结果表明，利福平血浆样品批内、批间精密度、准确度小于±15％符合要求。

表8质控样品配制浓度

其中，最终体积＝来源溶液体积+血浆体积

依每一分析批所需，可以选择分装足够的体积至已标示的聚丙烯管中并储存于理论温度-80℃。体积可视需要依比例增加或减少。

表9 LC-MS/MS法测定血浆中利福平的批内、批间精度和准确度

5、干扰性

六个不同空白血浆样品分别来源不同健康人体，将六个不同空白血浆样品于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆对利福平分析物及内标利福平-d3的干扰。

六个不同来源空白健康人体血浆样本制备分析后，在符合利福平保留时间处的干扰峰响应均低于对应基质的定量下限样本的利福平响应的20.0％。在符合内标利福平-d3保留时间处的干扰峰响应均低于对应基质的定量下限样本的内标利福平-d3响应的5.0％。结果表明该分析方法对利福平的分析具有专属性和选择性。

表10六个不同来源空白健康人体血浆的干扰性数据对比表

其中，当“无显著峰值可以被积分(或没有峰)”或“峰面积的保留时间不符合样本中分析物或内标物的保留时间”，该区域峰面积认为是零。

从表10可以看出，不同人体的空白血浆对利福平的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于检测不同人体血浆中的利福平浓度。

6、人血浆样品检测

(1)取没有给予过利福平的人空白血浆，于96深孔板中精密加入50μL的血浆样品，加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合，于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀，于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作；取5μL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，结果如图2所示。

(2)取没有给予过利福平的人空白血浆，于96深孔板中精密加入50μL的STD01的标准曲线血浆样品，加入50μL的1μg/mL的内标利福平-d3工作溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合，于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀，于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作；取5μL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，结果如图3所示。

(3)采集健康受试者口服利福平药物后的血浆，于96深孔板中精密加入50μL的采集的人体血浆样品，加入50μL的1μg/mL的内标利福平-d3工作溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合，于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀，于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作；取5μL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，结果如图4所示。

综上所述，本发明提供了一种预处理方法简便的血浆中利福平浓度的测定方法，采用两步有机溶液处理，适用于常规测定；由上述分析可知，在本实验所采用的色谱条件下，利福平保留时间为1.940min左右，内标利福平-d3保留时间在1.940min左右，利福平和内标利福平-d3的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的利福平的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限为10ng/mL；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为利福平的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为10～3000μg/mL，批内和批间精密度CV％均小于±15％。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。

Claims (4)

1.一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1，血浆样品预处理：

以K2-EDTA为抗凝剂，以利福平-d3为内标；于96深孔板中精密加入50μL的血浆样品，加入50μL的1μg/mL的内标利福平-d3溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合；于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中；水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀；于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作；

S2，液相色谱条件：

Welch Μltimate XB-C18，5μm，柱规格为2.1x100mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈；洗液：乙腈/水/甲酸的体积百分比为80/20/0.1；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为5μL，分析时间4.0min；

S3，质谱条件：

离子源为电喷雾离子源，接口电压为4KV，接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，雾化气流量为3L/min，干燥气流量为10L/min，加热气流量为10L/min，去簇电压分别为-18eV的利福平和-27eV的利福平-d3；Q1 Pre偏差分别为-24V的利福平和-24V的利福平-d3；Q3 Pre偏差分别为-40V的利福平和-28V的利福平-d3；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；

S4，高效液相色谱-串联质谱仪测定：

取适量测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，测试样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并计算所述血浆样品中的利福平的浓度；

其中，用于定量分析的离子反应分别为：m/z 823.3→791.30，其为利福平；m/z 826.10→402.10，其为利福平-d3。

2.根据权利要求1所述的高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：进一步地，所述梯度洗脱选用二元高压梯度洗脱，所述二元高压梯度洗脱程序为：

3.根据权利要求1所述的高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：所述步骤S4中，采用内标法，以利福平和内标利福平-d3的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

4.根据权利要求3所述的高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：取190μL空白血浆10份置于聚丙烯管中，以贮备液的形式分别添加10μL浓度分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、4.0μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、60μg/mL的利福平工作溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本中，分别添加50μL体积分数为50％的甲醇水溶液至双空白样本中，混匀后分别向标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本、零浓度样本中加入50μL的1μg/μL的内标利福平-d3溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入200μL甲醇于96深孔板中，涡旋混合，于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀，于4℃以4200rpm离心10min后分别作为10份标准样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作；分别取适量标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

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