CN111830153A - 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的方法 - Google Patents

一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2浓度的方法，属于药物检测技术领域。该方法是取预处理的血清，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，根据已经建立的校准曲线，即可计算出多粘菌素B1和多粘菌素B2的含量。本发明的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0分钟之内完成血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物的定量分析，为临床上多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度监测提供简单快速的检测方法。

Description

一种检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2浓度的方法
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度的方法。
背景技术
多粘菌素B(polymyxin B)是一种脂肽类抗生素，其中多粘菌素B1(polymyxin B1，PMB1)和多粘菌素B2(polymyxin B2，PMB2)是其两个主要成分，对绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌及嗜血杆菌等多种阴性菌有抑制作用。对其他抗生素耐药的菌株，该品也敏感。但由于其严重的肾毒性及神经阻滞作用，仅用于烧伤合并败血症时短期抢救用，或供局部喷雾冲洗外用。然而，目前的给药方案大多是经验性的，缺乏快速准确的方法来测定人体体液中的多粘菌素B，阻碍了药物的临床药理特性。所以，需要对病人的需要浓度进行监测，从而保证疗效、降低毒副作用、实现个性化给药和治疗。
目前也有针对多粘菌素B1和B2定量检测的方法报道，比如文章“HighPerformance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry Assay for Polymyxin B1and B2 in Human Plasma”报道了一种基于液相色谱质谱联用法测定多粘菌素B1和B2的含量，但该方法也有一定的缺陷，比如该方法前处理使用固相萃取法，样本用量大、前处理较复杂且成本高；同时，文章中提到的液相方法梯度达12分钟，检测时间过长，效率低；再者，该方法检测的线性范围为100-2500ng/mL，线性范围窄，不适用于临床分析。再比如，文章“Simultaneous quantitation of polymyxin B1,polymyxin B2 andpolymyxin B1-1 inhuman plasma and treated human urine usingsolid phase extraction and liquidchromatography–tandem massspectrometry”报道了一种基于液质谱联用测定多粘菌素B1和B2的含量，不过也有一定的缺陷，比如该方法前处理繁琐，需要涡旋超声沉淀蛋白，需要离心浓缩后检测，一针样本检测时间长达20分钟，不适用于临床大量样本的检测。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：
一种检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度的方法，取预处理的血清，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，根据已经建立的校准曲线，即可计算出多粘菌素B1和多粘菌素B2的含量；
多粘菌素B1和多粘菌素B2所采用的内标物为多粘菌素E；
所述预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液上机；
所述校准曲线是以标准品与内标物的浓度比为X轴、标准品与内标物的峰面积比为Y轴。
进一步地，所述超高效液相色谱条件如下：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Phenomenex Kintex C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为85～100:25～0，具体梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85～100:25～0匀速渐变至70:30，在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98，在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为5.0分钟；
流速为0.2～0.4mL/min，柱温为40～60℃，进样体积为0.2～2μL。
进一步地，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相A和流动相B的初始比例为99:1；所述流速为0.3mL/min，柱温为50℃，进样体积为1μL。
进一步地，所述质谱条件如下：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV ESI+；干燥气温度为250℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度325℃，鞘气流速11L/min。
进一步地，所述含内标的蛋白沉淀剂是将内标溶液加至蛋白沉淀剂后得到；
内标溶液为多粘菌素E 40000ng/mL的甲醇水溶液；
蛋白沉淀剂为含甲酸或乙酸的甲醇与乙腈混合溶液，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈体积比为1～3:1～4，甲酸或乙酸的含量为0.01％～0.5％。
进一步地，所述蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为2:1，甲酸的含量为0.1％。
进一步地，所述预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标工作的蛋白沉淀剂，振荡3～10min，在12000～15000r/min、4～20℃离心4～10min后，取上清进样。
进一步地，所述校准曲线所采用的标准品浓度如下：
多粘菌素B1的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL；
多粘菌素B2的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL。
采用本发明的方法同时检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2的浓度，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0分钟之内完成血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2的定量分析，为临床上多粘菌素B1和多粘菌素B2浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为多粘菌素B1和多粘菌素B2标准品的提取离子流谱图；
图2为血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2的提取离子流谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度的方法，血清样本通过预处理后，经振荡、离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的多粘菌素B1和多粘菌素B2浓度。具体地：先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算多粘菌素B1和多粘菌素B2的含量。
所述多粘菌素B1和多粘菌素B2对应的内标物为：多粘菌素E。
具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为85～100:25～0；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85～100:25～0匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为5.0分钟；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；干燥气温度为250℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度325℃，鞘气流速11L/min；同时监测了各目标物及其对应内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5.0分钟之内完成多粘菌素B1和多粘菌素B2的分离和检测。在一种优选方案中，流动相A为0.05％～0.2％甲酸水溶液，在不影响本发明效果的情况下，优选地，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和0.01％～0.2％甲酸水溶液作为流动相，色谱柱型号为Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强，准确度和精密度基本满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用多粘菌素E作为内标，内标和待测物具有相似结构和相同化学性质，测定血清中的多粘菌素B1和多粘菌素B2时的重现性、准确度均较好。
在一种优选方案中，流动相A和流动相B的初始比例为85～100:25～0，进一步优选地，流动相A和流动相B的初始比例为99:1。
在一种优选方案中，流速为0.2～0.4mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为40～60℃，优选为50℃。
在一种方案中，进样体积为0.2～10μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的多粘菌素B1和多粘菌素B2时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为99:1；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85～100:25～0匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为5.0分钟；梯度洗脱方式具体见表1；流速为0.3mL/min，柱温为50℃，进样体积为1μL。
表1流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B Curve
0.0 0.3 99 1 -
1.0 0.3 70 30 6
2.5 0.3 2 98 6
3.0 0.3 2 98 6
5.0 0.3 99 1 1
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；干燥气温度为250℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度325℃，鞘气流速11L/min；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应内标，各个目标物的质谱参数见表3。
表2质谱源参数
项目 参数
毛细管电压(kV) 3.0
干燥气温度(℃) 250
雾化器压力(psi) 45
鞘气温度(℃) 325
鞘气流速(L/min) 11
表3多粘菌素B1和多粘菌素B2检测质谱参数
化合物 母离子 子离子 去簇电压(V) 碰撞电压(V) ESI(+/-)
PMB1 402.1 101.1 100 18 +
PMB2 397.5 391.5 100 5 +
PME 386.1 380.1 105 5 +
本发明提及的血清为人或动物的血清。
本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心取上清液上机，其中含内标的蛋白沉淀剂是由内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成。所述蛋白沉淀剂为含甲酸或乙酸的甲醇与乙腈的混合溶液；优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈体积比为1～3:1～4，甲酸或乙酸的含量为0.01％～0.5％；更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为2:1，甲酸的含量为0.1％。
在一种优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标工作的蛋白沉淀剂，振荡3～10min，在12000～15000r/min，4～20℃离心4～10min后，取上清到进样瓶中，待进样；所述蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为2:1，甲酸的含量为0.1％。
在一种更优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为2:1，含0.1％甲酸)，振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
在一种方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇水配制如下内标母液：多粘菌素E 20mg/mL；
移取内标母液：多粘菌素E 2μL；再加入至998μL甲醇水中得到1mL内标溶液；
取100μL上述内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，上述蛋白沉淀剂为含甲酸的甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1～3:1，含0.01％～0.2％甲酸。更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为2:1，含0.1％甲酸。
在一种优选方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇水配制如下内标母液：多粘菌素E 20mg/mL；
移取内标母液：多粘菌素E 2μL；再加入至998μL甲醇水中得到1mL内标溶液。其中：多粘菌素E(PME)40000ng/mL。
取200μL上述内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈为2:1，含0.1％甲酸)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：多粘菌素E(PME)400ng/mL。
在一种更优选方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
分别以50％甲醇水配制粘杆菌素内标母液，再加入至900μL 50％甲醇水中，混匀得到1mL内标溶液，取100μL上述内标溶液加入至19.8mL含甲酸的甲醇与乙腈混合溶液(甲醇与乙腈的体积比为2:1，含0.1％甲酸)中，即得含内标的蛋白沉淀剂，浓度参下表4。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。
表4含内标的蛋白沉淀剂配制
Figure BDA0002583337760000061
在一种方案中，本发明提及的标准品按照如下方法制备：
配制如下浓度的标准品母液：多粘菌素B 50mg/mL；
移取多粘菌素B 8μL；再加入至992μL 50％甲醇水中得到1mL标准储备溶液。在标准品储备液中包含：多粘菌素B1(PMB1)400μg/mL、多粘菌素B2(PMB2)400μg/mL。
将上述标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
多粘菌素B1的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL；
多粘菌素B2的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL。
在一种优选方案中，空白血清基质为不含目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
移取多粘菌素B的标准品母液，再加入至992μL 50％甲醇水中得到1mL标准储备溶液，浓度参下表5。
表5标准品储备溶液
Figure BDA0002583337760000071
本发明将标准品储备液以空白血清基质(不含目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL标准储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取50μL第一高值浓度点用50μL空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用5倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。
本发明采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存，具体过程如下表6(单位：ng/mL)。
表6标曲配制
标曲 移取溶液(μL) 空白血清基质(μL) PMB1 PMB2
S7 混合标准储备溶液10 190 20000 20000
S6 S7 50 50 10000 10000
S5 S7 20 180 2000 2000
S4 S6 20 180 1000 1000
S3 S5 20 180 200 200
S2 S4 20 180 100 100
S1 S3 25 125 40 40
七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为2:1，含0.1％甲酸),振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1uL。
本发明还包括制备质控品，其中，质控品为含有多粘菌素B1和多粘菌素B2的空白血清，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
QC(L)为上述标准储备溶液以空白血清基质稀释至5000倍。
QC(M)为上述标准储备溶液以空白血清基质稀释至500倍。
QC(H)为上述标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
优选地，空白血清基质为不含目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述标准储备溶液以不含目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表7所示。
表7质控品对应浓度(单位:ng/mL)
化合物ID 化合物 QC(L) QC(M) QC(H)
1 PMB1 80 800 8000
2 PMB2 80 800 8000
QC(L)中包含：多粘菌素B1(PMB1)80ng/mL和多粘菌素B2(PMB2)80ng/mL。
QC(M)中包含：多粘菌素B1(PMB1)800ng/mL和多粘菌素B2(PMB2)800ng/mL。
QC(H)中包含：多粘菌素B1(PMB1)8000ng/mL和多粘菌素B2(PMB2)8000ng/mL。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于南京鼓楼医院2019年10月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Qlife Lab 9000plus三重四级杆质谱仪(品生医学)；Qlife Lab 9000超高效液相色谱系统(配G7167A自动进样器，品生医学)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；色谱柱型号：Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表8。
表8标准品和内标
序号 中文名称 厂家
1 多粘菌素B TRC
2 多粘菌素E TRC
(4)质控品：含有多粘菌素B1和多粘菌素B2的空白血清，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表7所示。
二、液质条件
1.色谱条件：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：PhenomenexKinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为50℃，进样体积为1μL。
2.质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；干燥气温度为250℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度325℃，鞘气流速11L/min；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应内标，各个目标物的质谱参数见表3。
三、实验过程
1.标准品配制：
将多粘菌素B配制成如下浓度的标准品母液：多粘菌素B 50mg/mL；
移取标准品母液：多粘菌素B 8μL；再加入至992μL甲醇水中得到1mL标准储备溶液。详见表5。
将上述标准储备溶液以空白血清基质(不含目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，详见表6，所述校准品溶液的七个浓度点为：
多粘菌素B1的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL；
多粘菌素B2的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL。
2.含内标的蛋白沉淀剂配制
以50％甲醇水配制如下内标母液：多粘菌素E 20mg/mL；
移取内标母液：多粘菌素E 2μL；再加入至998μL甲醇水中得到1mL内标溶液。其中：多粘菌素E(PME)40000ng/mL。
取200μL上述内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈为2:1，含0.1％甲酸)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：多粘菌素E(PME)400ng/mL。
3.质控品配制：
取上述标准储备溶液以不含目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表7所示。
QC(L)中包含：多粘菌素B1(PMB1)80ng/mL和多粘菌素B2(PMB2)80ng/mL。
QC(M)中包含：多粘菌素B1(PMB1)800ng/mL和多粘菌素B2(PMB2)800ng/mL。
QC(H)中包含：多粘菌素B1(PMB1)8000ng/mL和多粘菌素B2(PMB2)8000ng/mL。
4.样品处理
(1)标准品处理：七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为2:1，含0.1％甲酸),振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
(2)血清样品前处理：取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为2:1，含0.1％甲酸),振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
(3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：多粘菌素B1和多粘菌素B2的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为多粘菌素B1和多粘菌素B2标准品提取离子流谱图，图2为血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2提取离子流谱图。
2.校准曲线：采用内标定量法，利用MS quantitative analysis软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。多粘菌素B1和多粘菌素B2在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。
表9多粘菌素B1和多粘菌素B2线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002583337760000101
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，多粘菌素B1和多粘菌素B2的加标回收率在92.85％-102.79％之间，5次重复试验的RSD在1.30％-6.02％范围，统计结果见表10。
表10多粘菌素B1和多粘菌素B2添加回收率结果
Figure BDA0002583337760000111
4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度多粘菌素B1和多粘菌素B2标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以内标法定量测定多粘菌素B1和多粘菌素B2的浓度，批内精密度为2.11％～8.95％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.25％～10.40％，结果见表11。
表11批内及批间精密度试验结果
Figure BDA0002583337760000112
Figure BDA0002583337760000121
本发明采用ID-HPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的多粘菌素B1和多粘菌素B2的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，多粘菌素B1和多粘菌素B2的加标回收率为加标回收率在92.85％-102.79％之间，5次重复试验的RSD在1.30％-6.02％范围，准确度良好。
方法的重现性结果表明，多粘菌素B1和多粘菌素B2的批内精密度为2.11％～8.95％，批间精密度为2.25％～10.40％，方法的重现性良好。且建立的血清样品前处理过程非常简单，血清用量仅50μL。
总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.0分钟之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度的定量分析，为临床上多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物浓度的方法，其特征在于：取预处理的血清，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，根据已经建立的校准曲线，即可计算出多粘菌素B1和多粘菌素B2的含量；
多粘菌素B1和多粘菌素B2所采用的内标物为多粘菌素E；
所述预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液上机；
所述校准曲线是以标准品与内标物的浓度比为X轴、标准品与内标物的峰面积比为Y轴。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱条件如下：
流动相A：0.01%~0.2%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Phenomenex Kintex C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为85~100:25~0，具体梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85~100:25~0匀速渐变至70:30，在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98，在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为5.0分钟；
流速为0.2~0.4 mL/min，柱温为40~60℃，进样体积为0.2~2 µL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相A和流动相B的初始比例为99:1；所述流速为0.3 mL/min，柱温为50℃，进样体积为1 µL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述质谱条件如下：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV ESI+；干燥气温度为250℃；雾化气压力为45 psi，鞘气温度325℃，鞘气流速11L/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含内标的蛋白沉淀剂是将内标溶液加至蛋白沉淀剂后得到；
内标溶液为多粘菌素E 40000ng/mL的甲醇水溶液；
蛋白沉淀剂为含甲酸或乙酸的甲醇与乙腈混合溶液，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈体积比为1~3:1~4，甲酸或乙酸的含量为0.01%~0.5%。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为2:1，甲酸的含量为0.1%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理的血清按照如下方法制备：取50 μL血清于1.5 mL离心管中，向其中加入200 μL含内标工作的蛋白沉淀剂，振荡3~10min，在12000~15000 r/min、4~20℃离心4~10 min后，取上清进样。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述校准曲线所采用的标准品浓度如下：
多粘菌素B1的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000 ng/mL、20000 ng/mL；
多粘菌素B2的七个浓度点为依次为：40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000 ng/mL、20000 ng/mL。
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